何婕培

（中國海洋大學(xué)魚山校區(qū) 山東青島 266000）

基因編輯技術(shù)是一種對基因組中特定DNA 片段進(jìn)行堿基的添加、刪除或替換的技術(shù)。核酸內(nèi)切酶和特定的蛋白在基因編輯中起重要作用，其中核酸內(nèi)切酶廣泛應(yīng)用于DNA 的定點(diǎn)切割，可識別和剪切特定的DNA 序列；特定的蛋白，例如鋅指蛋白可識別和結(jié)合特定的DNA 序列，Cas9 蛋白可結(jié)合和切割特定的DNA 序列。當(dāng)定點(diǎn)切割靶序列完成后，細(xì)胞固有的非同源末端連接（non-homologous end-joining，NHEJ）修復(fù)過程與這些融合蛋白聯(lián)手，就能導(dǎo)致基因組定點(diǎn)插入、刪除或移碼突變，引起外源DNA 插入、基因功能缺失等［1］。

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的高速發(fā)展，已有多種海洋藻類完成了基因組測序，褐藻中的海帶（Saccharina japonica）和長囊水云（Ectocarpussiliculosus），綠藻中的萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）和團(tuán)藻（Volvox carteri），硅藻中的三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）和灰胞藻（Cyanophora paradoxa）等［2-4］，為海洋藻類學(xué)研究提供了豐富的遺傳基因資源。然而海洋藻類，特別是大型海藻，普遍存在生長周期長、遺傳轉(zhuǎn)化方法不成熟、各種分子生物學(xué)研究在藻類中起步晚的特點(diǎn)，這為基因編輯技術(shù)在藻類中的開展帶來了難度。而CRISPR／Cas9 技術(shù)作為目前熱門且簡單的基因編輯技術(shù)，2013年就首次成功應(yīng)用于植物的基因組編輯中［1］。CRISPR／Cas9 基因編輯技術(shù)逐步成熟，目前CRISPR／Cas9 基因編輯技術(shù)作為較為簡單方便的基因編輯方法，已應(yīng)用于多種植物，包括擬南芥、水稻、煙草、大豆、玉米、高粱等植物中［5］。

圖1 Cas9 蛋白示意圖

圖2 CRISPR／Cas9 流程圖

1 CRISPR／Cas9 技術(shù)在微藻中的應(yīng)用

2014年，Jiang 等［6］首次將CRISPR／Cas9 技術(shù)應(yīng)用于藻類中，構(gòu)建Cas9 和gRNA 載體轉(zhuǎn)化至萊茵衣藻中，培養(yǎng)24 h 后觀察到基因的瞬時表達(dá)，但沒有得到穩(wěn)定遺傳的突變株。Nymark 等［7］利用三角褐指藻內(nèi)源的葉綠素a／c 結(jié)合蛋白基因（LHCF2）和U6 啟動子分別調(diào)控Cas9 與gRNA 的轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)了對葉綠體信號識別因子54（CPSRP54）的定點(diǎn)突變，得到了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化株，并利用高分辨率溶解曲線的方法進(jìn)行突變結(jié)果的檢測，這是該方法首次應(yīng)用于藻類的基因編輯研究。Shan 等［8］在微擬球藻（Nannochloropsis）中對硝酸還原酶基因進(jìn)行了定點(diǎn)突變，得到的突變株在含有NH4Cl 的培養(yǎng)基中能正常生長，但是NaNO3對其有致死作用。該研究組進(jìn)一步改進(jìn)了檢測方法，比較了基因組DNA 是否經(jīng)過酶切對轉(zhuǎn)化效率的影響，以及PCR 的產(chǎn)物直接進(jìn)行高通量測序可驗(yàn)證堿基突變的發(fā)生。

表1 CRISPR／Cas9 技術(shù)在藻類中的應(yīng)用

2 CRISPR／Cas9 系統(tǒng)在大型海藻中應(yīng)用存在問題

2.1 成熟的遺傳轉(zhuǎn)化方法 植物常用的轉(zhuǎn)入外源基因的方法包括基因槍法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、電穿孔法等。微藻中使用的轉(zhuǎn)化方法較為成熟，其中電穿孔法為常用的轉(zhuǎn)化方法，已能成熟運(yùn)用并實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定遺傳［9］。成熟的遺傳轉(zhuǎn)化方法，對于外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，起到至關(guān)重要的作用。同時，對于提高受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，提高成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞成活率也很重要?？梢哉f，成熟的遺傳轉(zhuǎn)化體系是CRISPR／Cas9 技術(shù)在大型藻類中成功運(yùn)用的基礎(chǔ)。

