劉 慧，馬東慎，劉廣珍，向臣希

乳腺癌為嚴(yán)重威脅女性生命健康的惡性腫瘤之一[1]。目前，隨著腫瘤免疫治療的發(fā)展，程序性死亡-配體1(programmed death-ligand 1, PD-L1)抑制劑對于難治性乳腺癌的療效初現(xiàn)[2-3]。然而PD-L1的表達(dá)具有異質(zhì)性和動態(tài)性[4]，乳腺癌中PD-L1的調(diào)控因素尚未明確。促癌因子莫洛尼病毒前病毒整合位點(diǎn)-1(proviral integration site of moloney virus-1, PIM-1)屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶，在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中起重要作用[5]。研究表明PIM-1抑制劑能夠促進(jìn)三陰型乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[6]，而PIM-1能否調(diào)控三陰型乳腺癌中PD-L1的表達(dá)尚未見文獻(xiàn)報道。本文著重分析浸潤性乳腺癌中PD-L1和PIM-1蛋白的表達(dá)及兩者表達(dá)的相關(guān)性，并從細(xì)胞學(xué)水平初步證明PIM-1對PD-L1蛋白的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料收集2010～2016年徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院行根治性切除術(shù)且術(shù)后病理確診為浸潤性乳腺癌患者208例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。根據(jù)病理學(xué)資料獲得其分子亞型信息，其中Luminal A型43例，Luminal B型47例，HER-2過表達(dá)型42例，三陰型76例。按照常規(guī)方法制備組織芯片。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化SP法染色，試劑盒購自北京中杉金橋公司。PIM-1抗體(克隆號G11)購自美國Santa Cruz公司。PD-L1抗體(克隆號22C3)購自美國DAKO公司。免疫組化使用Ventana全自動免疫組化系統(tǒng)進(jìn)行。PIM-1陽性定位于腫瘤細(xì)胞胞核，呈黃色或棕黃色染色，采用免疫組化評分(H-Score)量化PIM-1的表達(dá)水平，以中位H-Score作為Cut off值將病例分為PIM-1高表達(dá)組和低表達(dá)組[7]。PD-L1陽性定位于腫瘤細(xì)胞或浸潤的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，呈黃色或棕黃色染色。以CPS法對腫瘤PD-L1表達(dá)水平進(jìn)行評分：CPS評分=[(陽性腫瘤細(xì)胞+陽性淋巴細(xì)胞+陽性巨噬細(xì)胞)/活腫瘤細(xì)胞總數(shù)]×100，統(tǒng)計一個高倍視野下的所有細(xì)胞(不少于100個腫瘤細(xì)胞)，將CPS評分≥10的病例作為PD-L1陽性病例。所有免疫組化結(jié)果均經(jīng)兩位病理醫(yī)師進(jìn)行評分。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，換液及傳代按常規(guī)方法進(jìn)行。PIM-1過表達(dá)載體和PIM1小干擾RNA(siPIM-1)由上海吉瑪公司合成。細(xì)胞于6孔板分為4組培養(yǎng)，分別為過表達(dá)載體對照組、PIM-1過表達(dá)組、siPIM-1對照組以及siPIM-1組。培養(yǎng)至70%融合時使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)按常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3qRT-PCR 使用PIM-1過表達(dá)載體和siPIM-1在乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231中對PIM-1進(jìn)行過表達(dá)或敲減。轉(zhuǎn)染完畢的各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h棄去培養(yǎng)上清，每孔加入1 mL Trizol(美國Invitrogen公司)裂解細(xì)胞并按常規(guī)方法使用氯仿抽提法提取RNA。提取的總RNA使用瓊脂糖電泳檢測完整性并檢測濃度和純度后，使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(南京諾維贊公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用AceQ qPCR CYBR Green Master Mix試劑盒(南京諾維贊公司)于StepOne Plus熒光定量qPCR儀中進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。引物由上海吉瑪公司合成，PD-L1引物序列：上游5′-TGGCATTTGCTGAACG CATTT-3′，下游5′-TGCAGCCAGGTCTAATTGTTTT-3′；GAPDH引物序列：上游5′-GGAGCGAGATCCCTC CAAAAT-3′，下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCAT GG-3′。

