劉文薪，方蔚蓉，王 瑩，郭 凱，楚 杰

（齊魯工業(yè)大學(xué)，山東省科學(xué)院生物研究所，山東 濟(jì)南 250014）

許多食用菌都是腐生菌，可分泌木質(zhì)素酶和纖維素酶來(lái)降解自然界中的天然木質(zhì)素和纖維素，以供自身生長(zhǎng)所需[1]。玉米秸稈中含有豐富的粗纖維和大量的碳水化合物，主要包括由β-葡萄糖殘基組成的生物大分子纖維素和以木聚糖為主要成分的半纖維素，以及起到一定抗壓作用的木質(zhì)素，還含有少量的粗蛋白、粗脂肪、少量的礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]。構(gòu)樹(shù)適應(yīng)性廣，抗逆能力強(qiáng)，構(gòu)樹(shù)葉片中粗蛋白、粗脂肪、粗灰分約為槐樹(shù)、楊樹(shù)、玉米等木本植物的2倍～3倍[3]，且其中的纖維素含量較高，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜。玉米秸稈和構(gòu)樹(shù)均含有大量的粗纖維素且消化率較低，經(jīng)發(fā)酵后可將其纖維素降解，供家畜食用。通過(guò)測(cè)定秸稈發(fā)酵過(guò)程中纖維素酶的酶活性，研究其中的酶活性變化規(guī)律，為下一步秸稈的綜合利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

櫟生側(cè)耳（Pleurotus dryinus） 菌株由山東省科學(xué)院生物研究所工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏與提供。

1.2 培養(yǎng)基配方

基本培養(yǎng)基：（NH4）2SO41.0 g，KH2PO40.8 g，Na2HPO40.2 g，MgSO40.5 g，酵母浸粉 2.0 g，蒸餾水 1 L，pH 4.8。

1.2.1 不同構(gòu)樹(shù)含量的探索試驗(yàn)

取4個(gè)250 mL三角瓶，編號(hào)為1、2、3、4。每個(gè)三角瓶中加入7.5 g玉米秸稈粉和100 mL基本培養(yǎng)基，分別對(duì)應(yīng)加入0、1%、3%、5%的構(gòu)樹(shù)粉。

1.2.2 纖維素酶酶活變化試驗(yàn)

分別取4個(gè)250 mL的三角瓶，編號(hào)為1、2、3、4，每個(gè)三角瓶中加入100 mL的基本培養(yǎng)基。1號(hào)加入構(gòu)樹(shù)葉5 g和玉米秸稈5 g，2號(hào)加入構(gòu)樹(shù)葉2.5 g和玉米秸稈7.5 g，3號(hào)加入玉米秸稈10 g，4號(hào)加入5 g微晶纖維素。

1.2.3 酵母浸粉對(duì)秸稈發(fā)酵過(guò)程的影響

分別取2個(gè)250 mL的三角瓶，編號(hào)為1、2。每個(gè)三角瓶中加入12 g玉米秸稈粉和100 mL的基本培養(yǎng)基，1號(hào)酵母浸粉的添加量為2 g·L-1，2號(hào)未添加酵母浸粉。

1.3 發(fā)酵條件及粗酶液的提取

取櫟生側(cè)耳菌株（Ls） 斜面分別挑取一小塊接種上述培養(yǎng)基，在搖床條件28℃，150 r·min-1培養(yǎng)。3批試驗(yàn)分別在9 d、11 d、13 d、15 d取樣，取發(fā)酵液上清液于1.5 mL EP管內(nèi)，以12 000 r·min-1離心5 min，取上清液，即為粗酶液，進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.4 酶活性的測(cè)定

內(nèi)切β-葡聚糖酶酶活力的測(cè)定方法按照參考文獻(xiàn) [4]，以1 mL酶液 l min分解底物生成1 μmol葡萄糖的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）；外切葡聚糖酶活力的測(cè)定方法按照參考文獻(xiàn) [5]，以1 mL酶液l min分解底物生成1 μmol葡萄糖的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）；濾紙酶（FPA）活力的測(cè)定按照參考文獻(xiàn) [6]，以1 mL酶液l min分解底物生成1 μmol葡萄糖的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同構(gòu)樹(shù)粉含量在秸稈發(fā)酵過(guò)程中酶活變化

