陳棟林 萬永文 鮑鎮(zhèn)寧 王奎欽 董乃銘 鄭小東

（中國海洋大學水產(chǎn)學院 山東青島 266003）

將動物某一器官制成半透明或透明的狀態(tài)，便于直接觀察內(nèi)部構造，這種標本稱為透明標本。與目前利用福爾馬林、酒精等保存的標本相比，透明標本有許多顯著的優(yōu)點，例如可長期保存、觀賞性高等,在教學和科學普及方面都有重要的應用價值［1-3］。在我國，透明標本的制作技術起源于上世紀50年代［3］，制作過程主要為骨骼染色。近年來,透明標本制作技術的發(fā)展應用范圍已擴展至魚類［1］、蛙類［4］和小鼠［5］等，關于頭足類透明標本的制備方法國內(nèi)卻尚無報道。頭足類是海洋軟體動物的重要類群，與人們的經(jīng)濟、飲食生活聯(lián)系甚廣。本文以日本槍魷、無針烏賊和短蛸3 種常見的頭足類動物為對象,探索一種成熟的頭足類透明標本制備方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選擇新鮮、完整的頭足類標本作為實驗材料。其中,選取的日本槍魷（Loliolus japonica）全長7～13 cm，無針烏賊（Sepiella japonica）全長7～13 cm，短蛸（Amphioctopus fangsiao）全長為10～21 cm。

1.2 試劑配制方法 茜素紅溶液用1.0 g／L 茜素紅和20.0 g／L 的KOH 配制而成；番紅O 染色液采用0.1%的番紅溶液配制而成；阿利新藍染色液用1.0 g／L 阿利新藍、50%的95%酒精溶液、10%冰醋酸和40%蒸餾水配制而成；甲苯胺藍染色液用1.0 g／L 甲苯胺藍、50%的95%酒精溶液、10%冰醋酸和40%蒸餾水配制而成。分色劑用10 g／L 的KOH、20%丙三醇和80%蒸餾水配制而成。透明液用10 g／L 的KOH、50%丙三醇和50%蒸餾水配制而成。

1.3 透明標本制備流程 透明標本制備主要包括墨囊處理、脫水固定、腐蝕透明、染色、分色、二次透明、封裝保存等步驟。

在常溫下,用蒸餾水或自來水將頭足類動物表面沖洗干凈后翻至腹面,輕輕提起胴體腹面肌肉，露出墨囊，用解剖針在墨囊上刺一個小口，用針按壓墨囊，使墨汁流出，并用清水不斷沖洗，至流水不再呈黑色為止。處理過程中要盡可能保持墨囊的完整性。將處理好的頭足類動物平放于亞克力透明盒中，使其舒展，保持自然形態(tài)，添加95%的酒精，浸沒標本1~2 cm，靜置2 d，較大的標本可根據(jù)形態(tài)適當延長固定時間。

將脫水固定后的標本放入2% KOH 中進行透明處理。一般浸泡1~2 d，使標本表面色素基本溶解，標本變軟即可。按染色劑配制方法（見1.2）提前配制好染色劑。將標本放入染色劑溶液中，浸泡1~2 d，使標本完全染色。

用3%過氧化氫溶液（或市售雙氧水消毒液）對染色的標本進行分色，5~6 h 后,用分色劑再次對標本進行褪色處理2~3 d。將褪色后的標本置于透明液中繼續(xù)透明處理2~3 周。最后將處理好的頭足類標本放入丙三醇中封裝保存，完成標本制備。

2 結果

2.1 不同染色劑的染色效果 使用了茜素紅、番紅O、阿利新藍、甲苯胺藍4 種染色劑，制備的3種頭足類動物透明標本效果不同，詳見表1。

表1 不同染色劑對日本槍魷、無針烏賊及短蛸透明標本效果

本實驗中使用了阿利新藍、甲苯胺藍、番紅O、茜素紅4 種染色劑,實驗表明4 種染色劑均收效良好，能清晰地觀察到內(nèi)部結構。但這4 種染色劑的染色效果有所不同，茜素紅、番紅O 染色較淺，容易凸顯頭足類眼和頭部的內(nèi)部結構；甲苯胺藍、阿利新藍染色較深，更能凸顯頭足類觸腕、吸盤、齒的結構。不同種類的頭足類染色效果也有所不同。對于日本槍魷，染色凸顯出了鰓絲、墨囊、角質(zhì)顎、眼等結構（圖1，本文附圖見封四）；對于無針烏賊，染色凸顯出了白色的海螵蛸結構（圖2）；對于短蛸，染色突出了吸盤、眼、肝臟、性腺和角質(zhì)顎等結構（圖3）。

