郭 芹 陳 爽，2 鄭佳麗，2 李慶鵬 王 強(qiáng)* 哈益明

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100193

2 北京石油化工學(xué)院 北京102617）

亞麻酸（C18：3-9c，12c，15c）是較復(fù)雜、絕大多數(shù)植物油中含量較高的一類不飽和脂肪酸，在植物油脂中以亞麻酸甘油三酯的形式存在，尤其是西北地區(qū)常用的亞麻籽油和紫蘇油，其含量達(dá)50%~65%，具有降血壓、抗癌等作用[1]。植物油在精煉過程中，30%以上的亞麻酸發(fā)生異構(gòu)，生成1%～4%的C18：3-9c，12t，15c、C18：3-9c，12c，15t、C18：3-9t，12c，15c、C18：3-9c，12t，15t、C18：3-9t，12c，15t等反式亞麻酸（TLNAs）[2-3]，在煎、炒、炸等烹飪過程TLNAs含量會(huì)持續(xù)增加[4-5]。大量攝入TLNAs能夠誘發(fā)心腦血管疾病特別是增加冠心病的發(fā)病率[6]。研究證實(shí)TLNAs異構(gòu)體的攝入量每人每天不超過5～6 mg，其中C18：3-9t，12c，15c和C18：3-9c，12c，15t的攝入各不超過2 mg，C18：3-9c，12t，15c和C18：3-9t，12c，15t的總量攝入不超過2mg[7]，因此，控制熱加工過程TLNAs生成極其重要。

L-抗壞血酸棕櫚酸酯（L-AP），具脂溶性和食品乳化性，是世界衛(wèi)生組織和食品添加劑聯(lián)合委員會(huì)認(rèn)可的一種新型、多功能的食品添加劑。研究表明L-AP具有較好的抗氧化性[8-9]，其抗氧化作用隨著添加量的增加而增強(qiáng)[10]。賀凡等[11]研究表明L-AP還具有抗異構(gòu)作用，其抗異構(gòu)效果顯著高于VE、TBHQ、鼠尾草酸和茶多酚。L-AP如何抑制反式脂肪酸（TFAs）的形成仍待解決。氣相色譜（GCFID）是分析食用油脂中TFAs的常用方法，目前推薦使用的強(qiáng)極性氰丙基聚硅氧烷型色譜柱SP-2560、BPX-70、CP-Sil88和HP-88等[12-15]都無(wú)法將亞麻酸順反異構(gòu)體完全分離，而新的高極性離子液色譜柱能明顯提高反式亞麻酸異構(gòu)體的分離效果[16]。

由于油脂體系復(fù)雜，脂肪酸種類繁多，脂肪酸之間相互轉(zhuǎn)化，成為TFAs機(jī)理研究的瓶頸。本研究以亞麻酸甘油三酯為研究對(duì)象，模擬食用油的熱加工，采用高極性離子液氣相色譜柱分析L-AP對(duì)亞麻酸甘油三酯熱致異構(gòu)反式產(chǎn)物形成動(dòng)力學(xué)的影響，闡明L-AP對(duì)反式亞麻酸形成的作用機(jī)理，為采取有效措施準(zhǔn)確控制TFAs的形成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

亞麻酸甘油三酯（純度為99%），Nu-CHEK；亞麻酸甲酯順反異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma-Aldrich；氫氧化鉀、丙酮、甲醇，分析純，國(guó)藥集團(tuán)；異辛烷，色譜級(jí)，F(xiàn)isher Scientific；甲基硅油，黏度為500 mm2/s，北京頂業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平（Scout ProTM/600 g），奧豪斯儀器公司；氣相色譜儀（GC-2010），日本島津公司；高極性離子液色譜柱（SLB-IL111，200m×0.25mm×0.2μm），美國(guó)安捷倫科技有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)（Neofuge 15R），力康生物科技有限公司；集熱式恒溫加熱器（DF-101S），予華儀器有限責(zé)任公司；漩渦混合儀（QL-901），海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高溫加熱方法 準(zhǔn)確稱取1 g亞麻酸甘油三酯樣品于3mL安瓿瓶中，加入0.02%L-AP，以未加0.02%L-AP的樣品為對(duì)照樣（CK），利用氮吹儀將含樣品的安瓿瓶通入N2（5mL/min，5min）后，立即用氫火焰熔封機(jī)封口，置于200，220，230和240℃的硅油浴中加熱2，4，8，12，16，24，32和48 h，加熱溫度誤差控制在±1℃，加熱到設(shè)定時(shí)間，立即取出，室溫冷卻，于-20℃冰箱保存。

