孫 林， 柏友萍， 林偉其

((安徽師范大學(xué)體育學(xué)院， 蕪湖 241003)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人們的物質(zhì)條件不斷改善，超重、肥胖現(xiàn)象在全世界加速流行[1]。研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)老年肥胖人口數(shù)量逐年攀升，直至2014年我國(guó)老年人群的超重、肥胖率已經(jīng)達(dá)到了41.6%、13.9%[2]。這意味著我國(guó)將有越來(lái)越多的老年人群面臨肥胖相關(guān)疾病的威脅。Vaspin是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子，現(xiàn)有的研究認(rèn)為Vaspin與肥胖、胰島素抵抗(insulin resistance，IR)、糖尿病、高血壓以及心血管疾病有關(guān)[3-4]。

運(yùn)動(dòng)是一種便捷有效的減肥方式，而甲魚(yú)油作為一種補(bǔ)品，其富含微量元素和多不飽和脂肪酸。目前有關(guān)運(yùn)動(dòng)與甲魚(yú)油對(duì)Vaspin mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)、血漿Vaspin濃度、血糖以及IR的影響尚不清楚?；诖?，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立老年肥胖SD大鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，制定運(yùn)動(dòng)與補(bǔ)充甲魚(yú)油方案，探討運(yùn)動(dòng)與甲魚(yú)油對(duì)老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織Vaspin水平及IR的影響，為了解老年肥胖及進(jìn)一步預(yù)防肥胖相關(guān)疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

本次實(shí)驗(yàn)大鼠購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司(合格證號(hào)：2007000546402，許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002)，實(shí)驗(yàn)通過(guò)了安徽師范大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)會(huì)同意(20150225)，符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》要求。

選取鼠齡3周的雄性SD大鼠(n=50)，清潔級(jí)。喂普通飼料至大鼠周齡為55周，普通飼料營(yíng)養(yǎng)素比例為脂肪 6.0%、蛋白質(zhì)26.4%、碳水化合物67.6%。大鼠在20℃±2℃，相對(duì)濕度50%～70%的環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。采用體重?zé)o差異原則(P>0.05)分為對(duì)照組與肥胖建模組，對(duì)照組為12只喂普通飼料，肥胖建模組38只喂高脂飼料(高脂飼料營(yíng)養(yǎng)素比例為脂肪40.0%，蛋白質(zhì)40.0%，碳水化合物20.0%)。建模5周后，符合老年肥胖標(biāo)準(zhǔn)(60周齡，肥胖大鼠體重>120%對(duì)照組)為建模成功。隨機(jī)選取建模成功的老年肥胖大鼠24只分為4組(n=6)：肥胖模型組(OA)、運(yùn)動(dòng)組(OB)、單純補(bǔ)充甲魚(yú)油組(OF)、運(yùn)動(dòng)結(jié)合甲魚(yú)油組(OBF)。在干預(yù)過(guò)程中OA、OF組各死亡1只大鼠。

1.2 主要試劑

大鼠的Vaspin ELISA試劑盒(美國(guó)TSZ 公司生產(chǎn)，上海研域生物科技有限公司代理)。血糖試劑盒(北京利德曼生化股份有限公司)。M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(Promega，M1705)，R Nase Inhibitor(Sun Shine Bio TM，Trizol(Sun Shine Bio TM，SN114)，Go Taq q PCR Master Mix(Promega，A6002)，R0004)，Oligo d T15(Sun Shine Bio TM)，Random prime(Sun Shine Bio TM)，100 bp DNA Ladder(Sun Shine Bio TM，SN124)；6 × SDS protein Loading buffer(還原型，Sun Shine BioTM，SN336)，PVDF膜(Millipore)，大鼠抗 β-actin 抗體(Boster，BM0627)，羊抗小鼠 Ig G-HRP(H + L)(Sun Shine BioTM，SN135)，羊抗兔 Ig G-HRP(H + L)(Sun Shine Bio TM，SN134)，兔抗Vaspin 抗體(Bioss，bs-6182R)，TBST(含 0.05%Tween20的TBS 緩沖液)，X光膠片(柯達(dá))，Supersignal West Pico Trial kit(Pierce，34079)顯影液、定影液(Sunshinebio，SN340)。

1.3 主要儀器

6跑道大鼠跑臺(tái)(Wi32812 /北京)；酶標(biāo)儀(Tecan Sunrise/瑞士)，洗板機(jī)(Tecan Co-lumbus Washer / 瑞士)；全自動(dòng)生化分析儀(日立 7060)；PCR儀(MJ research，PTC200)，高速冷凍離心機(jī)(力康生科，Neofuge15R)，臺(tái)式高速離心機(jī)(eppen-dorf，Centrifuge5417)；可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)(日立，U-2001)，凝膠成像系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)科技，JD801)；電子秤(JM-A20001/中國(guó))。

