冷加燕，張婷娟，林 江，谷 雨，于 迪，馬吉春，錢 軍，周靜東

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一種高度異質(zhì)性血液系統(tǒng)惡性克隆性疾病，也是較為常見的成人白血病類型[1]。AML發(fā)病涉及細胞遺傳學與分子生物學的巨大異質(zhì)性導致患者預后差異較大[2]。根據(jù)中國成人AML治療指南，依據(jù)初診時不同染色體及基因突變可將AML患者分為預后良好、中等、不良組[3]。此外，表觀遺傳學涉及的基因表達異常在AML中亦扮演重要角色，并且與患者預后密切相關[4]。許多研究揭示AML中BAALC、MN1、ERG等基因過表達與患者預后不良相關[5]。尋找更多影響AML預后的分子標志，對AML預后精準評估并指導患者個體化及精準治療具有重要臨床意義。

DLX4基因位于17q21.33，是一種轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控人體組織器官、造血系統(tǒng)形成中起重要作用[6-7]。DLX4基因目前公認有2個異構(gòu)體，其中轉(zhuǎn)錄本較長的稱為BP1(NM_138281)，轉(zhuǎn)錄本較短的稱為DLX7(NM_001934)。已有文獻[8]報道異構(gòu)體BP1在實體腫瘤呈過表達，并且與患者預后不良相關。異構(gòu)體DLX7在AML中表達尚未見相關報道。本實驗應用RT-qPCR法檢測AML患者中DLX4異構(gòu)體的表達及甲基化情況，分析其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2005年10月～2017年12月江蘇大學附屬人民醫(yī)院血液科診治的153例AML患者，其中男性90例，女性63例，年齡18～93歲(中位56歲)。另收集37例骨髓捐獻者，其中男性21例，女性16例，年齡32～65歲(中位50歲)。所有AML患者診斷分型按WHO(2016)標準[9]。治療方案參考文獻報道[10]。此外，白血病細胞株K562、SHI-1、U937、THP-1、NB4、HL60、HEL及MV4-11為蘇州大學附屬第一醫(yī)院血液科陳蘇寧教授饋贈。SHI-1細胞株培養(yǎng)在10%含鐵胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基中，其余細胞株培養(yǎng)在10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中。細胞培養(yǎng)生長壞境均為37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱。本實驗通過江蘇大學附屬人民醫(yī)院倫理委員會批準，同時獲患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1骨髓單個核細胞分離、RNA提取和DNA提取 收取對照組及所有患者骨髓10 mL，使用人淋巴細胞分離液(索萊寶公司，中國)分離出骨髓單個核細胞BMMNCs。應用TRIzol法提取總RNA，提取方法參考Trizol試劑盒說明書。同時通過Puregene Blood Core Kit B(Qiagen公司，德國)提取DNA，方法亦參考試劑盒說明書。

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR檢測DLX4的表達 取總RNA 400 ng，采用PrimeScript RT試劑盒(Takara公司，日本)進行逆轉(zhuǎn)錄。反應條件：37 ℃ 20 min，85 ℃ 5 s。合成的cDNA保存于-20 ℃?zhèn)溆?。異?gòu)體BP1引物序列：上游5′-TACCCGCTTGGCTTGTCC-3′，下游5′-AACGCTGGTTTAGGTGCTG-3′，目的產(chǎn)物長度為316 bp；異構(gòu)體DLX7引物序列：上游5′-TTATGAAACTGTCCGTCCTACC-3′，下游5′-TGT GCTGGAAACGCTGGT-3′，目的產(chǎn)物長度為201 bp；選取ABL1作為內(nèi)參基因，ABL1引物序列：上游5′-TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA-3′，下游5′-TCC AACGAGCGGCTTCAC-3′，引物由上海華大基因公司合成。通過AceQ qPCR SYBR Green Master Mix進行RT-qPCR定量檢測異構(gòu)體BP1及DLX7的表達。RT-qPCR反應在ABI 7300擴增儀上進行，反應條件：預變性95 ℃ 5 min(1個循環(huán))，變性95 ℃ 10 s、退火63 ℃ 30 s(BP1)以及60 ℃ 30 s(DLX7)、延伸72 ℃ 30 s、收集熒光80 ℃ 30 s(40個循環(huán))。異構(gòu)體BP1及DLX7相對表達量計算方法參考文獻報道[11]。