不同構(gòu)樹(shù)粉含量對(duì)秸稈發(fā)酵過(guò)程中內(nèi)切β-葡聚糖酶酶活的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，從β-葡聚糖酶酶活性變化來(lái)看，加入5%構(gòu)樹(shù)粉酶活最高，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中第9天為最高，其中5%構(gòu)樹(shù)粉在第9天酶活性可達(dá)到6.343 8 U·mL-1。隨著構(gòu)樹(shù)粉含量的降低，酶活逐漸減少。不同構(gòu)樹(shù)含量對(duì)秸稈發(fā)酵過(guò)程中外切β-葡聚糖酶酶活影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，在整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)，外切β-葡聚糖酶的活性由5%、3%、1%、0逐級(jí)遞減，且在第7天最高。不同構(gòu)樹(shù)粉含量對(duì)秸稈發(fā)酵過(guò)程中濾紙酶酶活的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，在保持5%的構(gòu)樹(shù)粉配比時(shí)，濾紙酶的酶活在9 d達(dá)到最大值，可高達(dá)1.317 U·mL-1。

2.2 不同配比發(fā)酵過(guò)程纖維素酶活變化

不同配比的玉米秸稈與構(gòu)樹(shù)葉對(duì)發(fā)酵過(guò)程中內(nèi)切β-葡聚糖酶酶活的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，顯然5 g構(gòu)樹(shù)葉與5 g玉米秸稈配比下，在第11天酶活活性較高，總體趨勢(shì)較為穩(wěn)定，酶活大小在 1.0 U·mL-1～1.5 U·mL-1。以 10 g 玉米秸稈為主要成分的酶活測(cè)定變化不大，但相對(duì)高于2.5 g構(gòu)樹(shù)葉+7.5 g玉米秸稈配比?？梢?jiàn)，對(duì)于內(nèi)切β-葡聚糖酶，降解秸稈活性最好的培養(yǎng)基成分為5 g玉米秸稈+5 g構(gòu)樹(shù)配比。不同配比的玉米秸稈與構(gòu)樹(shù)粉對(duì)發(fā)酵過(guò)程中外切葡聚糖酶酶活性的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可以直觀地看出，5 g構(gòu)樹(shù)葉+5 g玉米秸稈配比得到的外切β-葡聚糖酶酶活在整個(gè)發(fā)酵周期中酶活最高。11 d酶活達(dá)到最大值3.743 U·mL-1，外切β-葡聚糖酶作用對(duì)于維素糖的末端進(jìn)行切割最有效。單一的10 g玉米秸稈中外切β-葡聚糖酶酶活變化也比較小，但是趨于穩(wěn)定。2.5 g構(gòu)樹(shù)葉+7.5 g玉米秸稈配比中在第11天外切β-葡聚糖酶活性達(dá)到最高值2.484 U·mL-1，隨后持續(xù)降低。不同配比的玉米秸稈成分含量對(duì)秸稈發(fā)酵過(guò)程中濾紙酶酶活的影響見(jiàn)圖6。

由圖6可知，5 g玉米秸稈+5 g構(gòu)樹(shù)葉配比得到的濾紙酶活性在整體上都高于其他種類(lèi)的培養(yǎng)基配方，在第15天達(dá)到最大值1.446 U·mL-1。2.5 g構(gòu)樹(shù)葉+7.5 g玉米秸稈配比濾紙酶的酶活變化同外切β-葡聚糖酶變化趨勢(shì)一致，在9 d酶活達(dá)到最大值，隨后大幅降低。在第13天之后，由于多種纖維素酶存在，協(xié)同作用強(qiáng)，因此濾紙酶活又開(kāi)始升高。

2.3 酵母浸粉對(duì)秸稈發(fā)酵過(guò)程中纖維素酶活的影響

酵母浸粉對(duì)秸稈發(fā)酵過(guò)程中纖維素酶活的影響見(jiàn)圖 7～圖 9。

由圖7～圖9可知，加酵母浸粉同未加酵母浸粉的3種酶活比較，對(duì)于內(nèi)切β-葡聚糖酶，加了酵母浸粉的酶活后期偏大，而未加酵母粉的培養(yǎng)基中酶活變化則與之相反。同內(nèi)切β-葡聚糖酶的變化趨勢(shì)一致，外切β-葡聚糖酶后繼的酶活偏大。從總體上看，外切、內(nèi)切β－葡聚糖酶二者協(xié)同，使濾紙酶活力較高。