2.2 富集成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞 成功將外源基因?qū)朐孱惣?xì)胞后，常用抗生素的方法篩選成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其中潮霉素和氯霉素用于篩選條斑紫菜葉狀體的遺傳轉(zhuǎn)化研究，常見的篩選抗生素還包括氨芐、除草劑等［9］。在CRISPR／Cas9 基因編輯系統(tǒng)，轉(zhuǎn)入CRISPR／Cas9 表達(dá)載體后，可同時得到成功突變的和未發(fā)生突變的個體；區(qū)別得到并富集突變個體至關(guān)重要，直接影響到后期的檢測結(jié)果與突變個體的后續(xù)培養(yǎng)。

3 CRISPR／Cas9 技術(shù)已有研究對大型海藻中的指導(dǎo)意義

CRISPR／Cas9 技術(shù)在微藻中有成功運(yùn)用的實(shí)例［6］，其在海洋大型藻類的運(yùn)用也具有理論可行性。研究表明，通過對外源基因的密碼子優(yōu)化和使用內(nèi)源性強(qiáng)啟動子可提高外源表達(dá)載體在海藻中的表達(dá)效率，由于藻類基因組中通常有較高的GC含量，因此在密碼子的偏好性上更傾向于使用G和C［10］?，F(xiàn)已有研究對大型藻類中的指導(dǎo)意義如下，主要從3 個方面進(jìn)行改進(jìn)：轉(zhuǎn)入載體的優(yōu)化、遺傳轉(zhuǎn)化方法的選擇和編輯效率的提高。

3.1 載體的優(yōu)化

3.1.1 Cas9 序列優(yōu)化 相關(guān)研究人員已經(jīng)證實(shí)，Cas9 基因密碼子是否進(jìn)行優(yōu)化，在高等植物中的編輯效率不同。Nymark 等［7］通過優(yōu)化Cas9 的密碼子，并采用藻體內(nèi)源的啟動子啟動Cas9 和sgRNA的轉(zhuǎn)錄，顯著提高了CRISPR／Cas9 系統(tǒng)在三角褐指藻中的基因編輯效率，使得基因編輯效率達(dá)31%，同時通過在1 個靶基因上運(yùn)用2 個sgRNA，基因編輯效率提高至25%～63%。研究表明，人類細(xì)胞和水稻的密碼子偏好性對Cas9 基因進(jìn)行優(yōu)化后，用于編輯水稻基因組中的同一位點(diǎn)，雖然都獲得了能穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化株，但編輯效率不同：根據(jù)水稻基因組優(yōu)化的Cas9 基因突變效率明顯高于根據(jù)人類細(xì)胞優(yōu)化的Cas9 基因的突變效率。在玉米的原生質(zhì)體基因編輯實(shí)驗(yàn)中，也得到了與水稻中相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［11］。通過以上論述，為了使該系統(tǒng)在大型海藻中更高效地發(fā)揮作用，需要根據(jù)相應(yīng)物種的核心基因集的密碼子偏好性對其進(jìn)行基因優(yōu)化，連入CRISPR／Cas9 表達(dá)載體中。

3.1.2 啟動子的選擇 通常情況下，細(xì)胞中RNA聚合酶Ⅱ類啟動子主要介導(dǎo)編碼蛋白質(zhì)基因的表達(dá)，不能調(diào)控非編碼RNA 的轉(zhuǎn)錄。在已知的高等植物和動物的細(xì)胞核中，RNA 聚合酶Ⅲ類啟動子會識別并轉(zhuǎn)錄非編碼RNA。所以在構(gòu)建載體的過程中，常用該類啟動子進(jìn)行g(shù)RNA 的轉(zhuǎn)錄。此外，改造后的Ⅱ類啟動子也可進(jìn)行小RNA 的轉(zhuǎn)錄。至目前為止，應(yīng)用于植物中進(jìn)行g(shù)RNA 轉(zhuǎn)錄的主要是內(nèi)源性RNA 聚合酶Ⅲ類啟動子，例如擬南芥U6 啟動子、水稻U6 啟動子、水稻U3 啟動子及水稻tRNA 啟動子等［4，12］，也有使用CAMV35s 啟動子成功轉(zhuǎn)錄gRNA 的研究［6］。2014年，Jiang 等［6］利用擬南芥的U6 啟動子轉(zhuǎn)錄gRNA 后，在萊茵衣藻中得到成功的表達(dá)。研究表明，雖然外源的啟動子也有功能，但是選取目標(biāo)物種的內(nèi)源啟動子，對該項(xiàng)技術(shù)在其中的運(yùn)用非常重要。