1.2.4Western blot法 使用PIM-1過表達(dá)載體和siPIM-1在乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231中對PIM-1進(jìn)行過表達(dá)或敲減。轉(zhuǎn)染完畢的各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后使用刮刀收取細(xì)胞。使用RIPA裂解液(北京碧云天公司)裂解細(xì)胞。按常規(guī)方法提取蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒(北京碧云天公司)進(jìn)行蛋白定量并調(diào)整蛋白濃度。根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，使用5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜(PIM-1、PD-L1和GAPDH一抗稀釋比均為1 ∶1 000；PIM-1一抗購自美國Santa Cruz公司，PD-L1、GAPDH一抗購自美國Abcam公司)，次日使用TBST洗滌后二抗室溫孵育1 h，再次洗滌后使用化學(xué)發(fā)光法檢測目的條帶并使用Image J軟件對條帶進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 不同分子分型乳腺癌中PD-L1與PIM-1的表達(dá)208例乳腺癌根據(jù)乳腺癌分子分型分為Luminal A、Luminal B、HER-2過表達(dá)和三陰型。免疫組化結(jié)果顯示，PIM-1呈胞核著色，PD-L1呈胞質(zhì)和胞膜著色(圖1)；PD-L1在三陰型乳腺癌中的陽性率為13.16%(10/76)，在Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達(dá)型中的陽性率分別為4.65%(2/43)、2.12%(1/47)和4.76%(2/42，)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.779，P=0.029，表1)。不同分子分型乳腺癌組織中PIM-1表達(dá)水平差異無顯著性(χ2=0.432，P=0.511，表2)。

圖1 PD-L1與PIM-1在乳腺癌組織中的表達(dá)，SP法：A.1例乳腺癌組織高表達(dá)PD-L1；B.該例乳腺癌組織同時高表達(dá)PIM-1

表1 不同分子分型乳腺癌中PD-L1的表達(dá)[n(%)]

表2 不同分子分型乳腺癌中PIM-1的表達(dá)[n(%)]

2.2 乳腺癌組織中PD-L1與PIM-1表達(dá)的相關(guān)性χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，PIM-1高表達(dá)組中PD-L1的陽性率(12.50%，13/104)高于PIM-1低表達(dá)組(1.92%，2/104)。Fisher精確概率法分析顯示，乳腺癌組織中PD-L1與PIM-1的表達(dá)呈正相關(guān)(P=0.006，表3)。

表3 乳腺癌中PIM-1表達(dá)與PD-L1表達(dá)的相關(guān)性[n(%)]

2.3 PIM-1對乳腺癌細(xì)胞中PD-L1表達(dá)的影響本組體外實(shí)驗(yàn)顯示，PIM-1對乳腺癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平有促進(jìn)作用。qRT-PCR結(jié)果表明，在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系中，過表達(dá)PIM-1顯著提高PD-L1 mRNA水平，敲減PIM-1則導(dǎo)致其表達(dá)水平明顯降低(圖2)。Western blot法結(jié)果顯示，在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系中過表達(dá)PIM-1明顯提高PD-L1的蛋白表達(dá)，敲減PIM-1則導(dǎo)致其表達(dá)水平明顯降低(圖3)。

圖2 PIM-1對乳腺癌細(xì)胞系中PD-L1 mRNA表達(dá)水平的影響：乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(A)和MDA-MB-231(B)過表達(dá)PIM-1明顯促進(jìn)PD-L1 mRNA表達(dá)，敲減PIM-1則明顯降低PD-L1 mRNA表達(dá)；*P<0.05，**P<0.01

圖3 PIM-1對乳腺癌細(xì)胞系中PD-L1蛋白表達(dá)的影響：A.乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231中過表達(dá)PIM-1明顯促進(jìn)PD-L1的表達(dá)，敲減PIM-1則明顯降低PD-L1 mRNA表達(dá)；B.Western blot條帶的灰度分析結(jié)果；**P<0.01，***P<0.001