3 討論

在本試驗(yàn)中，探討了不同構(gòu)樹(shù)成分在秸稈發(fā)酵過(guò)程中酶活變化規(guī)律，先以玉米秸稈為主要成分的培養(yǎng)基中，分別添加0、1%、3%、5%構(gòu)樹(shù)粉，得出纖維素酶酶活最高的構(gòu)樹(shù)添加量。對(duì)于纖維素酶，在添加1%和0的構(gòu)樹(shù)粉2組試驗(yàn)中，酶活及其變化基本處于較低水平，且變化趨勢(shì)一致，二者基本無(wú)差別。同樣，3%和5%的構(gòu)樹(shù)粉末添加量的酶活變化趨勢(shì)較為一致，不同在于5%構(gòu)樹(shù)粉酶活總體水平較3%構(gòu)樹(shù)添加量高，尤其是內(nèi)切β-葡聚糖酶在9 d達(dá)到酶活最高值，為6.343 8 U·mL-1。從數(shù)據(jù)分析中可以初步得出以7.5 g的玉米秸稈，添加5%構(gòu)樹(shù)葉，纖維素酶活最高，其次為3%構(gòu)樹(shù)粉，均在第9天達(dá)到最高，但1%構(gòu)樹(shù)粉的添加量與不添加構(gòu)樹(shù)粉對(duì)纖維素酶活的影響不大。

探討了不同配比的玉米秸稈與構(gòu)樹(shù)葉對(duì)發(fā)酵過(guò)程中纖維素酶活的影響，將構(gòu)樹(shù)葉在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程所占比例適時(shí)提高，以單一的玉米秸稈為培養(yǎng)基做對(duì)照，分別在發(fā)酵周期內(nèi)測(cè)定纖維素酶酶活，得出其酶活大小及變化規(guī)律。對(duì)于內(nèi)切β-葡聚糖酶酶活變化，5 g構(gòu)樹(shù)葉與5 g玉米秸稈配比在第9天酶活降解效果較好，9 d后的總體趨勢(shì)較為穩(wěn)定，酶活大小在 1.0 U·mL-1～1.5 U·mL-1，以 10 g 玉米秸稈為主要成分的酶活測(cè)定變化不大，但相對(duì)高于2.5 g構(gòu)樹(shù)葉+7.5 g玉米秸稈配比。故而，降解秸稈活性最好的培養(yǎng)基成分為5 g玉米秸稈+5 g構(gòu)樹(shù)葉配比，即二者等比搭配，內(nèi)切β-葡聚糖酶的酶活性最高。

對(duì)于外切葡聚糖酶活性變化，5 g構(gòu)樹(shù)葉+5 g玉米秸稈配比的酶活在整個(gè)發(fā)酵周期中最高，11 d酶活達(dá)到最大值3.743 U·mL-1；至15 d酶活不降反增，可見(jiàn)5 g構(gòu)樹(shù)葉+5 g玉米秸稈這一配比所提供的營(yíng)養(yǎng)充足。與2.5 g構(gòu)樹(shù)葉+7.5 g玉米秸稈配比的酶活變化相比，在第11天達(dá)到最高值2.484 U·mL-1，隨后持續(xù)降低。同單一以10 g玉米秸稈作為底物相比，適當(dāng)?shù)靥砑訕?gòu)樹(shù)為發(fā)酵原料可以增大外切葡聚糖酶酶活的變化率，這一點(diǎn)再次印證了二者以一定比例進(jìn)行配合，才能達(dá)到相對(duì)理想的發(fā)酵效果，產(chǎn)生更高的纖維素酶酶活。

對(duì)于濾紙酶，5 g玉米秸稈+5 g構(gòu)樹(shù)葉配比的濾紙酶活性普遍高于其他種類(lèi)的培養(yǎng)基配方，在第15天達(dá)到最大值1.446 U·mL-1。2.5 g構(gòu)樹(shù)葉+7.5 g玉米秸稈配比濾紙酶的酶活變化同外切β-葡聚糖酶變化趨勢(shì)一致，在9 d酶活達(dá)到最大值，但后期10 g玉米秸稈配比的濾紙酶酶活要略高于2.5 g構(gòu)樹(shù)葉+7.5 g玉米秸稈配比。可見(jiàn)構(gòu)樹(shù)葉的加入不一定和酶活大小呈正比關(guān)系。但可以肯定在構(gòu)樹(shù)成分與玉米成分的比值為1∶1時(shí)，所有配比的纖維素酶活達(dá)到最高值，纖維素降解的最完全。

