蔡麗朋，周 琪

（江西青峰藥業(yè)有限公司，江西 贛州 341000）

替格瑞洛是英國阿斯利康公司研發(fā)的一種選擇性小分子抗凝血藥物，用于治療急性冠狀動(dòng)脈綜合征（ACS）[1]。替格瑞洛含有6 個(gè)手性中心，理論上有2（664）個(gè)異構(gòu)體。對(duì)于本公司研制的替格瑞洛原料藥，從合成工藝路線考慮，在成品的質(zhì)量控制中主要需要控制5 種異構(gòu)體：對(duì)映異構(gòu)體A、非對(duì)映異構(gòu)體B、非對(duì)映異構(gòu)體C，非對(duì)映異構(gòu)體D 及非對(duì)映異構(gòu)體E，替格瑞洛及需控制的異構(gòu)體結(jié)構(gòu)見圖1。文獻(xiàn)[2-3]提到了替格瑞洛及其部分異構(gòu)體的測(cè)定方法，但是控制的異構(gòu)體種類與本公司擬定的控制種類有差異，方法不適用。本研究建立依據(jù)擬定的雜質(zhì)譜測(cè)定替格瑞洛異構(gòu)體含量的方法，并參照《中國藥典》2020年版四部通則9101[4]和ICH Q2[5]要求進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

圖1 替格瑞洛及需要控制的各異構(gòu)體結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of ticagrelor and the isomers that need to be controlled

1 儀器與試劑

1.1 儀器

XS105DU 型電子天平（Mettler Toledo 公司）；Waters e2695-2489 型高效液相色譜儀。

1.2 試藥與試劑

替格瑞洛對(duì)照品（自制，含量99.6%）；替格瑞洛原料藥（自制，含量99.1%）；異構(gòu)體A 對(duì)照品（山東博洛德生物科技有限公司（下稱博洛德），純度為99.36%）；異構(gòu)體B 對(duì)照品（博洛德，純度為98.85%）；異構(gòu)體C 對(duì)照品（博洛德，純度為99.36%）；異構(gòu)體DE 混合對(duì)照品（博洛德，純度為95.38%）；無水乙醇、正己烷和異丙醇為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Phenomenex Lux Cellulose -2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為無水乙醇-正己烷-異丙醇-二乙胺（體積比為55:40:5:0.5）；柱溫為20 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積為50 μL。

2.2 溶液的配制

（1）空白溶劑：異丙醇。

（2）供試品溶液配制：取本品適量，精密稱量，加溶劑溶解并定量稀釋制成每毫升含替格瑞洛0.25 mg 的溶液。

（3）對(duì)照液配制：精密量取供試溶液1.0 mL，置于100 mL 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻。

（4）系統(tǒng)適用性溶液的配制：取替格瑞洛及異構(gòu)體A、異構(gòu)體B、異構(gòu)體C、異構(gòu)體DE 混合對(duì)照品各適量，精密稱定，用溶劑溶解并定量稀釋制成每毫升中含替格瑞洛0.25 mg、上述異構(gòu)體2.5 μg 的溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性要求與結(jié)果計(jì)算

系統(tǒng)適用性要求：替格瑞洛與異構(gòu)體C 的分離度不小于2.0。單個(gè)異構(gòu)體含量按式（1）計(jì)算。

單個(gè)異構(gòu)體含量（%）=A異構(gòu)體×f÷A對(duì)照×1%（1）

式（1）中：A異構(gòu)體為供試液中各異構(gòu)體峰的峰面積；f 為各異構(gòu)體校正因子；A對(duì)照為對(duì)照液中主峰面積。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

2.4.1 專屬性

分別進(jìn)樣空白溶劑、各個(gè)異構(gòu)體的定位溶液及系統(tǒng)適用性溶液，系統(tǒng)適用性典型譜圖見圖2。從圖2 可知，空白溶劑不干擾待測(cè)物的測(cè)定，出峰順序依次為：異構(gòu)體DE 第1 個(gè)峰（保留時(shí)間為9.609 min），異構(gòu)體DE 第2 個(gè)峰（保留時(shí)間為10.834 min），異構(gòu)體A（保留時(shí)間為13.368 min），異構(gòu)體B（保留時(shí)間為15.103 min），異構(gòu)體C（保留時(shí)間為24.148 min）和替格瑞洛（保留時(shí)間為29.498 min），替格瑞洛與異構(gòu)體C 分離度為2.2。

圖2 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of system suitability solution

2.4.2 系統(tǒng)適用性

取系統(tǒng)適用性溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，異構(gòu)體DE 第1 個(gè)峰的保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.50%，峰面積RSD 為1.30%；異構(gòu)體DE 第2個(gè)峰的保留時(shí)間RSD 為0.43%，峰面積RSD 為1.22%；異構(gòu)體A 的保留時(shí)間RSD 為0.34%，峰面積RSD 為0.97%；異構(gòu)體B 的保留時(shí)間RSD 為0.31%，峰面積RSD 為1.15%；異構(gòu)體C 的保留時(shí)間RSD 為0.20%，峰面積RSD 為1.37%；替格瑞洛的保留時(shí)間RSD 為0.18%，峰面積RSD 為1.20%。表明本方法的系統(tǒng)適用性良好。