1.3.2 油脂樣品的氣相色譜檢測(cè)方法 油脂樣品酯化參照Guo等[17]的甲酯化方法。氣相色譜的操作參數(shù)：SLB-IL111毛細(xì)色譜柱的初始溫度60℃，保留5min，以20℃/min升溫至175℃，保持15min，再以1℃/min的速度升至185℃，保留70 min；進(jìn)樣口溫度230℃；色譜柱流量0.6mL/min。氫火焰檢測(cè)器溫度250℃；進(jìn)樣量1μL；分流比60∶1；空氣尾吹流量30.0mL/min；氫氣流量40 mL/min；空氣流量400mL/min；載氣，高純氮。脂肪酸含量的計(jì)算方法參照李安等[18]的內(nèi)標(biāo)方法計(jì)算。

1.3.3 反式亞麻酸異構(gòu)體的形成動(dòng)力學(xué)研究 亞麻酸甘油三酯熱致異構(gòu)反式產(chǎn)物的形成動(dòng)力學(xué)方程如下：

式中，C——反式產(chǎn)物含量（g/100g）；k——反應(yīng)速率常數(shù)；n——反應(yīng)級(jí)數(shù)；t——反應(yīng)時(shí)間（h）。方程（1）積分得（C0到Ct；t=0到t=t）：

該積分公式在n≥2時(shí)有效。若反應(yīng)級(jí)數(shù)為零級(jí)反應(yīng)（n=0），反式產(chǎn)物濃度與其初始濃度無(wú)關(guān)，僅與加熱溫度和加熱時(shí)間有關(guān)，則方程（2）為：

若反應(yīng)級(jí)數(shù)為一級(jí)反應(yīng)（n=1），則方程（2）變?yōu)椋?/p>

測(cè)定不同加熱溫度和加熱時(shí)間反式產(chǎn)物的濃度，擬合曲線。R2值高的被認(rèn)為是合理的動(dòng)力學(xué)曲線圖，用來確定反應(yīng)級(jí)數(shù)和計(jì)算速率常數(shù)。熱致異構(gòu)反應(yīng)的活化能（Ea）可通過加熱溫度和反應(yīng)速率計(jì)算。反應(yīng)速率和反應(yīng)溫度之間的關(guān)系可用阿倫尼烏斯公式表示：

式中，A--指前因子；R——理想氣體通用常數(shù)；Ea——活化能，根據(jù)ln k-T-1曲線圖計(jì)算。當(dāng)n≥2級(jí)，熱致異構(gòu)反式產(chǎn)物濃度、溫度和時(shí)間數(shù)學(xué)模型：

零級(jí)反應(yīng)，熱致異構(gòu)反式產(chǎn)物濃度、溫度和時(shí)間數(shù)學(xué)模型：

一級(jí)反應(yīng)，熱致異構(gòu)反式產(chǎn)物濃度、溫度和時(shí)間數(shù)學(xué)模型：

1.4 數(shù)據(jù)分析

油脂樣品經(jīng)GC-FID分析，反式異構(gòu)體含量采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算。每次試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，用SigmaPlot 10.0（Systat Software Inc.，San Jose，CA，USA）作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-AP對(duì)亞麻酸甘油三酯熱致異構(gòu)反式產(chǎn)物的影響

亞麻酸順反異構(gòu)體的極性相近，很難將其色譜峰分開。本研究選擇一種新的高極性離子液-氣相色譜柱分離亞麻酸順反異構(gòu)體。由圖1a可知，8種亞麻酸順反異構(gòu)體的分離度R≥0.9，說明相鄰兩異構(gòu)體基本分離，分離效果高于GB/T22507推薦的SP-2560和CP-Sil88色譜柱[12]，也明顯優(yōu)于SP-2380[19]、BPX-70和HP-88色譜柱[20]。Gomez-Cortes等[16]采用100 m的SLB-IL111色譜柱和Delmonte等[21-22]采用100 m及200 m的SLBIL111色譜柱分離亞麻酸順反異構(gòu)體的效果都低于本研究的分離效果。

