吳曉楠 馬寧 侯建霞

1.青島市口腔醫(yī)院牙周科 青島 266001；

2.青島市市立醫(yī)院東院區(qū)口腔科 青島 266071；

3.北京大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科 北京 100081

牙周炎是一種慢性炎癥性疾病，可導(dǎo)致牙周支持組織（包括牙齦、牙骨質(zhì)、牙周膜和牙槽骨）發(fā)生進行性破壞，引起牙齒逐漸松動、脫落，進而影響發(fā)音、咀嚼和美觀，是導(dǎo)致成年人失牙的最主要原因。此外，牙周炎還與全身多種疾病具有相關(guān)性，如糖尿病、心血管疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。

牙周治療的最終目標(biāo)是實現(xiàn)牙周組織的修復(fù)和再生，其關(guān)鍵在于使牙周膜纖維一端嵌入牙骨質(zhì)，一端埋入牙槽骨，形成功能性軟硬組織復(fù)合結(jié)構(gòu)。目前，植骨術(shù)、引導(dǎo)性組織/骨組織再生術(shù)、局部使用生長因子等技術(shù)已在臨床中用于牙周缺損的治療并取得一定療效，但上述方法仍存在一些不足，如易形成長結(jié)合上皮、再生硬組織的能力較差、引導(dǎo)性組織再生術(shù)的適應(yīng)證較窄及膜降解時易塌陷等。因此，牙周組織再生不論在生物科學(xué)還是臨床應(yīng)用層面都面臨巨大挑戰(zhàn)。

近年來，干細(xì)胞、組織工程技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用為牙周組織再生提供了新的途徑。然而已有研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，在采用干細(xì)胞移植治療組織缺損的過程中：1）僅有＜1%的干細(xì)胞能夠歸巢并定植于組織缺損區(qū)，持續(xù)促進組織再生；2）干細(xì)胞的旁分泌機制發(fā)揮著比“分化、替代受損細(xì)胞”更為重要的作用。

在組織再生過程中，干細(xì)胞可通過旁分泌機制釋放多種生物活性分子（如趨化因子、生長因子等），構(gòu)建復(fù)雜的局部微環(huán)境，趨化周圍的宿主干/祖細(xì)胞遷徙至損傷部位并增殖、分化，抑制受損細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)，促進血管新生，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能，誘導(dǎo)再生反應(yīng)的發(fā)生[3-4]。外泌體作為干細(xì)胞旁分泌機制的重要產(chǎn)物，在組織損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，本文對外泌體在牙周組織再生領(lǐng)域中的研究進展進行綜述。

1 外泌體生物學(xué)特征

外泌體最初發(fā)現(xiàn)于體外培養(yǎng)的綿羊紅細(xì)胞的上清液中，是直徑40～150 nm的微囊泡，存在于多種細(xì)胞（如干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、上皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等）和體液（如唾液、乳汁、羊水、血清或血漿和尿液等）中，在蔗糖梯度中的沉降系數(shù)為1.10～1.21 g·mL-1。通過差速離心、密度梯度分離、市售試劑盒等方式富集外泌體，并根據(jù)粒徑尺寸、利用特定的生物標(biāo)志物對其進行分離、純化[5-6]。

外泌體具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，膜表面富含鞘磷脂、膽固醇和神經(jīng)酰胺脂筏脂質(zhì)[7]；內(nèi)含豐富的蛋白質(zhì)，包括膜轉(zhuǎn)運因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子（如β-連環(huán)蛋白、Wnt）、細(xì)胞骨架蛋白（如β-肌動蛋白、肌球蛋白和微管蛋白）、在細(xì)胞黏附中發(fā)揮重要作用的跨膜蛋白（如CD9、CD63、CD81和CD82），以及參與蛋白質(zhì)折疊過程的熱休克蛋白[8-9]。其中，Alix、TSG101和CD63等蛋白質(zhì)可作為外泌體的標(biāo)記蛋白，用于外泌體的鑒定[10]。

