賈麗艷 荊 旭 田宇敏 王曉勇 劉 帥 耿添霈 韓 英

（1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷030801

2 山西省白酒生物工程研究生教育創(chuàng)新中心 山西太谷030801

3 山西杏花村汾酒廠股份有限公司 山西汾陽032209）

傳統(tǒng)清香型白酒主產(chǎn)于山西省杏花村。杏花村位于山西腹地偏西，屬于溫帶季風(fēng)氣候區(qū)，冬寒夏暑，四季分明。該環(huán)境因素為傳統(tǒng)清香型白酒酒醅微生物菌群的生存提供了良好環(huán)境。結(jié)合優(yōu)質(zhì)的高粱、大麥豌豆，憑借6 000年的開放式傳統(tǒng)釀造技藝，共同造就了清香型白酒獨特的風(fēng)味和不可復(fù)制的產(chǎn)品特點。傳統(tǒng)清香型白酒的生產(chǎn)過程主要分為2個階段：第1階段是以粉碎蒸餾好的高粱為原料，添加生產(chǎn)用大曲，地缸發(fā)酵，甑桶蒸餾獲得白酒。該發(fā)酵階段的酒醅稱為“大楂”[1]。第2階段是以大楂發(fā)酵蒸餾酒后的酒糟為原料，添加大曲，地缸發(fā)酵，甑桶蒸餾獲得白酒。該發(fā)酵階段的酒醅稱為“二楂”[1]。研究發(fā)現(xiàn)大楂和二楂發(fā)酵酒的理化指標(biāo)具有較大的差異，如二楂酸度、酯含量高等，這與其酒醅發(fā)酵過程中的微生物有一定的關(guān)系。目前，關(guān)于傳統(tǒng)清香型白酒發(fā)酵微生物菌群的研究已有研究報道，多數(shù)研究采用微生物純種培養(yǎng)技術(shù)，研究發(fā)酵機理并分離獲得功能性微生物，包括扣囊腹膜孢酵母、紅曲霉、芽孢桿菌、乳酸菌、白地霉等菌株[2-5]。由于微生物對營養(yǎng)及生長條件需求的不同，使得利用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法不能短時、高效、全面地了解環(huán)境中微生物的整體生長代謝情況，所以微生物非培養(yǎng)技術(shù)被應(yīng)用到清香型白酒細菌類群的研究中。雷震河等[6]采用高通量測序技術(shù)分析清香型白酒微生物菌群結(jié)構(gòu)。徐瑾等[7]利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)（PCR-DGGE）研究了清香型白酒發(fā)酵過程中細菌群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律。這些研究未對傳統(tǒng)清香型白酒大楂和二楂發(fā)酵過程中細菌菌群的變化做系統(tǒng)的研究。鑒于傳統(tǒng)清香型白酒發(fā)酵的復(fù)雜性和大楂、二楂酒體風(fēng)格的差異性，本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)研究傳統(tǒng)清香型白酒兩個發(fā)酵時期的微生物群落及其動態(tài)演替規(guī)律，確定大楂和二楂發(fā)酵期的細菌優(yōu)勢菌群，為傳統(tǒng)清香型白酒發(fā)酵調(diào)控，產(chǎn)品風(fēng)格的穩(wěn)定性及安全性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

2015年5月至6月，于杏花村某酒企試驗分廠采集樣品。采集時間為大楂發(fā)酵0，3，7，10，15，17，21，23，28對時，二楂發(fā)酵0，3，7，10，15，21，23，28對時（生產(chǎn)上發(fā)酵時間用“對時”表示，發(fā)酵1對時表示發(fā)酵1 d），樣品編號分別以發(fā)酵時間標(biāo)記，共17個樣本。

1.2 主要試劑

DNA Marker，大連寶生物；Taq DNA聚合酶、dNTPs、溶菌酶，Sigma；蛋白酶K，Merck；去離子甲酰胺，Solarbio；N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺等。

1.3 酒醅中總DNA提取及高通量測序

采用閆亮珍等[8]描述的DNA提取法提取酒醅中細菌總DNA。采用核酸蛋白儀檢測DNA的濃度和純度?；谏虾Ｉ锕こ坦綢llumina MiSeq平臺完成測序。V3-V4區(qū)序列擴增引物是“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC”和“CCTACG GRRBGCASCAGKVRVGAAT”；V4-V5區(qū)序列擴增引物是“CTTGTGCGGKCCCCCGYCAATTC”和“GTGYCAGCMGCCGCGGTAA”。利用Mothur和QIIME（v1.8.0）對測序結(jié)果分析處理，去掉長度≤50bp的序列、含嵌合體的序列和質(zhì)量不好的序列，將相似度大于97%的序列聚類為一個操作分類單元（OTU，Operational Taxonomic Unit）。采用Ribosomal Database Program貝葉斯算法[9]對OTU代表性序列進行細菌種群分類學(xué)分析?；贠TU分析結(jié)果，采用樣本序列隨機抽樣的方法分別計算Chao1、Shannon等α多樣性指數(shù)，繪制稀釋曲線，評估樣品微生物多樣性。樣本間微生物群落差異通過weighted unifrac分析比較，通過PCoA（Principal Co-ordinates Analysis）可視化三維、二維圖展示。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測序結(jié)果

