鐘 鳴 陳鮮麗 陳 艷 陳 領(lǐng) 賴小將 張福展

韶關(guān)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512026

唾液酸（SA），學(xué)名為“N-乙?；窠?jīng)氨酸”，是一種天然存在的碳水化合物。它最初由頜下腺粘蛋白中分離而出，也因此而得名。唾液酸通常以低聚糖，糖脂或者糖蛋白的形式存在。人體中，腦的唾液酸含量最高。腦灰質(zhì)中的唾液酸含量是肝、肺等內(nèi)臟器官的15 倍。

大量研究表明，唾液酸在抗炎、抗病毒和抗腫瘤等方面呈現(xiàn)出顯著的生物學(xué)功效[1]，尤其在抗流感方面。流感是一種急性呼吸道傳染病，具有傳染性強(qiáng)、傳播速度快、流行面廣、發(fā)病率高的特點。根據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心數(shù)據(jù)顯示，僅2019 年3 月份，全國共報告流行性感冒病例358757例，死亡31 例[2]。不僅如此，由流感引發(fā)的肺炎及心、腎等多種臟器衰竭更可以導(dǎo)致老人、兒童等高危人群死亡。近年來，隨著新的高致病性禽流感和豬流感在全國及世界范圍內(nèi)的傳播，各國政府均要求各國疾控中心（Center for Disease Control and Prevention，CDC）建立流感觀測點，定期發(fā)布流感疫情情況報告，并加強(qiáng)了對流感的研究力度。我國是人口大國，龐大的人口基數(shù)使得對流感的監(jiān)控與防治具有重大社會和國家安全意義。

流感由流感病毒引起，流感病毒屬正粘病毒科(Orthonlyxovoridae)RNA 病毒，病毒顆粒直徑80 ～120nm。根據(jù)RNA 基因的不同，人流感病毒分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三種類型。流感病毒表面有兩種重要的糖蛋白受體，血凝素(Hemagglutinin，HA)與神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)，二者是流感病毒亞型劃分的主要依據(jù)，同時也是抗流感藥物設(shè)計的主要靶點。臨床上主要以接種流感疫苗和使用抗流感藥物進(jìn)行流感的預(yù)防與治療[3]。由于針對HA 的流感疫苗的制備、儲藏及運輸?shù)目量虠l件，同時由于抗原性漂移（Antigenic Drift）的存在，使得有效性與及時性存在諸多問題，因此抗流感藥物成為防治流感爆發(fā)的主要手段。針對流感病毒表面神經(jīng)氨酸水解酶（亦稱唾液酸水解酶，Neuraminidase，NA）的一類抑制劑是迄今為止最有效、最成功的設(shè)計案例（見圖1）。

流感病毒表面的糖蛋白受體血凝素能與多種動物（如雞、豚鼠）和人的紅細(xì)胞表面的末端唾液酸糖蛋白結(jié)合，介導(dǎo)病毒的融合，因此，利用唾液酸糖苷化反應(yīng)模擬生物結(jié)合，對于抗流感病毒藥品的研制有重要意義。隨著人們對唾液酸在生物體內(nèi)的生理功能逐步深入了解，開展唾液酸糖苷的化學(xué)合成與生物活性研究便有了非常重要的意義。與普通的糖苷化反應(yīng)相比，唾液酸進(jìn)行糖甘化反應(yīng)所需的條件更為嚴(yán)格，并且其立體構(gòu)型極難控制。

唾液酸C-2 鹵化物是最早用于唾液酸糖苷化反應(yīng)的物質(zhì)之一，且在20 世紀(jì)六七十年代被廣泛使用，不過目前僅被運用于一些簡單的糖苷化反應(yīng)實驗中。為了提高對唾液酸糖苷化反應(yīng)的研究效果，越來越多性質(zhì)各異的離去基團(tuán)被用于糖苷化反應(yīng)之中。其中包括長鏈烷基唾液酸硫苷[4]、唾液酸β-亞磷酸酯[5]和三氟乙酰亞胺酯[6]等，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，以上方式均可簡單快捷地對相應(yīng)唾液酸糖苷進(jìn)行制備，并可明顯地提高反應(yīng)產(chǎn)率和立體選擇性。

圖1 唾液酸及基于唾液酸的各類藥物的結(jié)構(gòu)

有項目組研究表明，在使用N-Fmoc（9-芴基甲氧基羰基保護(hù)基）、N-Troc（2,2,2-三氯乙氧基羰基）及N-TFA（三氟乙?；ν僖核酑-5 位氨基進(jìn)行保護(hù)的過程中發(fā)現(xiàn)，N-Fmoc 衍生物的產(chǎn)率較低(27%)，其它相對較好，可以達(dá)到63%～89%的產(chǎn)率；與一級醇發(fā)生糖苷化反應(yīng)，選用N-碘代丁二酰亞胺／三氟甲磺酸作為催化劑后，N-Fmoc、N-Troc 或N-TFA 保護(hù)的唾液酸衍生物糖苷化產(chǎn)率均比較理想(＞90%)。由于脫除TFA 保護(hù)基需要較強(qiáng)的堿性條件，這將會破壞目標(biāo)分子的構(gòu)型，因此，選用N-Fmoc，N-Troc 保護(hù)基較TFA 更為合適，而N-Troc 保護(hù)的唾液酸又比N-Fmoc 保護(hù)操作更容易一些，因此N-Troc 作為保護(hù)基用于目標(biāo)分子的全合成研究具有更多的選擇優(yōu)勢[7-8]。