1.2.3亞硫酸鹽處理及MSP法檢測異構(gòu)體BP1啟動子甲基化 取gDNA 1 μg，采用EpiTech Bisulfite Kit(Qiagen公司，德國)試劑盒參照說明書進行硫化修飾，修飾后的標本置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。異?gòu)體BP1啟動子甲基化MSP引物序列：甲基化上游5′-TAGATCGGTTTGGAGTATGC-3′，甲基化下游5′-AACGTCCCGAATTAACTACC-3′；未甲基化上游5′-AGGTAGATTGGTTTGGAGTATGT-3′，未甲基化下游5′-TTAAACATCCCAAATTAACTACC-3′，甲基化及未甲基化目的產(chǎn)物長度均為131 bp。通過EpiTaq HS(for bisulfite-treated DNA)(Takara公司，日本)進行MSP定性檢測BP1啟動子甲基化態(tài)勢。MSP反應條件：預變性98 ℃ 10 s(1個循環(huán))，變性98 ℃ 10 s、退火59 ℃ 30 s以及60 ℃ 30 s(DLX7)、延伸72 ℃ 30 s、酶滅活72 ℃ 7 min(40個循環(huán))。MSP產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.2.4BSP法檢測異構(gòu)體BP1啟動子甲基化 異構(gòu)體BP1啟動子甲基化BSP引物序列：上游5′-GG GAGATTGTAAATGTAGATTTTTTG-3′，下游5′-AT ACCCCCCATAACTTTCCC-3′，目的產(chǎn)物長度均為415 bp，含有27個CpG位點。通過EpiTaq HS(for bisulfite-treated DNA)(Takara公司，日本)進行BSP定性擴增BP1啟動子。BSP反應條件：預變性98 ℃ 10 s(1個循環(huán))，變性98 ℃ 10 s、退火59 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s、酶滅活72 ℃ 7 min(40個循環(huán))。BSP產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳驗證并切膠回收，并使用AxyPrep DNA Gel Recovery Kit(Axygen公司，美國)純化。純化后產(chǎn)物通過pMD 19-T Vector Kit(Takara公司，日本)連接，后導入DH5α感受態(tài)細胞(Vazyme公司，中國)克隆。最后選擇至少10個單克隆送華大基因公司行Sanger法測序。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS 22.0及GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計學分析。兩組連續(xù)性變量間的差異分析使用Mann-WhitneyU檢驗，分類變量之間的差異分析采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。DLX4表達在AML中的診斷價值采用ROC曲線及ROC曲線下面積(AUC)進行評價。采用Kaplan-Meier法進行生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AML患者及細胞株中DLX4基因異構(gòu)體的表達RT-qPCR檢測37例對照組中異構(gòu)體BP1表達的平均水平為0.028(中位值0，范圍0～1.000)，153例AML患者中異構(gòu)體BP1表達的平均水平為0.324(中位值0，范圍0～8.905)，與對照組相比，異構(gòu)體BP1在AML中表達上調(diào)，差異有顯著性(P<0.001，圖1A)。此外，7例AML細胞株和1例慢性粒細胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)急粒變細胞株中BP1表達水平比對照組平均水平(0.028)均有不同程度增高(圖1B)。

37例對照組中異構(gòu)體DLX7表達的平均水平為1.234(中位0.265，范圍0.012～7.804)，153例AML患者中異構(gòu)體DLX7表達的平均水平為0.275(中位0.008，范圍0～6.150)，異構(gòu)體DLX7在AML中表達比對照組下調(diào)(P<0.001，圖1C)。此外，7例AML細胞株和1例CML急粒變細胞株中DLX7表達水平比對照組平均水平(1.234)均有不同程度降低(圖1D)。

圖1 AML患者及細胞株中DLX4各異構(gòu)體的表達水平：A.異構(gòu)體BP1在AML患者中的表達；B.異構(gòu)體BP1在AML細胞株中的表達；C.異構(gòu)體DLX7在AML患者中的表達；D.異構(gòu)體DLX7在AML細胞株中的表達

2.2 DLX4基因異構(gòu)體啟動子CpG島在AML患者及細胞株中的甲基化態(tài)勢為進一步探索DLX4異構(gòu)體差異性表達的影響因素，對DLX4基因結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)DLX4兩個異構(gòu)體BP1和DLX7前啟動子區(qū)域均存在較大的CpG島(圖2A)。本組前期實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)AML及CML患者中異構(gòu)體DLX7啟動子CpG島存在高甲基化現(xiàn)象，并且可能影響異構(gòu)體DLX7表達導致其表達下調(diào)[12-13]。本實驗首先通過MSP法對AML細胞株進行檢測，發(fā)現(xiàn)7例AML細胞株和1例CML急粒變細胞株均呈完全未甲基化態(tài)勢(圖2B)。隨機選擇2例AML細胞株通過BSP法亦證實其低甲基化狀態(tài)(圖2B)。另實驗還通過MSP法對AML進行檢測，結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)AML均呈完全未甲基化態(tài)勢，7例AML患者代表性結(jié)果詳見圖2C。隨機選擇8例AML通過BSP法亦證實其低甲基化狀態(tài)(圖2C)。