對大楂和二楂17個樣品中細菌的16S rRNA基因測序，測得原始序列條數(shù)分別為319 872，269 087條，過濾掉長度小于50 bp的序列、含嵌合體的序列和質(zhì)量不好的序列，獲得有效序列數(shù)304 961，240 488條。在97%相似度下將有效序列聚類，共獲得39 567，22 717個OTUs。

樣品稀釋曲線可反映測序深度。從圖1a可知，大楂8個樣品的稀釋曲線較平緩，表明所得序列基本反映酒醅中細菌群落結(jié)構(gòu)。樣品15的稀釋曲線呈上升趨勢，表明測序未達到飽和，繼續(xù)挖掘還可能產(chǎn)生新的OTU。從圖1b可知，二楂8個樣品稀釋曲線較平緩，說明所得序列基本反映酒醅中細菌群落結(jié)構(gòu)。

圖1 不同發(fā)酵階段樣品稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of samples in different fermentation time

2.2 酒醅樣品間Alpha多樣性分析

Alpha多樣性可通過豐富度指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、覆蓋率、辛普森指數(shù)等反映。由表1可知，大楂各樣品的覆蓋率在0.87～0.97之間變化，表明各樣品文庫的覆蓋率較高，基本能反映樣品細菌群落組成。細菌豐富度指數(shù)和chao1指數(shù)呈現(xiàn)低-高-低-高-低的變化趨勢，表明各樣品細菌多樣性有一定差異，菌群在發(fā)酵過程中動態(tài)變化；香農(nóng)指數(shù)在3.87～5.06之間波動，表明不同發(fā)酵階段微生物的多樣性在變化；其它指標(biāo)也表現(xiàn)出相同的變化規(guī)律。以上指數(shù)表明大楂發(fā)酵過程中細菌菌群多樣性呈動態(tài)，0～7對時細菌菌群多樣性降低；7～10對時細菌多樣性升高；10～17對時細菌多樣性略有降低；17～21對時細菌多樣性升高；21～28對時細菌多樣性降低。

表1 大楂樣品間Alpha多樣性統(tǒng)計Table1 Alpha diversity in different samples of Dacha

由表2可知，二楂樣品覆蓋率在0.94～0.99間變化，表明各樣品文庫的覆蓋率高，能反應(yīng)樣品細菌群落組成。細菌chao1指數(shù)呈現(xiàn)高-低-高-低的變化趨勢，表明各樣品細菌多樣性在發(fā)酵過程中動態(tài)變化。香農(nóng)指數(shù)在2.84～5.29之間較大波動變化，表明二楂不同發(fā)酵階段微生物的多樣性變化較大。其它指標(biāo)也表現(xiàn)出相同的變化規(guī)律。

表2 二楂樣品間Alpha多樣性統(tǒng)計Table2 Alpha diversity in different samples of Ercha

2.3 酒醅樣品間的生物多樣性分析

酒醅樣品間生物多樣性分析采用多變量統(tǒng)計學(xué)方法PCoA分析實現(xiàn)，并通過三維和二維圖顯示不同樣品中微生物種群的相似性及差異性。圖2a，2b是大楂發(fā)酵過程中樣品間PCoA三維散點圖，圖中各個點代表不同的樣本，樣本間相似度越高在空間上越聚集，反之，相似度越低空間距離越遠。由圖2a可知主成分1（P1）和主成分2（P2）在樣品差異性貢獻率上分別達到63.4%和14.6%，合計78.0%，是差異的主要來源。圖2b是P1和P2主成分分析PCoA二維散點圖，圖中不同的點代表不同的樣本，樣本間相似度越高在圖中越聚集，反之，相似度越低空間距離越遠。以上結(jié)果表明大楂酒醅發(fā)酵過程中微生物菌群分布顯著變化。

圖2 大楂各樣品細菌PCoA分析三維（a）和二維（b）散點圖Fig.2 PCoA results of microbial communities from the samples of Dacha

圖3a是二楂發(fā)酵過程中各樣品間PCoA三維散點圖。P1和P2在樣品差異性貢獻率上分別達到69.7%和21.2%，合計90.9%，是差異的主要來源。圖3b是P1和P2主成分分析PCoA二維散點圖。二楂酒醅發(fā)酵過程中微生物菌群分布顯著變化。