1.4 運(yùn)動(dòng)及補(bǔ)充甲魚(yú)油方案

本次運(yùn)動(dòng)方案在本實(shí)驗(yàn)室前期的運(yùn)動(dòng)方案基礎(chǔ)上進(jìn)行改良[5]。運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行跑臺(tái)適應(yīng)性練習(xí)，3～5次/天，共5 d。運(yùn)動(dòng)干預(yù)為大鼠運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)的坡度0°，速度為15 m/min，15 min，組間休息5 min，4組/次，1次/天，每次總運(yùn)動(dòng)時(shí)間為60 min，每周5次，持續(xù)8周。

甲魚(yú)油補(bǔ)充方案為OF組直接補(bǔ)充甲魚(yú)油，OBF組運(yùn)動(dòng)后休息1 h補(bǔ)充甲魚(yú)油，0.3～0.4 ml(人體推薦量4.8 g/60 kg的4倍)灌胃，其他組灌胃相等劑量的生理鹽水，1次/天，每周5次，持續(xù)8周。本實(shí)驗(yàn)室甲魚(yú)油采用新鮮甲魚(yú)做原材料，采用索氏提取法提取，主要成分為微量元素和多不飽和脂肪酸。(本次實(shí)驗(yàn)甲魚(yú)油由安徽省生物資源保護(hù)和利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室聶劉旺教授提供，純度為99.9%)。

1.5 采樣與測(cè)試

大鼠經(jīng)過(guò)8周干預(yù)后停止運(yùn)動(dòng)2 d，隨后禁食12 h，禁水6 h。用水合氯醛溶液(10%，3.0 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，成功麻醉后剖腹取腹主動(dòng)脈血液，分離血漿，取部分血漿測(cè)血糖，剩余血漿待測(cè)胰島素和Vaspin濃度。采集大鼠腎臟和睪丸周?chē)鷥?nèi)臟脂肪組織，取部分含血管少的脂肪立即置于含有Trizol的EP管中，待進(jìn)一步Vaspin mRNA 表達(dá)的測(cè)定；另取部分內(nèi)臟脂肪組織包裹于鋁箔紙中，待進(jìn)一步Vaspin蛋白質(zhì)表達(dá)的測(cè)定。計(jì)算胰島素抵抗[IR =(G0×I0)/22.5，I0為空腹血漿胰島素含量(mU/L)，G0為空腹血糖濃度(mmol /L)]。所有待測(cè)樣本均保存于-80℃冰箱。

1.6 qRT-PCR測(cè)定內(nèi)臟脂肪組織Vaspin mRNA表達(dá)

Vaspin的引物：上游5'-ACTGTGGCGGGAATTGCTCTAA-3'，下游3'-CACAGAC- ACAGGCACTGATGA-5'；β-actin的引物：上游5'-GGGAAATCGTGCGTGACATT-3'，下游5'-GCGGCAGTGGCCATCTC-3'。

用Trizol在脂肪組織中提取總RNA，以總DNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴(kuò)增：95℃反應(yīng)條件下預(yù)變性2 min→變性10 s，60℃的反應(yīng)條件下退火60 s→延伸60 s，擴(kuò)增40次循環(huán)；熔解曲線：60℃→95℃，每5 s升溫0.3℃，Vaspin Tm值為79.5℃。以上實(shí)驗(yàn)得出數(shù)據(jù)，閾值與Ct值由軟件自動(dòng)得出，△Ct = Ct(目的基因)-Ct(β-actin)，采用2-△△Ct法來(lái)進(jìn)行相對(duì)定量。得出Vaspin qRT-PCR數(shù)值均擴(kuò)大1 000倍。

1.7 Western blot測(cè)定內(nèi)臟脂肪組織Vaspin蛋白表達(dá)

使用SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將凝膠上的Vaspin蛋白質(zhì)移至PVDF 膜上。室溫下使用TBS將膜浸濕后移至封閉液中，脫色搖床上搖動(dòng)封閉1 h；用封閉液將內(nèi)參一抗(1∶1 000)、兔抗(1∶500)、4℃孵育過(guò)夜，用TBST室溫下脫色搖床上清洗4次稀釋，使用同樣的方法準(zhǔn)備二抗稀釋液(1∶2 000)并與膜接觸，室溫下孵育1 h后，脫色搖床上用TBST清洗5次。進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，掃描膠片，用Image J2和凝膠圖象處理系統(tǒng)軟件分析目的條帶的凈吸光度值。

