鄭國(guó)文 王 麗

原發(fā)性肝癌系臨床常見(jiàn)惡性腫瘤，病情進(jìn)展速度快，有較高的侵襲性，復(fù)發(fā)率高，位于癌癥死因前列[1]。手術(shù)、介入治療、肝移植、分子靶向治療、基因治療及手術(shù)治療等均為原發(fā)性肝癌主要治療手段，其中肝移植、手術(shù)根除為首選[2]。報(bào)道顯示，肝癌肝移植患者5年生存率為70%左右，行肝癌切除術(shù)患者5年生存率在30%～60%左右[3]。既往多認(rèn)為肝癌起源于成熟肝細(xì)胞[4]，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，肝臟祖細(xì)胞(hepatic progenitor cells,HPC)在肝癌發(fā)病及進(jìn)展過(guò)程有重要作用[5]。Avenaud等[6]研究發(fā)現(xiàn)，慢性病毒性肝炎、酒精性肝炎患者肝組織均見(jiàn)HPC激活，且HPC具備雙向分化作用，可引起肝細(xì)胞、肝管細(xì)胞癌分化，導(dǎo)致肝細(xì)胞異常增殖。上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cellular adhesion molecule,EP-CAM)、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子1 (neural cell adhesion molecule1,N-CAM1)及C-KIT均為目前已被證實(shí)的HPC標(biāo)志物，其中EP-CAM為Ⅰ型跨膜糖蛋白，在上皮細(xì)胞間粘附分子上皮癌變中有重要作用，早期被認(rèn)為是惡性腫瘤癌前病變關(guān)鍵標(biāo)志物[7]；N-CAM1則同屬糖蛋白，可與單核細(xì)胞粘附分子及淋巴細(xì)胞功能抗原結(jié)合，發(fā)揮糖基化作用，誘導(dǎo)各類炎癥反應(yīng)；C-KIT則為重要細(xì)胞原癌基因，屬絡(luò)氨酸激酶受體蛋白家族，可參與造血干細(xì)胞增殖及分化調(diào)控過(guò)程，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其與胃腸道間質(zhì)瘤的發(fā)生存在密切關(guān)聯(lián)[8]，為探討HPC標(biāo)志物EP-CAM、N-CAM1、C-KIT與原發(fā)性肝癌分級(jí)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)對(duì)醫(yī)院收治的80例患者的臨床及病理資料進(jìn)行了回顧性分析，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2008年1月至2014年9月我院收治的80例原發(fā)性肝癌患者作為觀察組，標(biāo)本為肝癌切除術(shù)后病理存樣標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理確診為肝癌；術(shù)前未接受放化療及其他抗腫瘤治療；未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；臨床及病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：心、腦、肺、腎器質(zhì)性功能障礙者；腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；臨床及病理資料不完整者；合并全身性疾病者；合并自身免疫功能障礙者。選擇同期來(lái)我院行手術(shù)治療的50例肝硬化及乙型肝炎患者作為對(duì)照組。均滿足肝硬化及乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；術(shù)中留取病理標(biāo)本，術(shù)前未接受任何形式治療，臨床資料完整。觀察組中男性58例，女性22例；年齡35～78歲，平均(58.2±10.3)歲。對(duì)照組中男性37例，女性13例；年齡34～76歲，平均(59.1±9.8)歲。

1.2 主要試劑與儀器

鼠抗人EP-CAM單克隆抗體(貨號(hào)253009)、鼠抗人N-CAM1單克隆抗體(貨號(hào)438H01)、鼠抗人C-KIT單克隆抗體(貨號(hào)MAB5847)、即用型抗鼠二抗(均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；電熱恒溫干燥箱(上海shenergy biocolor公司)，超薄切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)，DM RXA2型電子顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，圖像處理軟件(Image Pro Plus v6.0，美國(guó)Media Cybernetics公司)。

1.3 方法

①免疫組化染色。外科手術(shù)切除病理標(biāo)本均投入10%中性甲醛溶液固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟標(biāo)本，4 μm連續(xù)切片，行免疫組化EnVision法染色，組織二甲苯、乙醇脫蠟至水，磷酸緩沖液(PBS)沖洗3 min×3次，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，胰腺修復(fù)法修復(fù)抗原，蒸餾水漂洗，PBS沖洗3 min×3次，EpCAM、N-CAM1、C-KIT抗體稀釋比例為1∶50，加入稀釋特異性一抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌5 min×3次，加入EnVision TM即用型二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3 min×3次，加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)色源底物溶液孵育10 min，蒸餾水漂洗，復(fù)染，脫水，透明，封片，鏡下觀察EP-CAM、N-CAM1、C-KIT表達(dá)情況。②研究方法。收集所有肝癌患者的臨床資料，包括性別、年齡、乙型肝炎病毒感染、血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)水平、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、分化程度、包膜、臨床分期、病理類型、肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移及術(shù)后生存情況。

