劉玉倩， 張 靜， 高麗娜， 王海濤△

((1. 嶺南師范學院體育科學學院， 2. 運動與健康研究所， 廣東 湛江 524048； 3. 河北師范大學體育學院， 河北 石家莊 050024)

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指組織對胰島素的敏感性下降，從而代償性地引起胰島素分泌增加。IR不僅是 2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus ,T2DM)的發(fā)病基礎，也是高血壓、糖代謝紊亂等多種代謝相關疾病共同的病理生理基礎。2019年全球約4.63億20～79歲成人患糖尿病，我國的糖尿病人數(shù)居世界首位1.164億，90%以上為T2DM。此外，還有3.739億人口存在糖耐量受損(IGT)[1]。因此，探討IR的發(fā)病機制，有效防治IR不僅是目前健康中國背景下，我國醫(yī)療衛(wèi)生領域亟待解決的問題，更是全球關注的熱點。人體和動物實驗均表明運動在IR防治中發(fā)揮重要作用[2-3]。近年研究表明核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)是調(diào)控IR病程中重要的保護因子[4]。Nrf2具有抗氧化和抗炎癥作用，解耦聯(lián)后的Nrf2轉(zhuǎn)移進入細胞核內(nèi)，通過與細胞核內(nèi)的抗氧化反應元件(antioxidant response element, ARE)相結(jié)合從而激活在啟動子區(qū)域包含ARE的相關基因的表達，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)等，Nrf2/ARE通路可調(diào)控機體近200多種酶的活性。運動可激活Nrf2/ARE通路，促進下游抗氧化酶的表達[5]。骨骼肌是外周組織攝取葡萄糖的主要部位，因此骨骼肌發(fā)生的IR在糖代謝性疾病的發(fā)病中起到關鍵作用。本研究采用高糖高脂膳食喂養(yǎng)大鼠，在造模過程中同時進行運動，主要研究運動預防IR的作用機制。通過探討有氧運動預防IR形成過程中腓腸肌Nrf2-SOD及其相關因子的變化，為運動預防IR提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、分組及處理

選取24只12月齡清潔級健康雄性SD大鼠，在實驗室適應性飼養(yǎng)1周，自然光照10～12 h，動物房內(nèi)溫度平均22℃～25℃，相對濕度為60% ± 5%。隨機分為3組(n=8)：對照組(control，C)、高糖高脂IR組(insulin resistance model，IR)和高糖高脂IR并運動組(insulin resistance model and exercise，IRE)。對照組自然飲水攝食，不進行運動干預。在IR造模過程中進行運動干預。前期預實驗用高糖高脂飼料喂養(yǎng)可成功復制胰島素抵抗模型，成功率可達90%以上。經(jīng)過6周的高糖高脂膳食，成功復制了大鼠IR模型。檢測空腹FBG：(7.66±1.18)mmol/L，HOMA-IR：4.96±1.32, 顯著高于對照組(P<0.01)。IRE組進行6周有氧運動；IR和IRE均采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)，為實驗室以往研究中的成熟配方，復制IR模型。其主要成分包含20%的蔗糖和10%的豬油，此外，添加8%的蛋黃粉和0.1%膽酸鈉，其余61.9%為基礎飼料(AIN-93G)[6]。運動總計6周，第1周進行適應性訓練，從 5 m/min 遞增到 15 m/min, 跑臺坡度為5%(運動強度約為50%～60%VO2max)[7]。6 d/w，每天訓練30 min。第2周每天訓練30 min，此后每周遞增5 min，第5～6 周 15 m/min，45 min[8]。大鼠停止運動后24 h(以消除急性運動的影響)，禁食12 h(以消除膳食對血糖的影響)后右心耳取血，室溫靜置 30 min，3 000 r/min，離心 15 min，取血清。剝離腓腸肌外側(cè)頭，取100 mg左右投入液氮保存，以備進行相關指標的測試。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(glucose transporters 4，GLUT4) 抗體(Abcam，USA)、Nrf2抗體(ImmunoWay, USA)。胰島素ELISA試劑盒(南京建成)、8-羥基脫氧鳥苷 (8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHdG)ELISA試劑盒(R&D systems)；谷胱甘肽氧化還原(glutathione / L-Glutathione, Oxidized，GSH/GSSG)、超氧化物歧化酶 (total superoxide dismutase，T-SOD)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)、過氧化氫酶 (catalase，CAT)、肌糖原試劑盒(南京建成)。