1.8 ELISA測(cè)定各組血漿Vaspin濃度

通過(guò)ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)的雙抗體夾心法，測(cè)定血液樣本中Vaspin及胰島素濃度。制作Excel表格，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，縱坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線。Vaspin標(biāo)準(zhǔn)品試劑測(cè)量值與實(shí)際測(cè)量值相關(guān)系數(shù)r=0.997，曲線方程為y = 0.017x-0.035；胰島素標(biāo)準(zhǔn)品試劑測(cè)量值與實(shí)際測(cè)量值相關(guān)系數(shù)r=0.999，曲線方程為y = 0.020x+0.008，曲線方程代入Excel表中，得到的相應(yīng)濃度值乘以5則為樣本實(shí)際濃度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)、甲魚(yú)油及運(yùn)動(dòng)+甲魚(yú)油對(duì)老年肥胖大鼠IR的變化影響

與OA相比，8周干預(yù)后，OB、OF和OBF血漿胰島素水平下降，但各組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；OB、OF和OBF血糖水平明顯降低(P<0.05)；OB、OF和OBF 的IR明顯降低(P<0.01)。與OBF相比，8周干預(yù)后，OB和OF的血漿胰島素、血糖和IR在各組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

Tab. 1 The levels of insulin, blood sugar and insulin resistance in rats after exercise

2.2 運(yùn)動(dòng)、甲魚(yú)油及運(yùn)動(dòng)+甲魚(yú)油對(duì)內(nèi)臟脂肪組織Vaspin的mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)以及血漿濃度的影響

與OA相比，8周干預(yù)后，OB、OF和OBF的內(nèi)臟脂肪組織Vaspin mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)；OB、OF和OBF的內(nèi)臟脂肪組織Vaspin蛋白質(zhì)表達(dá)明顯降低(P<0.01)；OB、OBF的血漿Vaspin濃度明顯降低(P<0.05，P<0.01)，OF的血漿Vaspin濃度下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與OBF相比，8周干預(yù)后，OB和OF 的內(nèi)臟脂肪組織Vaspin mRNA表達(dá)、蛋白質(zhì)表達(dá)和血漿濃度在各組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2，圖1)

Tab. 2 Vaspin mRNA and protein expressions in visceral adipose tissue，and plasma vaspin concentration

Fig. 1 Vaspin protein expression in visceral adipose tissue

3 討論

脂肪因子Vaspin是由Hida等[3]發(fā)現(xiàn)于OLETF大鼠的內(nèi)臟脂肪組織中，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族。Kloting等[6]研究發(fā)現(xiàn)，肥胖個(gè)體的內(nèi)臟脂肪中Vaspin mRNA表達(dá)量明顯高于正常體重者，且Vaspin在超重和肥胖者的內(nèi)臟脂肪組織中的蛋白表達(dá)明顯高于皮下組織，說(shuō)明Vaspin與肥胖密切相關(guān)且在內(nèi)臟脂肪組織中表達(dá)更明顯。吳光秀等[7]通過(guò)高脂飼料誘導(dǎo)肥胖及IR的大鼠16周后，大鼠的血漿Vaspin水平以及肝臟組織Vaspin mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)均明顯提升，通過(guò)進(jìn)一步慢性持續(xù)輸注外源性Vaspin，大鼠體內(nèi)高糖狀態(tài)得到了改善。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[8]，高脂飲食誘導(dǎo)的SD幼鼠脂肪組織Vaspin濃度高于正常飲食SD幼鼠，通過(guò)對(duì)SD幼鼠脂肪組織Vaspin及各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，Vaspin與SD幼鼠的腰圍、內(nèi)臟脂肪重量呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究表明老年肥胖大鼠體內(nèi)IR和Vaspin表達(dá)均明顯高于其他干預(yù)組，Vaspin作為脂肪因子與肥胖及IR的關(guān)系密切。