1.4 免疫組化結(jié)果判定

隨機(jī)取5個(gè)高倍視野鏡下觀察EP-CAM、N-CAM1、C-KIT陽(yáng)性表達(dá)情況，三者陽(yáng)性表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜，表現(xiàn)為棕黃色顆粒，觀察染色強(qiáng)度及染色細(xì)胞比例。陽(yáng)性評(píng)分參照文獻(xiàn)[10]，顯色強(qiáng)度計(jì)分包括0分(無(wú)顯色)、1分(淺黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕褐色)；陽(yáng)性細(xì)胞比例計(jì)分包括0分(陽(yáng)性細(xì)胞比例<10%)、1分(陽(yáng)性細(xì)胞比例為10%～30%)、2分(陽(yáng)性細(xì)胞比例為31%～60%)、3分(陽(yáng)性細(xì)胞比例≥61%)。兩者積分乘積為最終結(jié)果，陰性：0分；陽(yáng)性：積分≥1分。均由2名高資歷病理科醫(yī)師對(duì)切片進(jìn)行觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組EP-CAM、N-CAM1、C-KIT表達(dá)陽(yáng)性率比較

觀察組EP-CAM、N-CAM1、C-KIT陽(yáng)性表達(dá)率均高于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 EP-CAM、N-CAM1、C-KIT與肝癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

不同性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目及是否合并乙型病毒感染肝癌患者EP-CAM、N-CAM1、C-KIT陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高AFP水平、無(wú)包膜或包膜不完整、低中分化腫瘤、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、病理類型為膽管上皮癌、混合型肝癌及出現(xiàn)肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移的肝癌患者EP-CAM、N-CAM1、C-KIT陽(yáng)性率較高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 兩組EP-CAM、N-CAM1、C-KIT表達(dá)陽(yáng)性率比較(例，%)

表2 EP-CAM、N-CAM1、C-KIT與肝癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

注：*為Fisher檢驗(yàn)結(jié)果。

2.3 不同生存率患者EP-CAM、N-CAM1、C-KIT陽(yáng)性率比較

所有肝癌患者均隨訪3年，肝癌患者1年、2年、3年生存率分別為72.50%(58/80)、53.75%(43/80)、37.50%(30/80)，隨患者生存時(shí)間的延長(zhǎng)，EP-CAM、N-CAM1、C-KIT陽(yáng)性率降低，隨訪3年存活的患者EP-CAM、N-CAM1、C-KIT陽(yáng)性率高于1年生存與2年生存的患者(P<0.05)，見(jiàn)表3與圖1。

表3 不同生存率患者EP-CAM、N-CAM1、C-KIT陽(yáng)性率比較(例，%)