在流感爆發(fā)季節(jié)，抗流感藥物成為了防治的主要手段。目前上市的作為抗流感一線藥物的NA 抑制劑有兩種：葛蘭素公司的Zanamivir (商品名Relenza，中文商品名樂感清)與羅氏公司的Oseltamivir(商品名Tamiflu，中文商品名達(dá)菲)。另有強(qiáng)生公司和BioCryst 公司合作開發(fā)的Peramivir 已經(jīng)進(jìn)入III 期臨床，并獲得FDA 緊急使用授權(quán)；日本FDA 也已經(jīng)批準(zhǔn)Laninamivir 和Peramivir 進(jìn)入III 期臨床。仔細(xì)分析他們的結(jié)構(gòu)不難發(fā)現(xiàn)，上述的上市藥物均為唾液酸經(jīng)過化學(xué)改造的結(jié)構(gòu)類似物，其與NA 的親和力相比于NA 的天然配體唾液酸更強(qiáng)。盡管此類藥物在臨床上的應(yīng)用已經(jīng)取得巨大成功，但是流感毒株耐藥性問題卻日益凸顯。美國疾病控制與預(yù)防中心報告指出, 臨床長期治療的兒童體內(nèi)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)對Zanamivir 敏感性降低的病毒株，另一方面，耐達(dá)菲的流感病毒數(shù)量也正在逐年增加，因此藥物化學(xué)家仍然不懈地尋找基于唾液酸的結(jié)構(gòu)新穎的NA 抑制劑。Kim 小組報道了雙氟取代Zanamivir 類似物DFSAs，結(jié)果顯示對耐藥株有良好的抑制活性，相關(guān)研究正在進(jìn)一步深入。本課題組希望在此基礎(chǔ)上，對DFSAs 進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改造，以期獲得更加優(yōu)良的抗耐藥效果，初步的設(shè)計是在DFSAs 的C-7 位引入疊氮基團(tuán)，以炔基修飾的乙二醇、季戊四醇、乳糖為骨架，合成二價、四價、八價DFSAs綴合物。

由于NA 的主要功能是水解唾液酸糖苷鍵，阻止病毒聚集，協(xié)助子代病毒粒子從感染的細(xì)胞中釋放，故制備正常的唾液酸氧苷顯然會遭到NA 的破壞，無法達(dá)到預(yù)想的目的。因此，我們的另外一種思路是考慮采用雜原子（例如氮原子或者硫原子等）替換唾液酸糖苷鍵中的氧原子，以此來構(gòu)建唾液酸偽糖苷。由于NA 在識別這種偽糖苷的過程中無法水解糖苷鍵，沒有破壞糖環(huán)結(jié)構(gòu)，因此唾液酸偽糖苷在起到蛋白識別作用的同時，能夠?qū)A 的水解起到抵抗作用，化合物更加穩(wěn)定。后面這種思路是我們項目組正在進(jìn)行的工作。

通過一系列比較，我們認(rèn)為，用氮原子替換唾液酸糖苷鍵中的氧原子，合成方面難度較小，并且有利于后續(xù)的連接臂合成，我們設(shè)計的氮原子替換唾液酸糖苷鍵氧原子形成的化合物結(jié)構(gòu)如圖2 所示。

圖2 位氨基取代的唾液酸

接下來，就可以用各式各樣的連接臂來銜接偽糖苷鍵，例如，選擇酰胺連接來進(jìn)行偽糖苷的構(gòu)建，方便后續(xù)與數(shù)量龐大的生物或者人工合成的高分子進(jìn)行組裝，該分子的結(jié)構(gòu)如圖3 所示。

圖3 酰胺連接的唾液酸偽糖苷

上述制備的唾液酸偽糖苷與牛血清白蛋白HSA 及聚醚酰亞胺PEI 結(jié)合，構(gòu)建糖綴合物，用來模擬細(xì)胞表面的糖蛋白結(jié)構(gòu)，進(jìn)行糖及蛋白受體相互結(jié)合的作用研究。由于HSA 和PEI 具有方便易得、生物可降解、無毒、無免疫原性等特性，故我們選擇它們作為骨架構(gòu)建糖綴合物。構(gòu)建的糖綴合物結(jié)構(gòu)見圖4。

圖4 HSA 和PEI 為骨架構(gòu)建的糖綴合物

圖5 唾液酸氨基甲酸酯、酰胺和硫脲連接半乳糖的合成

除此之外，我們將2 位氨基取代的唾液酸進(jìn)行全乙?；Ｗo(hù)，進(jìn)一步合成唾液酸氨基甲酸酯、酰胺和硫脲寡糖，對上述提到的三類化合物進(jìn)行組裝，其中重要的反應(yīng)步驟如圖5 所示：

通過對唾液酸糖苷化反應(yīng)進(jìn)行探討，合成不同結(jié)構(gòu)的唾液酸糖苷化給體，旨在提高唾液酸糖苷化反應(yīng)的產(chǎn)率以及立體選擇性。本項目組設(shè)計用雜原子替換唾液酸糖苷鍵中的氧原子，構(gòu)建唾液酸偽糖苷，該合成的唾液酸偽糖苷是新化合物，暫未見文獻(xiàn)報道，在起到蛋白識別作用的同時，能夠?qū)A 的水解起到抵抗作用。通過總結(jié)糖苷化反應(yīng)的進(jìn)展，為我們項目組利用糖苷化反應(yīng)來制備糖綴合物，增加其與流感病毒表面糖受體之間的結(jié)合，并以此提高抑制流感病毒活性，提供了堅實的實驗參考價值。