圖3 二楂各樣品細菌PCoA分析三維（a）和二維散點圖（b）Fig.3 PCoA results of microbial communities from the samples of Ercha

通過對大、二楂發(fā)酵過程中樣品PCoA分析，發(fā)現(xiàn)大楂和二楂發(fā)酵過程中Beta多樣性差異顯著，表明微生物菌群中在發(fā)酵的各階段變化規(guī)律不同，分析原因，推測是大楂、二楂發(fā)酵基質(zhì)及環(huán)境的不同造成的，這必將影響大楂和二楂白酒的質(zhì)量。

2.4 酒醅樣品門水平的細菌群落結(jié)構(gòu)分析

利用RDP classifier對各酒醅樣品中的OTU進行門、綱、目、科、屬的分類信息分析，結(jié)果表明大楂和二楂細菌菌群分布于15個門，分別是厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacterioidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、酸桿菌門（Acidobacteria）、衣原體門（Chlamydiae）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、藍細菌門（Cyanobacteria）、廣古菌門（Euryarchaeota）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、產(chǎn)金菌門（Deinococcus-Thermus）、梭桿菌門（Fusobacteria）。

大楂發(fā)酵階段，厚壁菌門是優(yōu)勢菌群，占到各發(fā)酵時期細菌種群的23.26%～97.48%。在0對時，厚壁菌門僅占該時期細菌種群的23.26%；0～7對時所占比例越來越高，達95.35%；7～10對時所占比例下降；10～17對時所占比例又升高；17～21對時所占比例又降低，21～23對時所占比例又略升高，23～28對時又降低。變形菌門為發(fā)酵起始的優(yōu)勢群體，占該時期細菌種群的68.39%，發(fā)酵過程中變形菌門比例迅速降低，7～10對時升高，10～17對時又降低，17～21對時又升高，21～28對時降低又升高（圖4）。以上結(jié)果表明在大楂的整個發(fā)酵過程中細菌種群此消彼長，動態(tài)變化。

圖4 大楂樣品細菌在門分類水平上的分布Fig.4 Frequence of phylum in microbial communities from samples of Dacha

二楂發(fā)酵階段，厚壁菌門是優(yōu)勢種群，占到各發(fā)酵時期細菌種群的3.48%～98.12%（圖5）。0對時樣品菌群多樣性高，厚壁菌門所占比例較低，僅3.48%；0～3對時，所占比例迅速升高；3對時以后，一直維持較高水平。變形菌門為發(fā)酵起始的優(yōu)勢群體，達51.35%，0～3對時降到3.67%，之后一直維持在較低的水平。

圖5 二楂樣品細菌在門分類水平上的分布Fig.5 Frequence of phylum in microbial communities from samples Ercha

大楂與二楂發(fā)酵過程中細菌多樣性變化具有一定的相似性和相異性。相似性是厚壁菌門、變形菌門，它們是發(fā)酵過程中主要的細菌類群，在發(fā)酵過程中豐度呈動態(tài)變化。相異性是大楂發(fā)酵過程中菌群結(jié)構(gòu)變動較大。

2.5 酒醅樣品間屬水平的細菌群落分布

大楂細菌群落測序結(jié)果顯示，酒醅中細菌組成比例較高的屬分別是乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、泛菌屬（Pantoea）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、Anderseniella、浮霉?fàn)罹鷮伲≒lanctomyces）、乳球菌屬（Lactococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和其它未分類菌。

大楂細菌群落TOP15熱圖分析見圖6，可知：1）大楂發(fā)酵過程中樣品間細菌屬多樣性及組成的相對豐度具有一定差異性。2）將各樣品間細菌屬水平聚類，可將大楂各樣品聚成4類：樣品3和7，樣品15、17、23和28，樣品10和21分別聚在一起，樣品0獨立分支，這表明發(fā)酵過程中各細菌屬動態(tài)變化，此消彼長，順序生長。圖7是大楂樣品在細菌屬水平上的分布。乳桿菌屬是大楂發(fā)酵各階段的主要微生物，在發(fā)酵起始，其含量僅為5.39%；在發(fā)酵過程中迅速升高，在40.77%～83.26%之間變化。片球菌屬在大楂酒醅中動態(tài)變化，在發(fā)酵初期僅占0.4%，在0～7對時迅速增長到29.76%，7～10對時降到2.71%，10～15對時升到8.44，15對時逐漸降到1.15%。芽孢桿菌屬在發(fā)酵0對時含量較高，而在酒醅發(fā)酵過程中迅速降低。明串珠菌屬在發(fā)酵初始含量較高，達11.99%，在發(fā)酵過程中逐漸降低后升高；在15對時以后又降低，表明其在發(fā)酵的前、中期發(fā)揮功能?？傊?，大楂發(fā)酵過程中細菌屬水平具有多樣性。優(yōu)勢種群的種類和數(shù)量的動態(tài)變化，影響白酒的品質(zhì)。