圖1 EP-CAM、N-CAM1、C-KIT陽(yáng)性患者生存曲線分析

3 討論

肝臟祖細(xì)胞屬上皮細(xì)胞，體積小，約為正常肝細(xì)胞的1/4～1/2左右，正常人肝組織肝臟祖細(xì)胞位于門(mén)靜脈膽小管與Hering管內(nèi)，具備肝細(xì)胞、肝管上皮細(xì)胞雙向分化作潛能。當(dāng)肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞損傷或丟失后，肝臟祖細(xì)胞激活，并分化為成熟肝細(xì)胞，替代受損肝細(xì)胞，發(fā)揮再生作用，且具備自我更新、多向分化及無(wú)限增殖潛能[11]。近年來(lái)較多研究者均表示，肝臟祖細(xì)胞異常增殖是引起原發(fā)性肝癌的主要病因[12-13]。有學(xué)者進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肝癌發(fā)生及進(jìn)展均伴隨HPC激活[14]。周思朗等[15]建立肝癌動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞表達(dá)大量HPC標(biāo)志物，該觀點(diǎn)認(rèn)為肝癌可能起源于HPC。ROJAS等[16]進(jìn)行移植試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HPC可直接促進(jìn)肝癌發(fā)生及進(jìn)展，且參與肝癌惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程。HPC標(biāo)志物主要包括連接蛋白、細(xì)胞黏附分子、表面抗原、受體類因子等，目前臨床研究多圍繞細(xì)胞黏附分子展開(kāi)，包括EP-CAM、N-CAM1等。其中EP-CAM為I型跨膜糖蛋白，可介導(dǎo)非鈣離子依賴性同源細(xì)胞黏附，存在于人體上皮組織內(nèi)，既往認(rèn)為EP-CAM為惡性腫瘤或癌前病變重要標(biāo)志物[17]。畢惠娟等[18]發(fā)現(xiàn)卵巢癌、食管癌患者癌組織均見(jiàn)EP-CAM表達(dá)上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌患者癌組織EP-CAM陽(yáng)性率明顯高于肝硬化及肝炎患者，表明EP-CAM表達(dá)上調(diào)可能參與肝癌發(fā)病過(guò)程。同時(shí)對(duì)不同臨床病理資料肝癌患者EP-CAM陽(yáng)性率進(jìn)行監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，分化程度越低、臨床分期越高、AFP表達(dá)水平越高；且合并肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移、無(wú)包膜、病理類型為膽管上皮癌、混合型肝癌的患者EP-CAM陽(yáng)性率較高，提示EP-CAM在肝癌病理進(jìn)展過(guò)程中有其重要作用，可能參與肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程。N-CAM1則為一類糖蛋白，屬免疫球蛋白家族成員，結(jié)構(gòu)與免疫球蛋白類似，由位于細(xì)胞外免疫球蛋白樣區(qū)域、跨膜區(qū)、細(xì)胞質(zhì)尾區(qū)構(gòu)成，主要通過(guò)與位于胞外免疫球蛋白區(qū)域膜結(jié)合整合素受體淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1及單核細(xì)胞粘附分子-1結(jié)合，產(chǎn)生糖基化作用，是廣泛分布的細(xì)胞間黏附分子，可見(jiàn)于內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及白細(xì)胞表面，在各類炎癥因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中均可見(jiàn)N-CAM1表達(dá)上調(diào)。雷林瑜等[19]進(jìn)行體外試驗(yàn)，在給予脂多糖、腫瘤壞死因子-α刺激細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)N-CAM1表達(dá)上調(diào)。也有研究者發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞肝癌患者體內(nèi)N-CAM1呈明顯過(guò)度表達(dá)狀態(tài)，約高于正常肝組織的5倍[20]。同時(shí)畢民平等[21]發(fā)現(xiàn)癌灶組織與肝癌周?chē)M織中N-CAM1水平存在梯度差異，在高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)肝細(xì)胞癌邊緣組織N-CAM1表達(dá)水平較高。本研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌患者N-CAM1陽(yáng)性率較肝硬化及肝炎患者高，且N-CAM1陽(yáng)性率與肝癌病理類型、臨床分期、分化程度、腫瘤包膜情況均有關(guān)，表明N-CAM1同樣參與肝癌浸潤(rùn)生長(zhǎng)過(guò)程。分析可能機(jī)制為：肝癌轉(zhuǎn)移主要以血管轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為主，在此過(guò)程中，癌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生黏附作用，穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞間隙，移行至內(nèi)皮下導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移，其對(duì)應(yīng)配體可與癌細(xì)胞表面整合素結(jié)合，促進(jìn)癌細(xì)胞黏附，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶降解基質(zhì)，導(dǎo)致癌細(xì)胞向間質(zhì)浸潤(rùn)，引起腫瘤轉(zhuǎn)移。C-KIT則為細(xì)胞癌基因，其產(chǎn)物為Ⅲ型絡(luò)氨酸蛋白激酶生長(zhǎng)因子受體，結(jié)構(gòu)與血小板衍生物生長(zhǎng)受體、巨噬細(xì)胞集落刺激因子類似，為白色斑點(diǎn)顯性基因等位基因，其產(chǎn)物分布于細(xì)胞表面[22]。報(bào)道發(fā)現(xiàn)，C-KIT原癌基因突變與生殖細(xì)胞瘤、黑色素瘤等發(fā)病均有關(guān)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌患者C-KIT陽(yáng)性率高于肝硬化及肝炎患者，且其陽(yáng)性率與腫瘤臨床分期、分化程度、組織分型、腫瘤包膜及肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移情況均有關(guān)，考慮到C-KIT基因異常表達(dá)可能參與肝癌發(fā)病過(guò)程。此外，進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)，隨患者生存率的提升，其癌組織EP-CAM、N-CAM1、C-KIT陽(yáng)性率均降低，提示兩者可能存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明上述各因子異常表達(dá)均參與原發(fā)性肝癌發(fā)病及病理過(guò)程，同時(shí)影響肝癌患者預(yù)后。但本研究病例數(shù)少，隨訪時(shí)間短，后續(xù)需擴(kuò)充樣本數(shù)量，延長(zhǎng)隨訪時(shí)間進(jìn)一步對(duì)EP-CAM、N-CAM1、C-KIT在肝癌病理及預(yù)后的影響展開(kāi)深入分析。