主要儀器：Synergy H4多功能酶標儀(Thermo scientific)，F(xiàn)ujifilm LAS-4000化學發(fā)光儀(FUJIFILM,日本)，Milli-Q純水系統(tǒng)(Millipore, USA)，超聲破碎儀(寧波新芝JY92-Ⅱ)，電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-rad Criterion)，羅氏血糖儀。

1.3 指標測試

測空腹胰島素(fasting insulin, INS)、空腹血糖(FBG)，用穩(wěn)態(tài)模式評估法(homeostasis model assessment insulin resistance，HOMA-IR)評價IR，計算公式：HOMA-IR =空腹胰島素(mU/L)×空腹血糖(mmol/L)/22.5。Western blot檢測腓腸肌GLUT4(稀釋度： 1∶2 000)和Nrf2(稀釋度： 1∶500)的蛋白表達。檢測SOD、MDA、 GSH/GSSG水平、CAT、肌糖原的含量，采用分光光度計比色法。ELISA法測定腓腸肌8-OHdG含量。先將腓腸肌制成10%組織勻漿，按試劑盒說明書進行檢測。。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 有氧運動對大鼠血糖及IR的影響

IR組FBG和HOMA-IR 明顯高于C組(P< 0.01)，說明高糖高脂膳食是血糖增加和胰島素抵抗的重要原因。IRE組FBG和HOMA-IR 明顯低于IR組(P<0.05)。IRE組肌糖原明顯高于IR組(P< 0.01，表1)。

2.2 有氧運動對大鼠腓腸肌氧化應激和抗氧化酶活性的影響

IR組T-SOD、CAT、GSH/GSSG明顯低于C組(P<0.01)，MDA明顯高于C組(P<0.01)。 IRE組T-SOD和CAT、GSH/GSSG明顯高于IR組(P< 0.01)；IRE組8-OHdG和MDA明顯低于IR組(P< 0.01，表2)。

Tab. 1 Effects of aerobic exercise on the indexes of IR in each group n=8)

Tab. 2 Effects of aerobic exercise on the indexes of oxidative stress in each group n=8)

2.3 有氧運動對大鼠腓腸肌Nrf2和GLUT4蛋白表達的影響

IR組腓腸肌Nrf2和GLUT4明顯低于C組 (P<0.05，P<0.01)。IRE組腓腸肌Nrf2和GLUT4明顯高于IR組 (P<0.01，圖2，表3)。在高糖高脂膳食情況下，運動能有效促進葡萄糖從血液循環(huán)系統(tǒng)向骨骼肌的轉(zhuǎn)運，以達到降低血糖的目的。

Fig. 1 Effects of aerobic exercise on the expression of Nrf2 of gastrocnemius (relative to β-actin )

Fig. 2 Effects of aerobic exercise on the expression of GLUT4 of gastrocnemius (relative to β-actin )

Tab. 3 Effects of aerobic exercise on the expressions of Nrf2 and Nrf2 of gastrocnemius n=8)

3 討論

高糖高脂是目前許多代謝性疾病的誘發(fā)因素，IR也是糖尿病、高血壓、心腦血管疾病等許多病癥的共同病理學基礎[9]。運動對IR的影響機制是目前的研究熱點。多年來運動作為IR的重要防治手段已廣泛應用于臨床，關于其作用機制的探討引起許多學者的研究興趣[10]。不同的運動方式對防治IR的作用機制存在差別。其中耐力訓練可增加骨骼肌線粒體合成和增強抗氧化酶活性。在解釋運動對IR調(diào)控機制中，關于運動對Nrf2/ARE的影響及Nrf2/ARE在疾病防治中的作用是運動醫(yī)學的研究熱點[11]。運動能夠激活Nrf2/ARE信號通路，并且在小鼠心臟中發(fā)現(xiàn)Nrf2/ARE抗氧化通路防御能力會隨著運動強度的增加而提高。運動通過Nrf2增加SOD表達，增強骨骼肌的抗氧化能力[12]。有氧運動對小鼠骨骼肌Nrf2與Keap1解離和Nrf2轉(zhuǎn)位入核的影響與運動時間的長短有關。這些報道與本研究的結(jié)果是一致的。最新的研究表明有氧運動可以激活骨骼肌Nrf2，激活下游的抗氧化酶活性，miR3405p可能是運動影響Nrf2的上游調(diào)節(jié)因子[13]。運動對Nrf2的影響及其在抗氧化通路中的作用，及其與不同運動時間、運動類型的關系還需進一步研究。氧化還原失衡是許多代謝性疾病的共有基礎，因此，本研究重點探討了有氧運動在預防高糖高脂膳食誘發(fā)大鼠胰島素抵抗過程中Nrf2及SOD、氧化應激的變化。