2.4.3 靈敏度

精密稱取各異構(gòu)體對(duì)照品，配制成混合溶液，逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣檢測(cè)，當(dāng)信噪比為約10 左右作定量限。定量限測(cè)試結(jié)果：異構(gòu)體DE 第1 個(gè)峰與第2 個(gè)峰的絕對(duì)檢測(cè)量均為2.5 ng，相對(duì)供試濃度均為0.02%；異構(gòu)體A、異構(gòu)體B 與異構(gòu)體C的絕對(duì)檢測(cè)量均為5.0 ng，相對(duì)供試濃度均為0.04%。

2.4.4 線性與范圍

精密稱取各異構(gòu)體和替格瑞洛對(duì)照品，配制成混合溶液，逐級(jí)稀釋，配制成相對(duì)供試品濃度在0.05%～0.25%的溶液6 份，依2.1 項(xiàng)下色譜方法檢測(cè)，以溶液中各組分的峰面積A 對(duì)相應(yīng)的溶液濃度C 進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如下：異構(gòu)體DE 線性方程為y=72662x-523.62，范圍為0.1247～0.6233 μg/mL，r 為0.9991；異構(gòu)體A的線性方程為y=86911x-349.56，范圍為0.1257～0.6286 μg/mL，r 為0.9999；異構(gòu)體B 的線性方程為y=91471x-318.87，范圍為0.1231～0.6157 μg/mL，r為0.9996；異構(gòu)體C 的線性方程為y=83972x-556.46，范圍為 0.1246～0.6228 μg/mL，r 為0.9998；替格瑞洛的線性方程為y=91443x+401.64，范圍0.1243～0.6215 μg/mL，r 為0.9995。

2.4.5 校正因子

采用各組分線性方程（y=kx+b）中斜率（k）的比值計(jì)算各異構(gòu)體相對(duì)主成分的校正因子，公式為：f=k主成分/k異構(gòu)體。一般情況下，校正因子在0.9～1.1 時(shí)可不予校正，即可以以1 計(jì)。各異構(gòu)體的f計(jì)算結(jié)果：異構(gòu)體DE：0.80、異構(gòu)體A：0.95（以1計(jì)）、異構(gòu)體B：1.00（以1 計(jì)）、異構(gòu)體C：0.92（以1 計(jì)）。

2.4.6 精密度

由實(shí)驗(yàn)員A 配制6 份供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜方法測(cè)定；由實(shí)驗(yàn)員B 在不同的時(shí)間配制6 份供試品溶液，采用不同的儀器，依2.1 項(xiàng)下色譜方法測(cè)定，比較12 份樣品的檢測(cè)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)人員A 測(cè)定6 份供試品溶液，只檢出異構(gòu)體C，含量在0.06%～0.07%之間，RSD 為6.6%，未檢出其他異構(gòu)體；實(shí)驗(yàn)人員B 測(cè)定6 份供試品溶液，只檢出異構(gòu)體C，含量在0.05%～0.06%之間，RSD為9.1%，未檢出其他異構(gòu)體；12 份供試品溶液異構(gòu)體C 的RSD 為8.7%。表明本方法精密度良好。

2.4.7 準(zhǔn)確度

精密稱取替格瑞洛原料藥適量，置于不同的9 個(gè)量瓶中，分別加入各異構(gòu)體儲(chǔ)備液，配制成含替格瑞洛相對(duì)供試品溶液濃度為100%，各異構(gòu)體相對(duì)供試品溶液濃度（報(bào)告限[6]濃度）為0.05%（平行3 份）、相對(duì)供試品溶液濃度（限度濃度）為0.15%（平行3 份）、相對(duì)供試品溶液濃度為0.25%（平行3 份）的溶液，按照2.1 項(xiàng)下色譜方法測(cè)定。9 份供試品溶液中，異構(gòu)體DE 的平均回收率為92.8%，RSD 為3.6%；異構(gòu)體A 的平均回收率為95.5%，RSD 為2.2%；異構(gòu)體B 的平均回收率為102.7%，RSD 為4.3%；異構(gòu)體C 的平均回收率為99.9%，RSD 為5.5%。表明本法準(zhǔn)確度良好。

2.4.8 溶液穩(wěn)定性

依法配制替格瑞洛供試品溶液與對(duì)照液，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h、48 h 進(jìn)樣，考察穩(wěn)定性。結(jié)果：對(duì)照溶液48 h 內(nèi)主峰峰面積的RSD 為0.63%；供試品溶液48 h 內(nèi)均只檢出異構(gòu)體C，其含量的RSD 為0.0%。表明替格瑞洛供試品溶液與對(duì)照液在室溫條件下放置，在至少48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.9 耐用性

按照2.2 項(xiàng)下配制空白溶液、替格瑞洛供試品溶液、對(duì)照液及系統(tǒng)適用性溶液，微小改變色譜條件，按照2.1 項(xiàng)下色譜方法檢測(cè)，考察耐用性。各個(gè)測(cè)試條件下，空白溶劑對(duì)待測(cè)組分均無干擾，結(jié)果見表1。

表1 耐用性考察結(jié)果Tab.1 Durability test results

結(jié)果表明：微小改變流速、柱溫、流動(dòng)相初始比例、使用不同批次色譜柱，不會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響，方法的耐用性良好。

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜法測(cè)定替格瑞洛原料藥中各異構(gòu)體含量的方法。該方法能準(zhǔn)確檢測(cè)替格瑞洛原料藥中替格瑞洛對(duì)映異構(gòu)體A和其他非對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)B、C、D、E，且方法靈敏度高，精密度好，能夠滿足替格瑞洛原料藥商業(yè)化生產(chǎn)中各異構(gòu)體含量的檢測(cè)要求，更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量。