亞麻酸甘油三酯在200~240℃的條件下加熱生成5種反式異構(gòu)體，其中有3種單反式異構(gòu)體（C18：3-9t，12c，15c、C18：3-9c，12t，15c和C18：3-9c，12c，15t）和2種雙反式異構(gòu)體（C18：3-9t，12c，15t和C18：3-9t，12t，15c）（圖1b，1c），且生成的反式異構(gòu)體含量隨著加熱溫度和時(shí)間的增加而增加。L-AP能抑制單反式和雙反式異構(gòu)體的生成，與賀凡等[11]的研究一致。

圖1 亞麻酸順反異構(gòu)體標(biāo)品及加入和未加入L-AP亞麻酸甘油三酯在200℃和240℃加熱12 h的氣相色譜圖Fig.1 Chromatogram of linolenic acid cis-trans isomers standards and trilinolenin heated at 200℃and 240℃for 12 h in the absence（CK）and presence of L-AP

2.2 L-AP對(duì)單反式異構(gòu)體形成動(dòng)力學(xué)的影響

C18：3-9t，12c，15c在200℃形成動(dòng)力學(xué)研究表明：零級(jí)反應(yīng)的R2值為0.9742，高于一級(jí)反應(yīng)（0.773）（表1）。加入L-AP，C18：3-9t，12c，15c形成的零級(jí)反應(yīng)和一級(jí)反應(yīng)R2值分別為0.9682和0.7794（表1），說明C18：3-9t，12c，15c的形成反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)，加入L-AP不影響C18：3-9t，12c，15c的形成反應(yīng)級(jí)數(shù)，并且加熱溫度對(duì)反應(yīng)級(jí)數(shù)無(wú)影響。從圖1a可知，C18：3-9t，12c，15c在200~220℃的生成量隨著加熱時(shí)間的增加而增加，而在230~240℃加熱12 h后，其生成量呈下降趨勢(shì)（圖中未列出），說明高溫長(zhǎng)時(shí)間加熱C18：3-9t，12c，15c的形成速率低于降解速率。在線性范圍內(nèi)，C18：3-9t，12c，15c的形成反應(yīng)速率（k）為0.2364 g/（100g·h）（200℃）、0.3770 g/（100g·h）（220℃）、0.7771 g/（100g·h）（230℃）和1.0246 g/（100 g·h）（240℃）；在相同的加熱溫度下L-AP能降低其形成速率，抑制率分別為7.6%，5.6%，10.93%和17.77%（表2）。

加入和未 加入L-AP，C18：3-9c，12t，15c和C18：3-9c，12c，15t形成的零級(jí)反應(yīng)R2值高于一級(jí)反應(yīng)（表1），說明這兩種異構(gòu)體形成的反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)。在200～220℃加熱，C18：3-9c，12t，15c和C18：3-9c，12c，15t的生成量隨著加熱時(shí)間的增加而增加（圖1b和圖1c），而C18：3-9c，12t，15c在240℃加熱16 h和C18：3-9c，12c，15t在230～240℃加熱12 h后，由于降解速率大于異構(gòu)速率，其生成量呈下降趨勢(shì)（圖中未列出）。在線性范圍內(nèi)，這兩種異構(gòu)體的形成速率隨加熱溫度和時(shí)間的增加而增加，且L-AP能降低其形成反應(yīng)速率（表2）。

表1 加入和未加入L-AP形成反式亞麻酸異構(gòu)體反應(yīng)級(jí)數(shù)的相關(guān)系數(shù)（R2 ）Table1 Correlation coefficients（R2 ）of formed trans linolenic acid isomers in the absence（CK）and presence of L-AP

從表2可知，在200～230℃，亞麻酸甘油三酯加熱生成單反式異構(gòu)體的速率增長(zhǎng)較快，溫度高于230℃，異構(gòu)速率的增長(zhǎng)較慢，且單反式異構(gòu)體的形成速率C18：3-9c，12c，15t＞C18：3-9t，12c，15c＞C18：3-9c，12t，15，說明亞麻酸甘油三酯高溫加熱先形成C18：3-9c，12c，15t，再依次生成C18：3-9t，12c，15c和C18：3-9c，12t，15c。L-AP對(duì)這3種異構(gòu)體的抑制率從大到小依次是C18：3-9c，12c，15t、C18：3-9t，12c，15c和C18：3-9c，12t，15c異構(gòu)體。以上研究也說明，亞麻酸甘油三酯在高溫加熱過程中亞麻酸鏈上15位氫先發(fā)生異構(gòu)，后是9位和12位的氫發(fā)生異構(gòu)；與油脂中的亞油酸甘油三酯的異構(gòu)一致，先是亞油酸鏈上的12位氫發(fā)生異構(gòu)，后是9位氫發(fā)生異構(gòu)[17]。也就是說油脂中的這一類多不飽和脂肪酸的熱致異構(gòu)形成單反式異構(gòu)體的異構(gòu)位置先發(fā)生在離羰基較遠(yuǎn)雙鍵的碳?xì)滏I，再是離羰基最近雙鍵的碳?xì)滏I，最后是中間位置的碳?xì)滏I?？梢?，L-AP對(duì)油脂中亞麻酸熱致異構(gòu)形成單反式異構(gòu)體的抑制作用位點(diǎn)優(yōu)先發(fā)生在離羰基較遠(yuǎn)雙鍵的15位氫上，再是最近雙鍵的9位氫上，最后是12位的氫上。