圖6 大楂發(fā)酵過程中不同樣品間的細菌熱圖Fig.6 Heatmap of the bacteria in different samples of Dacha

圖7 大楂樣品細菌在屬水平上的分布Fig.7 Frequence of genus in microbial communities from samples of Dacha

二楂細菌群落測序結(jié)果顯示其細菌組成比例較高的屬分別是乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、Anderseniella、浮霉?fàn)罹鷮伲≒lanctomyces）、乳球菌屬（Lactococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、魏斯氏菌屬（Weissella）和其它未分類菌。二楂細菌群落TOP15熱圖分析見圖8，可知：1）二楂發(fā)酵時期樣品間屬水平細菌具有一定的豐度，各樣品細菌組成有一定的差異性和相似性。2）依據(jù)樣品間屬水平的聚類關(guān)系，可將二楂發(fā)酵過程樣品分成3類，即3，7，10，15對時樣品，17，23，28對時樣品分別聚在一起，0樣品對時獨立分支，說明在發(fā)酵過程中細菌菌群動態(tài)變化較大，且此消彼長，順序生長，這影響二楂白酒的質(zhì)量與風(fēng)味。圖9反映二楂發(fā)酵過程中屬水平細菌群落組成情況。乳桿菌屬是發(fā)酵各階段的主要微生物，其含量在發(fā)酵初期較低，僅占2.4%，在發(fā)酵過程中含量迅速增高，并維持較高的水平，0～15對時占74.32%～78.63%，15對時以后，所占比例迅速升高到99.35%。葡萄球菌屬在15對時以前占有一定的比例，15對時以后消失，表明其主要在發(fā)酵前期生長繁殖，發(fā)酵后期基本消失?？傊?，二楂起始發(fā)酵階段細菌屬菌群豐富，在發(fā)酵過程中主要生長的細菌為乳桿菌屬，它在二楂的發(fā)酵過程中快速生長繁殖，影響白酒的風(fēng)味和質(zhì)量。

圖8 二楂發(fā)酵過程中不同樣品間的細菌熱圖Fig.8 Heatmap of the bacteria in different samples of Eacha

圖9 二楂樣品細菌在屬分類水平上的分布Fig.9 Frequence of genus in microbial communities from samples of Eacha

3 討論

利用純培養(yǎng)技術(shù)獲得的微生物種類不到自然界微生物種類總量的1%[10]。利用傳統(tǒng)微生物分離技術(shù)，全面了解樣品中微生物的種類及作用幾乎不可能。高通量測序技術(shù)的誕生及技術(shù)升級，推動了宏基因組學(xué)的快速發(fā)展，使得生態(tài)環(huán)境中微生物的全貌快速地解析成為了可能[11-12]。近年來，高通量測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)釀造食品生產(chǎn)環(huán)境中微生物檢測，在傳統(tǒng)釀造食品功能性微生物發(fā)現(xiàn)、發(fā)酵機制研究及發(fā)酵條件的控制、有害微生物的防控、產(chǎn)品品質(zhì)提升等方面具有重要意義[13-15]。

白酒悠久的生產(chǎn)歷史，適宜的氣候條件，開放式的固態(tài)發(fā)酵體系，使其發(fā)酵過環(huán)境中存在大量馴化了的功能性細菌參與釀造，為傳統(tǒng)白酒品質(zhì)的穩(wěn)定性提供保障[16]。本研究完成了傳統(tǒng)清香型白酒大楂、二楂發(fā)酵過程中酒醅細菌高通量測序，結(jié)果表明，大楂、二楂發(fā)酵過程中優(yōu)勢細菌主要為葡萄球菌屬、片球菌屬、乳桿菌屬，這些細菌在種類及數(shù)量上隨著發(fā)酵時間的推移而有所變化，這必將對清香型白酒的品質(zhì)產(chǎn)生影響。芽孢桿菌屬在一些白酒發(fā)酵過程中是優(yōu)勢菌群[17]，而在清香型白酒酒醅發(fā)酵過程中其含量相對較低。另外，還發(fā)現(xiàn)片球菌屬在大楂和二楂的發(fā)酵前期為優(yōu)勢菌群，發(fā)酵后期消失；葡萄球菌屬在二楂發(fā)酵前期可檢測到，15對時以后消失。那么，這些菌在酒醅中此消彼長，動態(tài)變化，與酒醅理化指標(biāo)的變化及白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成具有怎樣的相關(guān)性，有待后期研究。