研究顯示IR的發(fā)生與胰島素受體信號(hào)傳播異常有關(guān)，其中PI3K途徑是改善IR調(diào)節(jié)糖脂代謝的重要途徑[9]。Vaspin作為新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，其對(duì)IR的影響途徑成為近些年的研究熱點(diǎn)。劉萍等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在地塞米松誘導(dǎo)的IR模型中，信號(hào)通路IRS-1/PI3K/PAKT明顯被地塞米松抑制，在使用Vaspin干預(yù)后，抑制效果明顯減弱。另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Vaspin可以通過(guò)IRS-2/PI3K/AKT-B/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路和NF-kB炎癥通路，促進(jìn)棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島素β細(xì)胞分泌[11]。Liu等[12]通過(guò)對(duì)IR動(dòng)物模型體內(nèi)IRS/PI3K/AKt/GLUT信號(hào)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Vaspin能降低肝臟、骨骼肌和脂肪中p-IRS-1(p-IRS-2)與IRS-1(IRS-2)的比值，增加p-AKt與AKt的比值，促進(jìn)GLUT4在骨骼肌和脂肪組織上的膜位移。除此之外，該研究還發(fā)現(xiàn)Vaspin可抑制NF-kB通路成分及下游炎癥因子的表達(dá)，減輕體內(nèi)炎癥狀態(tài)。推測(cè)Vaspin可通過(guò)作用于PI3K途徑和炎癥通路來(lái)改善動(dòng)物模型體內(nèi)的IR。在本次實(shí)驗(yàn)中老年肥胖大鼠體內(nèi)均有高IR和Vaspin的高表達(dá)，這可能是大鼠的機(jī)體應(yīng)對(duì)體內(nèi)炎癥和高IR的一種機(jī)制，通過(guò)應(yīng)激性的增高Vaspin的表達(dá)來(lái)改善體內(nèi)的代謝紊亂。

運(yùn)動(dòng)可提高骨骼肌GLUT4表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)骨骼肌等相關(guān)組織對(duì)糖的利用[13]。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)能夠增加抗炎因子脂聯(lián)素的表達(dá)[14]，降低炎癥因子的應(yīng)答能力，改善老年肥胖大鼠的糖脂代謝、胰島素敏感性、血糖水平[15-16]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù)老年肥胖大鼠，中低強(qiáng)度均可明顯降低大鼠內(nèi)臟脂肪組織Vaspin mRNA、蛋白表達(dá)[17]。甲魚(yú)油作為可食用油脂，研究認(rèn)為魚(yú)油中富含的多不飽和脂肪酸有利于保持葡萄糖的正常代謝，增加肝臟對(duì)葡萄糖的攝取[18]。目前有關(guān)甲魚(yú)油與Vaspin的研究較少，兩者之間的關(guān)系尚不清楚。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)運(yùn)動(dòng)、甲魚(yú)油以及運(yùn)動(dòng)+甲魚(yú)油干預(yù)老年肥胖大鼠，發(fā)現(xiàn)干預(yù)后三組老年肥胖大鼠的Vaspin表達(dá)、血糖水平均有了明顯下降，IR得到改善?？紤]到老年肥胖大鼠體內(nèi)的高Vaspin表達(dá)可能是為了抵抗體內(nèi)的代謝紊亂的一種應(yīng)激機(jī)制，推測(cè)干預(yù)后的老年肥胖大鼠體內(nèi)IR得到了改善，代謝紊亂恢復(fù)正常，因此Vaspin的表達(dá)也隨之降低。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們使用了三種干預(yù)方式，但干預(yù)后各組之間的老年肥胖大鼠的Vaspin表達(dá)、血漿Vaspin濃度、胰島素及血糖的結(jié)果均沒(méi)有顯著差異，對(duì)IR的改善效果也沒(méi)有差異。結(jié)果說(shuō)明這三種干預(yù)方式的效果一致，運(yùn)動(dòng)+甲魚(yú)油沒(méi)有比運(yùn)動(dòng)或者甲魚(yú)油表現(xiàn)出更好的效果，說(shuō)明這兩者之間沒(méi)有很好的協(xié)同作用。在本次實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)動(dòng)和甲魚(yú)油干預(yù)都取得了相同的效果，推測(cè)這兩種干預(yù)對(duì)老年肥胖大鼠的影響有上限，在達(dá)到上限后效果減弱，所以運(yùn)動(dòng)+甲魚(yú)油才沒(méi)有取得更好的效果。目前有關(guān)運(yùn)動(dòng)+甲魚(yú)油的相關(guān)研究較少，有待進(jìn)一步研究。

總而言之，老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織中Vaspin的高表達(dá)可能是對(duì)體內(nèi)IR的應(yīng)激反應(yīng)。運(yùn)動(dòng)、補(bǔ)充甲魚(yú)油以及運(yùn)動(dòng)結(jié)合甲魚(yú)油在改善IR的同時(shí)，Vaspin的表達(dá)也會(huì)隨之降低，推測(cè)Vaspin的高表達(dá)可視為IR的危險(xiǎn)信號(hào)。運(yùn)動(dòng)、甲魚(yú)油、運(yùn)動(dòng)+甲魚(yú)油均能改善老年肥胖大鼠的IR，但尚未發(fā)現(xiàn)二者之間有較好的協(xié)同作用。

(衷心感謝安徽省生物資源保護(hù)和利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室聶劉旺教授與夏興權(quán)教授為本次實(shí)驗(yàn)提供幫助。)