此外，外泌體還攜帶有大量來源于其分泌細(xì)胞的生物分子，包括蛋白質(zhì)、信使RNA（messenger RNA，mRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA，miR），作為細(xì)胞間通訊的載體，通過轉(zhuǎn)運、內(nèi)吞方式進入靶細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)，改變細(xì)胞命運[11]。外泌體中的生物分子與某些疾病具有一定關(guān)聯(lián)性，可作為相關(guān)疾病的診斷方式。如與健康對照組相比，肺癌患者血漿外泌體中人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase）mRNA的表達(dá)水平顯著升高[12]。Koppers-Lalic等[13]指出，外泌體RNA在細(xì)胞定型、分化和活性調(diào)節(jié)中亦發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2 外泌體生成及分泌機制

外泌體最初由細(xì)胞膜表面發(fā)生內(nèi)吞作用形成內(nèi)吞體，位于內(nèi)吞體細(xì)胞質(zhì)側(cè)的內(nèi)吞體分選復(fù)合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）作為一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，可包裹特異分選的蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)，構(gòu)成含有囊泡的多泡體。而當(dāng)ESCRT耗竭時，則可通過神經(jīng)酰胺、跨膜蛋白等的作用輔助生成多泡體。隨后，多泡體依賴于RAB家族對細(xì)胞內(nèi)囊泡的運輸控制，將囊泡定位于細(xì)胞膜，并在SNARE家族的調(diào)控下促使囊泡膜與細(xì)胞質(zhì)膜融合后，將外泌體分泌至細(xì)胞外[14]。

調(diào)控上述協(xié)同過程的任意關(guān)鍵節(jié)點，即可干預(yù)外泌體的生成和分泌，如利用干擾素1誘導(dǎo)多泡體中ESCRT-1的組分蛋白質(zhì)TSGl01類泛素化，從而促使多泡體轉(zhuǎn)運至溶酶體降解，減少外泌體生成[15]。Song等[16]研究發(fā)現(xiàn)，腎腦表達(dá)蛋白（kidney and brain expressed protein，KIBRA）作為一種支架蛋白可參與囊泡運輸、細(xì)胞遷移等過程，其與外泌體中的Rab27a相互作用，二者穩(wěn)定存在且不被泛素化，從而使多泡體免于被降解。反之，耗盡KIBRA則可導(dǎo)致Rab27a降解增加，繼而抑制外泌體分泌。

分泌至細(xì)胞外的外泌體可將其中的生物活性分子（mRNA、miRNA、蛋白質(zhì)等）轉(zhuǎn)運至靶細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為；同時也可進入生物體液內(nèi)，以遞送至遠(yuǎn)處靶細(xì)胞（類似于經(jīng)典內(nèi)分泌過程），從而參與炎癥、免疫應(yīng)答調(diào)控、血管生成、組織再生、凋亡等多種反應(yīng)進程[6,17]。

3 外泌體誘導(dǎo)骨組織再生和血管新生的研究

牙槽骨是牙周組織的重要組成部分，實現(xiàn)牙槽骨再生是獲得牙周再生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。外泌體作為攜帶多種生物活性分子的重要載體，可通過激活靶細(xì)胞成骨信號通路，誘導(dǎo)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，為牙槽骨的再生奠定基礎(chǔ)。研究[18]顯示，外源性間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell）來源外泌體所遞送的miR-151-5p可被內(nèi)源性間充質(zhì)干細(xì)胞吸收以促其成骨向分化；脂肪干細(xì)胞來源的外泌體可提高人原代成骨細(xì)胞的增殖和成骨活性[19]；成骨細(xì)胞來源外泌體內(nèi)由于攜帶有成骨相關(guān)miRNA和蛋白質(zhì)，可促進間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化[20]。Cui等[21]研究證實，前成骨細(xì)胞MC3T3-E1分泌的外泌體可通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路促進小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化。

盡管目前關(guān)于外泌體直接誘導(dǎo)牙槽骨再生的研究甚少，但聯(lián)合應(yīng)用組織工程技術(shù)將外泌體移植于組織缺損處，實現(xiàn)骨引導(dǎo)、骨誘導(dǎo)和血管新生過程的發(fā)生，從而促使骨組織再生，已得到初步驗證。