2.2 過氧化氫對標本褪色效果的影響 褪色過程中，使用了不同濃度的過氧化氫（0%、1.5%及3%），它們對無針烏賊、短蛸組織影響不同，即使在過氧化氫濃度很低的情況下，無針烏賊、短蛸肌肉表面仍會出現(xiàn)大量氣泡，肌肉被嚴重腐蝕，呈現(xiàn)氧化發(fā)白的現(xiàn)象（圖4a、圖4b）。

為解決該問題，在實驗中使用了甘油和氫氧化鉀的混合溶液（KOH 10 g／L、20%丙三醇及80%蒸餾水）作為褪色液代替過氧化氫進行褪色步驟。褪色48 h 后，該褪色液不僅達到過氧化氫的褪色效果（觸腕顏色變淺，能看到吸盤，頭部內(nèi)的結構逐漸顯現(xiàn)），同時避免了標本產(chǎn)生大量氣泡和氧化發(fā)白的現(xiàn)象（圖4c）。

2.3 墨囊處理的影響 墨囊結構較為脆弱，在標本制備過程中容易破裂，導致標本頭部被染黑，對標本結構的觀察造成巨大的負面影響。因此，通過在標本固定前對墨囊進行處理，去除墨汁（見制備流程1.3），可成功地避免后期墨汁流出對形態(tài)結構觀察的影響。

3 討論

3.1 染色效果 在透明魚類標本的制備過程中，普遍僅使用1~2 種染色劑（茜素紅或阿利新藍）。本實驗分別使用了阿利新藍、甲苯胺藍、番紅O、茜素紅4 種染色劑進行單獨染色,取得了較好的效果。

造成不同染色劑染色效果不同的原因多樣：1）從種類上看，日本槍魷個體較小，肌肉層薄，容易被腐蝕透明,結構也展現(xiàn)得最為清晰；無針烏賊、短蛸肌肉層相對較厚，堿不易穿透，透明程度稍遜一籌。2）從染色機理上看，結合位點的不同也造成了一定的影響。茜素紅可在堿性環(huán)境中結合鈣，從而將骨組織和其他鈣化結構染成紅色［6］。番紅O 是一種嗜堿性陽離子染料，能與軟骨基質(zhì)中豐富的陰離子糖胺聚糖結合成紅色［7］。甲苯胺藍是一種陽離子染料,其基團中的陽離子有染色作用,能與組織細胞的酸性物質(zhì)相結合而染成藍色［8］。阿利新藍也是一種陽離子染料，能與組織內(nèi)含有的陰離子基團如羧基和硫酸根形成不溶性復合物［9］。3）從染料的顏色上看，阿利新藍、甲苯胺藍顏色較深，對于外部細小的結構例如吸盤等有較好的凸顯作用，但對于肌肉層較厚的無針烏賊、短蛸的內(nèi)部結構觀察來說，染料本身的深顏色具有一定的遮蔽作用,因此不是觀察內(nèi)部結構最佳的染料。番紅O 和茜素紅顏色相對較淺，經(jīng)過分色、繼續(xù)透明后能很好地顯露出頭部的內(nèi)部結構。

3.2 褪色及透明效果 對染色后的日本槍魷、無針烏賊及短蛸進行褪色處理,目的在于使?jié)馊镜牟糠滞手吝m當程度，使外套膜外層肌肉染色較淺，內(nèi)部結構染色較深（分色），更好地凸顯透明的效果。日本槍魷的褪色可參照李婷等［10］對透明魚骨骼制備中的脫色方法,使用過氧化氫對日本槍魷進行褪色處理，但會出現(xiàn)不影響效果的少量氣泡。對于無針烏賊、短蛸，使用過氧化氫進行褪色效果不佳。在無針烏賊、短蛸的褪色過程中，使用過氧化氫均會導致其表皮出現(xiàn)氧化現(xiàn)象或氣泡。本實驗利用分色液處理48 h,不僅能避免組織氧化，而且能達到相同的脫色透明效果。

3.3 方法改進 透明魚標本的制備特點主要是將肌肉腐蝕殆盡后，再對骨骼進行染色，從而凸顯出魚的骨架結構［10-11］。而日本槍魷、無針烏賊及短蛸標本中，由于骨骼等堅硬結構較少，不能將肌肉完全腐蝕后再染色,否則會導致形態(tài)不完整。因此，照搬已有的透明魚類標本制備方法效果不佳。頭足類的透明標本制作更注重將表層肌肉腐蝕透明，以突出其內(nèi)部結構，同時以不同的染色劑進行染色，使得標本更具觀賞性。制備好的頭足類標本不僅能顯示角質(zhì)顎、觸腕等外部結構，還能顯示海螵蛸、內(nèi)臟團等內(nèi)部構造，既可用于教學與科研，又可作為科普宣傳。

致謝：感謝中國海洋大學水產(chǎn)學院貝類遺傳育種實驗室對本項目的支持,感謝中國海洋大學水產(chǎn)學院姜典航、唐艷、許晨曦、南澤、陳智威等研究生在樣品采集、鑒定和實驗操作中給予的幫助。