圖2 DLX4基因結(jié)構(gòu)模式圖及BP1啟動子區(qū)域CpG島在AML中的甲基化態(tài)勢：A.DLX4基因結(jié)構(gòu)模式圖；B.AML細胞株中BP1啟動子區(qū)域CpG島甲基化態(tài)勢，其中1～8分別為K562、SHI-1、U937、THP-1、NB4、HL60、HEL、NB4，9為未甲基化質(zhì)控，10為甲基化質(zhì)控，11為雙陰性質(zhì)控，BSP散點圖為HL60及THP-1細胞株；C.AML患者中BP1啟動子區(qū)域CpG島甲基化態(tài)勢，其中1～7為隨機挑選的7例AML，8為未甲基化質(zhì)控，9為甲基化質(zhì)控，10為雙陰性質(zhì)控；BSP散點圖為隨機挑選的8例AML患者

2.3 DLX4基因異構(gòu)體表達的鑒別診斷意義采用ROC曲線評估DLX4異構(gòu)體表達是否可作為AML診斷的潛在分子標志，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體BP1表達可用于鑒別實驗組和對照組的參考標志(AUC=0.699，95%CI：0.619～0.779，P<0.001，圖3A)。異構(gòu)體DLX7表達更能用于鑒別實驗組和對照組的參考標志(AUC=0.834，95%CI：0.776～0.893，P<0.001，圖3B)。此外，為進一步明確BP1及DLX7表達聯(lián)合在AML中的潛在診斷價值，實驗進一步通過Logistic回歸分析擬合新變量，同時通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，異構(gòu)體BP1及DLX7表達聯(lián)合用于鑒別實驗組和對照組的效能更為有價值(AUC=0.883，95%CI：0.821～0.945，P<0.001，圖3C)。

圖3 AML患者中DLX4各異構(gòu)體表達的ROC分析：A.AML患者中異構(gòu)體BP1表達的ROC分析；B.AML患者中異構(gòu)體DLX7表達的ROC分析；C.AML患者中異構(gòu)體BP1和DLX7聯(lián)合表達的ROC分析

2.4 DLX4基因異構(gòu)體表達與AML臨床及實驗室參數(shù)的相關性選取使ROC曲線的敏感度、特異性最優(yōu)的異構(gòu)體BP1表達水平(0.007)(敏感度為46.4%，特異性為97.3%)及DLX7表達水平(0.012)(敏感度為52.9%，特異性為100%)為臨界值。針對異構(gòu)體BP1，高表達組和低表達組在患者性別、年齡、血小板計數(shù)、血紅蛋白含量、骨髓原始細胞比例及核型危險度分組中差異均無顯著性(P>0.05)，但異構(gòu)體BP1高表達組患者的白細胞計數(shù)顯著高于異構(gòu)體BP1低表達組(P=0.001)。此外，兩組患者在FAB分型分布上差異有顯著性(P=0.021)。在基因突變中，異構(gòu)體BP1高表達組患者FLT3-ITD突變率顯著高于異構(gòu)體BP1低表達組患者(P=0.039，表1)。

針對異構(gòu)體DLX7，高表達組和低表達組在患者性別、年齡、白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)、血紅蛋白含量、骨髓原始細胞比例、FAB分類、核型危險分組、基因突變中差異均無顯著性(P>0.05，表1)。

2.5 DLX4基因異構(gòu)體表達與AML患者預后的相關性實驗分析了DLX4異構(gòu)體表達與患者接受誘導化療后完全緩解率的關系(隨訪130例)。異構(gòu)體BP1過表達患者完全緩解率低于異構(gòu)體BP1高表達組患者，僅在非M3組患者中差異有顯著性(P=0.047)；異構(gòu)體DLX7高低表達組患者之間差異無顯著性(P>0.05，表1)。

表1 AML患者中DLX4各異構(gòu)體表達與臨床病理特征的關系

Kaplan-Meier法進一步分析DLX4異構(gòu)體表達對患者生存的影響(隨訪130例)。異構(gòu)體BP1高表達患者總生存期低于異構(gòu)體BP1低表達患者，在非M3患者及正常核型AML患者中差異有顯著性(P=0.007、0.035，圖4)。因異構(gòu)體BP1高表達和FLT3-ITD突變有相關性，且FLT3-ITD過表達提示患者預后不良。實驗剔除FLT3-ITD突變患者，通過生存分析進一步證實異構(gòu)體BP1過表達對患者預后不良的影響(P=0.004、0.024，圖4)。異構(gòu)體DLX7通過生存分析發(fā)現(xiàn)：無論是全部AML、非M3 AML及正常核型AML中，兩組之間差異均無顯著性(P>0.05，圖4)。