本實驗采用的12月齡大鼠，在取材時處于 13.5月齡，接近人的中年階段。此時正是機體各器官機能逐漸衰退，過氧化損傷增強，肌肉出現(xiàn)隨年齡遞增的衰減綜合征。而運動是目前積極倡導的健康生活方式的重要組成部分，科學合理的運動成為預防疾病、促進健康的重要方法[14]。實驗發(fā)現(xiàn)高糖高脂膳食明顯增加成年大鼠的體重、空腹血糖和胰島素，HOMA-IR顯著高于對照組，導致IR發(fā)生。骨骼肌中Nrf2表達量下降，Nrf2/ARE通路受到抑制，導致下游抗氧化酶SOD活性下降，骨骼肌過氧化損傷嚴重，實驗中8-OHdG增加，說明線粒體損傷加劇，脂質(zhì)過氧化損傷明顯(MDA增加)。肌細胞有氧氧化能力下降，GLUT4表達下降，肌細胞對血糖的攝取能力下降，因此出現(xiàn)高血糖、高胰島素和IR，但骨骼肌中的糖原減少。這些結(jié)果表明大鼠IR造模成功，也說明高糖高脂膳食是誘發(fā)IR的重要原因。

在實驗中IRE組的Nrf2蛋白表達增加，通過Nrf2信號通路促進下游的T-SOD、CAT和GSH/GSSG活性增強，減少了成年大鼠骨骼肌中隨著年齡增長的氧化損傷，因此，以骨骼肌線粒體損傷為代表的標志物8-OHdG表達低于對照組。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，在運動后骨骼肌中的含量也下降。這均表明有氧運動減輕了骨骼肌增齡性的過氧化損傷。在運動中骨骼肌細胞功能活躍，骨骼肌細胞膜上負責將血液中葡萄糖轉(zhuǎn)運進入骨骼肌的GLUT4表達增強，因此，運動組血糖下降，但肌糖原含量增加。Ferrari等的研究也表明運動刺激GLUT4表達，改善IR，與本實驗結(jié)果是一致的[15]。因為取材時間為運動后結(jié)束24 h，消除了急性運動的影響，所以大鼠肌糖原在運動后得到了恢復。本實驗中大鼠運動時的跑臺坡度為5%，相當于一定的抗阻運動，該運動對于延緩肌肉衰減有較好的作用。抗阻運動引起肌肉質(zhì)量增加，本實驗組前期研究表明該運動可增加成年大鼠腓腸肌橫截面積[8]。

Nrf2/ARE通路是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應激通路。同時Nrf2/ARE 通路與IR、T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展聯(lián)系密切，并有望成為極具前景的T2DM干預新靶標[16-17]。對高糖誘導的T2DM大鼠肝細胞系 (HepG2)的研究進一步證實，Nrf2/ARE通路在改善細胞氧化應激和胰島素抵抗中發(fā)揮重要作用[18]。Nrf2主要通過ARE反應原件激活下游的抗氧化酶。還原型谷胱甘肽(GSH) 、SOD等均為含有ARE反應元件的酶，受Nrf2/ARE通路的調(diào)控。本實驗中IRE組抗氧酶活性增強，這些激活的抗氧化酶有助于老年大鼠對抗高糖高脂引發(fā)的影響，如降低線粒體和脂質(zhì)的過氧化損傷。骨骼肌細胞膜上的GLUT4表達增強，有助于將血糖轉(zhuǎn)運至運動中功能活躍的組織器官，一方面降低血糖和胰島素，另一方面增加肌肉中糖原儲備，為后續(xù)運動所需，進一步改善IR。運動對高糖高脂大鼠腓腸肌細胞膜上的GLUT4影響明顯，這也表明在有氧運動過程中機體積極調(diào)整糖的代謝過程，以緩沖高糖高脂膳食的影響，但這種緩沖也是有一定限度的，一旦超出機體的調(diào)整能力，依然會出現(xiàn)血糖增高。

綜上所述，有氧運動可激活Nrf2-SOD通路，減少因高糖高脂誘發(fā)的過氧化損傷，促進骨骼肌對血糖的攝取，緩解血糖增加程度，預防IR和T2DM的發(fā)生。研究結(jié)果對運動預防IR提供理論依據(jù)。本研究中選用的實驗樣本為腓腸肌，主要以快肌為主，對于以慢肌為主的比目魚肌等，運動對其糖代謝及不同運動形式(耐力、抗阻、高強度間歇等)防治IR的作用，還需要深入探討[19-20]。