Narayanan等[22]研究發(fā)現(xiàn)，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體可顯著上調(diào)靶干細(xì)胞相關(guān)分子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）9、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1的表達(dá)。其中，BMP9可通過有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，且其誘導(dǎo)能力優(yōu)于BMP2；而TGF-β則可通過Smad-Jun氨基末端激酶（Jun NH2-terminal kinase，JNK）途徑協(xié)同增強BMP9的骨化誘導(dǎo)功能[23-24]。此外，該研究組還將負(fù)載有外泌體的膠原膜植入無胸腺裸鼠背部4周后取材，觀察到血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)上調(diào)，且有更多的新生血管和鈣磷結(jié)晶體形成。其中，血管內(nèi)皮生長因子作為一種有絲分裂原，可促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，增加毛細(xì)血管的通透性，從而誘導(dǎo)血管新生。

Zhang等[25]將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體與β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）相復(fù)合并移植于大鼠的顱骨缺損區(qū)，外泌體/β-TCP復(fù)合支架釋放的外泌體可通過激活間充質(zhì)干細(xì)胞的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）信號通路發(fā)揮骨誘導(dǎo)功能；并且與單純β-TCP支架相比，外泌體/β-TCP復(fù)合支架具有更優(yōu)異的成骨活性。Qi等[26]的研究也獲得類似結(jié)果，且觀察到外泌體處理組較未處理對照組有大量的血管生成。Li等[27]制備出負(fù)載有人脂肪干細(xì)胞來源外泌體的聚乳酸-聚羥基乙酸復(fù)合支架，體內(nèi)體外實驗證實該支架通過緩釋外泌體，促進間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和歸巢、增殖和成骨向分化（堿性磷酸酶、RUNX2、骨鈣蛋白等相關(guān)分子表達(dá)上調(diào)），繼而發(fā)揮較強的骨誘導(dǎo)能力，實現(xiàn)缺損骨組織的再生。

綜上所述，在修復(fù)骨缺損過程中，相關(guān)細(xì)胞來源外泌體攜帶的生物活性分子與組織缺損區(qū)周圍細(xì)胞（尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞）相互作用，可誘導(dǎo)其分化為成骨細(xì)胞并進一步增殖。而后成骨細(xì)胞可分泌堿性磷酸酶和鈣鹽結(jié)晶至細(xì)胞外基質(zhì)中，促使基質(zhì)成熟、礦化，并釋放一系列成骨相關(guān)分子（如BMP9、TGFβ1、RUNX2、骨鈣蛋白等）與細(xì)胞外基質(zhì)中的鈣、磷及膠原分子結(jié)合，同時伴隨大量的血管生成以保證充足的血液供應(yīng)，從而實現(xiàn)骨組織乃至牙槽骨的再生。

4 外泌體誘導(dǎo)牙周軟硬組織再生的研究

牙周膜細(xì)胞（periodontal ligament cell）屬異質(zhì)性細(xì)胞群，除大部分成纖維細(xì)胞外，還存在一些能夠表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物（如Stro-1和CD146）的細(xì)胞，可分化為成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞等，具有多向分化潛能，是實現(xiàn)牙周軟硬組織再生的重要基礎(chǔ)[28]。朱斌等[29]提取人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體與人牙周膜干細(xì)胞共培養(yǎng)，體外實驗驗證其可促進牙周膜干細(xì)胞的體外增殖和成骨向分化。費棟棟等[30]研究證實，牙周膜干細(xì)胞分泌的外泌體可能通過攜帶著更多的KAT6A mRNA，介導(dǎo)靶細(xì)胞（牙周膜干細(xì)胞）KAT6A的表達(dá)上調(diào)、影響其組蛋白乙?；?，從而促進靶細(xì)胞的成骨分化。吳金燕等（第13次全國老年口腔醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編，武漢，2018.11）構(gòu)建大鼠牙周缺損模型，通過體內(nèi)實驗證實乳牙牙髓干細(xì)胞來源外泌體可誘導(dǎo)牙槽骨再生及血管生成。

Mohammed等[31]將脂肪干細(xì)胞來源外泌體注入采用結(jié)扎法誘導(dǎo)的大鼠牙周袋內(nèi)，4周后取材觀察。組織學(xué)檢查可見缺損區(qū)形成與健康牙周組織類似的結(jié)構(gòu)（即有序的牙周膜纖維一端附著于牙骨質(zhì)，另一端附著于牙槽骨）。研究者認(rèn)為，脂肪干細(xì)胞和外泌體皆具一定的抗炎及免疫調(diào)節(jié)活性，并可通過促進不同種類細(xì)胞的遷移、分化和增殖以及血管新生，誘導(dǎo)組織的再生。