從總體變化趨勢(shì)來(lái)看，2.5 g構(gòu)樹(shù)葉+7.5 g玉米秸稈配比的纖維素酶酶活較低于10 g的玉米秸稈的酶活。而5 g構(gòu)樹(shù)葉+5 g玉米秸稈配比酶活一直處于較高值狀態(tài)，可能是由于玉米秸稈中含有大量的纖維素、木質(zhì)素等，可以使碳源維持較高的水平，且其培養(yǎng)基中又不乏硫酸銨這一速效氮，可以適時(shí)的補(bǔ)充氮源。而2.5 g構(gòu)樹(shù)葉補(bǔ)充的氮源的量可以說(shuō)相對(duì)較少，不在氮源的添加有效范圍內(nèi)，反而不如單一的玉米秸稈纖維素酶酶活高。通過(guò)優(yōu)化，5 g構(gòu)樹(shù)葉+5 g玉米秸稈配比酶活較高，構(gòu)樹(shù)葉添加量的增加，使其中可利用氮源增加并在一個(gè)有效的范圍內(nèi)，且玉米秸稈中的可溶性蛋白與碳源含量充足，使其酶活達(dá)到最高。

試驗(yàn)證明在有酵母浸粉添加的發(fā)酵情況下，后期的酶活較大，而在不添加酵母浸粉的情況下，前期的酶活偏高，這可能是因?yàn)槠渲杏辛蛩徜@這一成分作為速效氮源。酵母浸粉富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽、核酸、B族維生素、生長(zhǎng)因子及微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分，可有效的提高發(fā)酵物的酶活力[7]。因此，酵母浸粉的添加是必要的，櫟生側(cè)耳菌株降解秸稈需要維持穩(wěn)定的氮源，以保證纖維素酶能夠持續(xù)降解玉米秸稈與構(gòu)樹(shù)葉。

內(nèi)切β-葡聚糖酶可隨機(jī)切割纖維素多糖鏈內(nèi)部無(wú)定型區(qū)；外切β-葡聚糖酶作用于還原性和非還原性纖維素多糖的末端，釋放出葡萄糖或者纖維二糖；測(cè)定纖維二糖酶酶活可以一定程度上反應(yīng)外切β-葡聚糖酶的水解情況；濾紙酶酶活性圖示內(nèi)切β－葡聚糖酶、外切β－葡聚糖酶二者協(xié)同作用的降解情況[8]。

構(gòu)樹(shù)中含有大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中粗蛋白21%、粗脂肪 3%、粗纖維 37%、鈣2%、磷0.4%[9]。在一定程度上彌補(bǔ)了秸稈營(yíng)養(yǎng)中的不足，兩者搭配在一定程度上可以促進(jìn)真菌的生長(zhǎng)繁殖，促進(jìn)纖維素酶活力的提高[10]，從而可以有效地降解秸稈及構(gòu)樹(shù)中大量的纖維素，以提高其飼用價(jià)值。

玉米秸稈中粗纖維含量很高，可以為食用菌提供豐富的碳源，但其中蛋白質(zhì)含量較低（3%～6%），秸稈的消化率低。粗灰分含量高，礦物質(zhì)和維生素含量均較低，特別是鈣、磷含量很低，含量變動(dòng)在0.02%～0.16%[11]。相比之下，構(gòu)樹(shù)含有一定的蛋白質(zhì)及無(wú)機(jī)鹽，為真菌生長(zhǎng)補(bǔ)充了氮源和無(wú)機(jī)鹽，是櫟生側(cè)耳合成核酸、蛋白質(zhì)和酶類(lèi)的主要原料，對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用，櫟生側(cè)耳利用此類(lèi)氮源通過(guò)菌絲分泌的胞外酶，從而降解成小分子的有機(jī)氮，便于菌絲的直接吸收[12]。構(gòu)樹(shù)中所含的鐵、錳、鋅、鎂等微量元素，促進(jìn)菌體結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)與發(fā)育及酶類(lèi)合成與酶活力的提高。

綜上，在櫟生側(cè)耳發(fā)酵過(guò)程中，使纖維素酶活保持比較高的最佳條件，即以玉米秸稈與構(gòu)樹(shù)配比為1∶1，保證酵母浸粉有效量的添加，維持穩(wěn)定的氮源，可以保證纖維素降解的比較徹底。