從圖2d-2f可知，C18：3-9t，12c，15c、C18：3-9c，12t，15c和C18：3-9c，12c，15t的ln k與1/T的線性關(guān)系較好（R2＞0.92），根據(jù)圖中曲線計(jì)算的活化能如表2所示，這3種異構(gòu)體的活化能分別為68.87，95.41，68.77 kJ/mol，這也解釋了C18：3-9c，12c，15t的生成量高于C18：3-9t，12c，15c和C18：3-9c，12t，15c，是因?yàn)樾纬蒀18：3-9c，12c，15t所要跨越的能壘低于C18：3-9t，12c，15c和C18：3-9c，12t，15c。加入L-AP后，形成這3種單反式異構(gòu)體的活化能增加，所要跨越的能壘也增加，生成單反式異構(gòu)體更難。

2.3 L-AP對(duì)雙反式異構(gòu)體形成動(dòng)力學(xué)的影響

加入和未加入L-AP，亞麻酸甘油三酯加熱形成C18：3-9t，12c，15t和C18：3-9t，12t，15c的零級(jí)反應(yīng)R2值大于一級(jí)反應(yīng)，說明C18：3-9t，12c，15t和C18：3-9t，12t，15c的形成反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)（表1）。從圖3a可知，C18：3-9t，12c，15t在200℃～240℃的生成量隨著加熱時(shí)間的增加而增加，而在200℃加熱8 h無(wú)C18：3-9t，12c，15t生成。在240℃加熱28 h后C18：3-9t，12c，15t的生成量呈下降趨勢(shì)（圖中未列出）。從圖3b可知，亞麻酸甘油三酯在200℃和220℃加熱16 h，230℃加熱12 h，240℃加熱4 h無(wú)C18：3-9t，12t，15c生成。在240℃加熱28 h后C18：3-9t，12c，15t的生成量呈下降趨勢(shì)（圖中未列出）。在線性范圍內(nèi)，C18：3-9t，12c，15t和C18：3-9t，12t，15c的形成反應(yīng)速率隨著加熱溫度和時(shí)間的增加而增加，L-AP能降低C18：3-9t，12c，15t和C18：3-9t，12t，15c異構(gòu)體的形成速率（表2）。

圖2 未加和加入L-AP亞麻酸甘油三酯熱致異構(gòu)單反式異構(gòu)體濃度與時(shí)間的關(guān)系圖以及單反式異構(gòu)體ln k與1/T圖Fig.2 Plots showing the correlation between thermally induced single trans isomers concentrations of trilinolenin and time，and the relationship between ln k and 1/T for single trans isomers in the absence（CK）and presence of L-AP

由表1可知，雙反式異構(gòu)體的形成速率明顯低于單反式異構(gòu)體的形成速率，再次證明亞麻酸甘油三酯熱致異構(gòu)先形成單反式異構(gòu)體，后形成雙反式異構(gòu)體。雙反式C18：3-9t，12c，15t形成速率明顯高于C18：3-9t，12t，15c的形成速率，說明單反式異構(gòu)體在加熱過程中先形成雙反式C18：3-9t，12c，15t，再形成雙反式C18：3-9t，12t，15c。根據(jù)單反式異構(gòu)體的形成分析可知，亞麻酸甘油三酯中的亞麻酸鏈上15位和9位的氫比12位的氫更容易發(fā)生熱致異構(gòu)，說明雙反式C18：3-9t，12c，15t異構(gòu)體主要由單反式C18：3-9t，12c，15c和C18：3-9c，12c，15t異構(gòu)生成，C18：3-9t，12t，15c異構(gòu)體主要由單反式C18：3-9t，12c，15c和C18：3-9c，12t，15c異構(gòu)生成。