Chew等[32]將人胚胎干細(xì)胞源性間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體負(fù)載于膠原海綿，并將其置于大鼠牙周缺損處，觀察到牙槽骨和功能性牙周膜纖維的再生。并通過進一步研究證實，外泌體通過CD73介導(dǎo)的腺苷受體活化AKT和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號通路，來促進牙周膜細(xì)胞的遷移和增殖。體外研究發(fā)現(xiàn)，外泌體與牙周膜細(xì)胞相遇后，幾分鐘后即被細(xì)胞迅速吸收，15 min內(nèi)誘發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并可持續(xù)促進與細(xì)胞遷移[胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）-1、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）-2]、存活和抗凋亡（IGF-1、Bcl-2和存活蛋白）、細(xì)胞增殖[IGF-1、FGF-2和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）]以及牙周膜基質(zhì)形成（細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、膠原蛋白和骨膜蛋白）相關(guān)的基因表達(dá)。此外，IGF-1還可促進牙周膜細(xì)胞的成骨向分化，在骨組織的基質(zhì)礦化中發(fā)揮重要作用。而骨膜蛋白作為一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，不僅支持成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的黏附和遷移，還可通過募集牙周膜成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞以形成新骨和新牙周膜附著。

5 外泌體用于組織再生治療的優(yōu)勢與風(fēng)險

在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，應(yīng)用外泌體作為多種生物活性分子載體的“無細(xì)胞再生策略”具有諸多優(yōu)勢，主要包括：1）幾乎不具有細(xì)胞毒性和低免疫原性，體內(nèi)同種異體給藥后免疫排斥的可能性較低，具有廣闊的應(yīng)用范圍[33]；2）可規(guī)避直接進行細(xì)胞移植所存在的栓塞、感染擴散等潛在風(fēng)險，具有一定的生物安全性[34]；3）可制備成方便儲存和臨床應(yīng)用的生物制劑，-20 ℃保存6個月不喪失生物活性[35]。

然而，目前外泌體攜帶各種生物活性分子在細(xì)胞間進行通訊交流的機制尚不明確，無法進行精確調(diào)控，且存在一定風(fēng)險。研究[36-37]發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可通過向鄰近細(xì)胞傳遞相關(guān)miRNA或激活信號通路等方式促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。癌細(xì)胞可利用外泌體向局部微環(huán)境中的正常細(xì)胞釋放信號，促使其癌變[38]；發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞所釋放的外泌體具有更強的誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的能力[39]。

此外，外泌體在體內(nèi)的生物學(xué)分布情況是其是否具有毒性的重要決定因素之一。采用外泌體進行再生治療時，需明確其在體內(nèi)的輸送路徑、劑量、生物學(xué)分布及代謝動力學(xué)特點，方能實現(xiàn)引導(dǎo)外泌體抵達(dá)組織缺損區(qū)發(fā)揮功能、保證其臨床應(yīng)用的安全性。

6 展望

近年來，研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞是通過旁分泌機制釋放外泌體等載體介導(dǎo)細(xì)胞間通訊交流、激活靶細(xì)胞信號通路，以影響微環(huán)境中細(xì)胞的生物學(xué)行為，從而誘導(dǎo)缺損組織的再生。如上所述，單獨或結(jié)合組織工程技術(shù)，采用干細(xì)胞來源的外泌體修復(fù)缺損的牙周組織盡管已取得初步成果并具備一定優(yōu)勢，但仍有許多問題亟待解決。外泌體的提取和純化技術(shù)、應(yīng)用過程中的有效性和安全性、誘導(dǎo)牙骨質(zhì)再生、獲得功能性牙骨質(zhì)/牙周膜/牙槽骨軟硬組織復(fù)合結(jié)構(gòu)、比較不同種類細(xì)胞來源的外泌體誘導(dǎo)再生的優(yōu)劣特性、明確外泌體誘導(dǎo)再生的作用機制等是今后研究的重點。因此，利用外泌體結(jié)合組織工程技術(shù)為牙周組織再生提供新的思路，具有重要的研究意義和廣闊的應(yīng)用前景。