3.2 遺傳轉(zhuǎn)化方法的選擇

3.2.1 基因槍轉(zhuǎn)化 研究表明，基因槍的轉(zhuǎn)化率較低，并且在各物種中的變化范圍較大，轉(zhuǎn)化率通常在10-3～10-2之間。條斑紫菜質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，優(yōu)化了基因槍轟擊參數(shù)，當(dāng)真空度為28 mmHg，轟擊距離為6 cm，氦氣壓力是1 350 psi時，轉(zhuǎn)化效率最高，約為4.2‰［9］。目前基因槍介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化方法，在海洋大藻中運(yùn)用較普遍，并且經(jīng)過轉(zhuǎn)化后，能得到穩(wěn)定表達(dá)個體。

3.2.2 其他轉(zhuǎn)化方法 關(guān)于大型外源基因的轉(zhuǎn)化方法，采用了多種方法。其中包括證明了PEG轉(zhuǎn)化法和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法在紫菜原生質(zhì)中應(yīng)用的可行性，以及電擊轉(zhuǎn)化法在紫菜原生質(zhì)中的應(yīng)用，但這些轉(zhuǎn)化方法都具有一定的局限性，有待進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)。嘗試多種轉(zhuǎn)化方法，并得到一套成熟的遺傳轉(zhuǎn)化體系，對于基因編輯技術(shù)的成功運(yùn)用，編輯效率的提高，都有重要意義。

3.3 編輯效率的提高 據(jù)文獻(xiàn)報道，所有成功轉(zhuǎn)入載體的個體不可能全部發(fā)生基因編輯，預(yù)計(jì)只有30%～40%的成功轉(zhuǎn)化株會發(fā)生突變：生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法會導(dǎo)致Cas9 基因序列的斷裂和不完全 融合［13］。然 而Cas9 序列 和sgRNA 序列的 完 整性是基因突變發(fā)生的必要條件，與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化突變率在20%～90%相比［13］，當(dāng)采用生物技術(shù)的轟擊轉(zhuǎn)入外源基因時，基因槍轉(zhuǎn)化的突變率更低，在5%～12%之間［14］。所以，通過Cas9 序列的優(yōu)化、內(nèi)源啟動子的運(yùn)用、轉(zhuǎn)化方法的選擇，這些步驟都能在一定程度上提高CRISPR／Cas9 系統(tǒng)在大型海藻體內(nèi)的編輯效率。

4 展望

CRISPR／Cas9 技術(shù)運(yùn)用廣泛，幾乎可在所有的模式生物中實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)敲除和編輯，涵蓋人類體外培養(yǎng)細(xì)胞、斑馬魚、小鼠、大鼠、果蠅、秀麗隱桿線蟲、水稻、擬南芥、煙草等多種物種［5，12］。在海洋生物中也已有多種生物成功運(yùn)用該技術(shù)，其中包括玻璃海鞘、海膽、?？?、大西洋角螺、海七鰓鰻、大西洋鮭、端足類動物、脊尾白蝦、三角褐指藻的種類較為廣泛，涵蓋了尾索動物、棘皮動物、刺胞動物、貝類、圓口綱、魚類、甲殼動物和藻類等生物類群［15］。

大型海藻作為重要的自然資源，其可食用、可作飼料、工業(yè)原料和有機(jī)肥料，是具有較高價值的商品。許多海區(qū)大規(guī)模養(yǎng)殖大型海藻，這就對大型海藻的良種選育提出了更高的要求，而CRISPR／Cas9 基因編輯的運(yùn)用對其精確育種有著重要的實(shí)踐意義。隨著大型海藻基因組測序工作的進(jìn)一步進(jìn)行，在海洋大藻中迫切需要建立簡單高效的基因編輯系統(tǒng)，用于研究其基因功能。目前CRISPR／Cas9沒有在大型海藻中的運(yùn)用實(shí)例，包括褐藻的代表物種海帶、紅藻的代表物種紫菜等。與其他模式物種相比，在藻類中的運(yùn)用起步較晚，還有一些技術(shù)問題有待解決，但CRISPR／Cas9 基因編輯技術(shù)與其他基因編輯技術(shù)相比，擁有無可比擬的優(yōu)勢和運(yùn)用前景，是研究基因功能的強(qiáng)大工具。