3 討論

腫瘤免疫治療是近年發(fā)展迅速的一種腫瘤治療方法。免疫系統(tǒng)能夠識別腫瘤相關(guān)抗原并能夠調(diào)控機(jī)體內(nèi)免疫細(xì)胞對腫瘤的殺傷，通過修復(fù)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，可以起到抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展作用[8]。然而，腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過程中會獲得“免疫逃逸”能力，即腫瘤細(xì)胞進(jìn)入免疫抑制狀態(tài)，失去對機(jī)體的免疫應(yīng)答。這不僅是腫瘤逃脫免疫監(jiān)視的原因，也是免疫治療效果不佳的重要原因[9]。引起免疫逃逸的因素很多，在介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的分子中PD-L1最受關(guān)注。PD-L1為表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面重要的免疫抑制分子。腫瘤細(xì)胞可通過PD-L1與T細(xì)胞表面的PD-1分子結(jié)合誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡，從而避免T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷[10]。雖然阻斷PD-L1通路在難治性乳腺癌的治療中已獲得初步成果，但PD-L1在三陰型乳腺癌中的表達(dá)具有異質(zhì)性[11-12]，且并非所有患者均能從PD-L1抑制劑中獲益，因此深入分析PD-L1調(diào)控的內(nèi)在機(jī)制，對于尋找新的免疫治療靶點(diǎn)進(jìn)而解除腫瘤細(xì)胞的免疫抑制至關(guān)重要。

PIM-1激酶屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶，是促癌因子PIM家族中的一員(PIM-1、2、3)，在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中起重要作用。在病毒誘發(fā)的淋巴瘤小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，PIM-1基因存在病毒基因組的廣泛插入，提示PIM-1的腫瘤驅(qū)動作用[13]。PIM-1異常激活與多種血液系統(tǒng)或上皮來源腫瘤相關(guān)。PIM家族所有成員基因的敲除并不影響正常細(xì)胞活性，故PIM-1正成為新的有潛力的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)[14]。泛PIM家族抑制劑已被批準(zhǔn)臨床I/II期實(shí)驗(yàn)，用于治療急性骨髓性白血病、難治復(fù)發(fā)型前列腺癌以及復(fù)發(fā)型多發(fā)性骨髓瘤[15]。此外，有研究結(jié)果表明，PIM-1抑制劑能夠促進(jìn)三陰型乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[6]。因此，PIM激酶作為乳腺癌治療靶點(diǎn)具有一定的應(yīng)用前景，值得深入分析。

本實(shí)驗(yàn)使用包含208例乳腺癌患者的組織芯片對PD-L1和PIM-1在乳腺癌組織中表達(dá)水平以及相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，PD-L1在三陰型乳腺癌中的陽性率高于其它分子分型的乳腺癌，Kruskal-Wallis統(tǒng)計檢驗(yàn)顯示差異有顯著性。PIM-1在不同分子分型乳腺癌中的表達(dá)差異無顯著性。相關(guān)性分析顯示，PD-L1與PIM-1的表達(dá)水平呈正相關(guān)，PIM-1高表達(dá)的乳腺癌組織中PD-L1陽性率較高；提示PIM-1對PD-L1的表達(dá)具有正向調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)在兩種乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(ER陽性)和MDA-MB-231(三陰型)中過表達(dá)PIM-1或使用siPIM-1敲減PIM-1，qRT-PCR和Western blot法檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)PIM-1明顯促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)水平，敲減PIM-1則明顯降低PD-L1的表達(dá)水平。對所有乳腺癌病例進(jìn)行相關(guān)性分析和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中均未發(fā)現(xiàn)PIM-1對PD-L1的正向調(diào)控與乳腺癌分子分型相關(guān)，PD-L1在三陰型乳腺癌中較高的陽性率可能為其它獨(dú)立因素引起。

本實(shí)驗(yàn)在乳腺癌組織中初步證明了PD-L1與PIM-1表達(dá)水平間存在正相關(guān)，并進(jìn)一步在乳腺癌細(xì)胞株上驗(yàn)證了PIM-1對PD-L1表達(dá)的促進(jìn)作用，提示PIM-1可正向調(diào)控PD-L1的表達(dá)。臨床上乳腺癌免疫療法作為靶向用藥和化療的補(bǔ)充療法得到極大的關(guān)注。深入揭示乳腺癌組織中PD-L1的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，為以PIM-1為靶點(diǎn)開發(fā)腫瘤免疫治療藥物提供了理論基礎(chǔ)。