圖4 AML患者中DLX4各異構(gòu)體表達對患者預后的影響

3 討論

越來越多的報道揭示DLX4基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。如Zhang等[14]報道DLX4可以通過上調(diào)TWIST促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化從而促進乳腺癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移。此外，亦有報道證實DLX4異構(gòu)體BP1通過促進細胞增殖及侵襲參與ER-乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展[15]。Haria等[16]研究結(jié)果顯示，DLX4可以通過刺激NF-κB活性誘導CD44表達促進卵巢癌的轉(zhuǎn)移。此外，敲減DLX4表達可促進絨毛膜癌細胞的凋亡[17]。Ling等[18]研究發(fā)現(xiàn)，DLX4可上調(diào)YB-1影響細胞增殖、周期及侵襲，參與鼻咽癌的形成。臨床相關研究結(jié)果亦證實DLX4或異構(gòu)體BP1在腫瘤中的表達與患者預后密切相關，并且可能作為預后判斷的分子標志物[19-21]。綜合以上結(jié)果揭示，DLX4在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起促癌作用。然而，亦有較多研究發(fā)現(xiàn)DLX4在腫瘤中存在高甲基化現(xiàn)象，并且與預后密切相關[22-23]，這些結(jié)果提示DLX4可能扮演抑癌作用，其與之前報道DLX4發(fā)揮促癌作用結(jié)論矛盾。對DLX4的基因結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，DLX4基因存在2個異構(gòu)體，CDS較長者稱之為BP1，CDS較短者稱之為DLX7，而多數(shù)報道并未嚴格區(qū)分兩者。本實驗分別設計2個異構(gòu)體的特異性引物在AML患者及細胞株中的表達進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體BP1在AML中呈過表達態(tài)勢，與先前報道一致[24]。然而，異構(gòu)體DLX7在AML中呈低表達態(tài)勢，既往未見相關報道。針對DLX4的2個異構(gòu)體功能，擬進一步實驗證實。此外，本實驗進一步分析了DLX4的2個異構(gòu)體表達的臨床意義，ROC曲線分析揭示異構(gòu)體BP1及DLX7表達，尤其是兩者聯(lián)合變量，可能對AML輔助診斷有一定幫助；預后分析揭示BP1過表達與AML患者低緩解率及低生存期相關，與實體腫瘤報道類似。由于異構(gòu)體DLX7表達與AML患者預后無相關性，因此異構(gòu)體BP1在AML形成中可能扮演促癌作用，異構(gòu)體DLX7可能扮演抑癌作用，并且異構(gòu)體BP1過表達可能作為AML患者預后判斷的生物學標志物。

甲基化作為最為常見的表觀遺傳學方式之一，在調(diào)控基因表達方面起重要作用。鑒于已有文獻報道揭示DLX4存在高甲基化現(xiàn)象，同時DLX4的2個異構(gòu)體表達態(tài)勢相反。本實驗進一步分析DLX4基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體BP1及DLX7前啟動子區(qū)域均有較大的CpG島，既往報道DLX4甲基化研究區(qū)域主要是針對異構(gòu)體DLX7啟動子內(nèi)CpG島，并且影響基因表達。我們既往通過定量MSP及BSP的方法亦證實AML及CML患者中異構(gòu)體DLX7啟動子CpG島存在高甲基化現(xiàn)象，并且與DLX7表達呈負相關[12-13]。此外，對異構(gòu)體DLX7啟動子高甲基化AML細胞株行去甲基化處理可恢復DLX7的表達[12-13]。由此揭示，異構(gòu)體DLX7在AML中表達下調(diào)可能是因為DLX7啟動子CpG島高甲基化所致。本實驗進一步針對AML中異構(gòu)體BP1啟動子CpG島進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體BP1啟動子CpG島呈完全未甲基化。由此可見，AML中異構(gòu)體BP1表達上調(diào)不是因為BP1啟動子甲基化改變所致。目前已有報道表明實體腫瘤中異構(gòu)體BP1過表達可能因其基因拷貝數(shù)擴增所致[25]。此外，針對其他基因相關研究發(fā)現(xiàn)基因啟動子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點多態(tài)性可能影響基因表達參與AML的發(fā)生[26]。然而，AML中異構(gòu)體BP1過表達原因目前尚不完全明確，有待進一步分析。

綜上所述，AML中DLX4的2個異構(gòu)體BP1及DLX7表達態(tài)勢不同。異構(gòu)體BP1呈過表達，與其啟動子甲基化無關，可作為AML患者預后不良的生物學標志物；DLX7呈低表達，可能受其啟動子高甲基化影響，與AML患者預后無關。