表2 L-AP對(duì)亞麻酸甘油三酯熱致異構(gòu)反式產(chǎn)物形成動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響Table2 Effects of L-AP on the kinetic parameters of thermally induced trans products of trilinolenin

圖3 未加和加入L-AP亞麻酸甘油三酯熱致異構(gòu)雙反式異構(gòu)體濃度與加熱時(shí)間的關(guān)系圖以及雙反式異構(gòu)體ln k與1/T圖Fig.3 Plots showing the correlation between thermally induced double trans isomers concentrations of trilinolenin and heating time，and the relationship between ln k and 1/T for double trans isomers in the absence（CK）and presence of L-AP

L-AP對(duì)亞麻酸甘油三酯在200℃加熱生成的雙反式C18：3-9t，12c，15t的抑制率為6.3%，明顯低于同溫度下單反式C18：3-9c，12c，15t（7.8%）、C18：3-9c，12t，15c（9.8%）和C18：3-9t，12c，15c（7.6%）的抑制率。L-AP對(duì)亞麻酸甘油三酯在240℃加熱生成的雙反式C18：3-9t，12c，15t和C18：3-9t，12t，15c的抑制率分別為16%和9.38%，也低于同溫度下單反式C18：3-9c，12c，15t（16.3%）、C18：3-9c，12t，15c（16.56%）和C18：3-9t，12c，15c（17.77%）的抑制率。以上說明L-AP對(duì)亞麻酸甘油三酯熱致異構(gòu)反式產(chǎn)物的抑制作用主要是通過抑制單反式異構(gòu)體的形成來降低反式亞麻酸的生成。

從圖3c和3d可知，C18：3-9t，12c，15t和C18：3-9t，12t，15c的ln k與1/T圖的線性關(guān)系較好（R2＞0.93）。雖然形成雙反式C18：3-9t，12c，15t所要跨越的能壘（160.44 kJmo/l）高于形成C18：3-9t，12t，15c所要跨越的能壘（143.88 kJ/mol），但雙反式C18：3-9t，12c，15t的形成速率更快，C18：3-9t，12c，15t的生成量高于C18：3-9t，12t，15c的生成量。從表2可知，形成雙反式異構(gòu)體的活化能明顯高于形成單反式異構(gòu)體的活化能，說明形成雙反式異構(gòu)體更困難。加入L-AP后，形成雙反式異構(gòu)體的活化能增加，其增加量明顯低于形成單反式異構(gòu)體活化能的增加量，再次說明L-AP的抑制作用位置主要是抑制單反式異構(gòu)體的形成。根據(jù)表2中的速率常數(shù)和活化能建立了亞麻酸甘油三酯熱致異構(gòu)反式產(chǎn)物濃度與加熱溫度和時(shí)間的預(yù)測(cè)模型，根據(jù)加熱溫度和時(shí)間來預(yù)測(cè)各反式異構(gòu)體濃度。

表3 未加和加入L-AP亞麻酸甘油三酯熱致異構(gòu)反式產(chǎn)物濃度與加熱時(shí)間和溫度的數(shù)學(xué)模型Table3 The mathematical model of thermally induced trans products concentration of trilinolenin，heating time and temperature in the absence（CK）and presence of L-AP

3 結(jié)論

采用200m高極性離子液毛細(xì)管色譜柱對(duì)8種亞麻酸順反異構(gòu)體進(jìn)行有效分離。3種反式和2種雙反式異構(gòu)體的形成反應(yīng)屬于零級(jí)反應(yīng)，形成反應(yīng)速率隨加熱溫度和時(shí)間的增加而增加，并證實(shí)亞麻酸甘油三酯熱致異構(gòu)先生成單反式異構(gòu)體，后生成雙反式異構(gòu)體。L-AP不會(huì)改變單反式和雙反式異構(gòu)體的形成反應(yīng)級(jí)數(shù)，能明顯降低反式異構(gòu)體的形成速率，其主要作用位置是抑制單反式異構(gòu)體的形成，主要作用位點(diǎn)是先阻止亞麻酸甘油三酯中亞麻酸鏈上15位氫發(fā)生異構(gòu)，后是9位和12位的氫發(fā)生異構(gòu)。此外，建立了L-AP存在條件下反式亞麻酸濃度與加熱溫度和時(shí)間的預(yù)測(cè)模型。