姚雨辰，魏盼盼，李 茂，張恪誠，范桂枝

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

硫化氫（H2S）是一種具有臭雞蛋氣味的無色有毒氣體，近年來發(fā)現(xiàn)其作為新型的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，廣泛存在于正常機(jī)體中，在動(dòng)植物體內(nèi)中參與多種重要生理活動(dòng)[1]。研究表明，H2S在人體參與神經(jīng)調(diào)節(jié)、心血管調(diào)節(jié)、細(xì)胞保護(hù)作用、抗感染、清除活性氧、線粒體產(chǎn)能、胃腸與腎功能調(diào)節(jié)等生理過程[2-3]。在植物中參與生長發(fā)育和抗逆等過程，如光合作用、有機(jī)物的積累[1]、種子萌發(fā)等，可提高植物在極端條件脅迫下的耐受性[4]，緩解各種生物與非生物脅迫等。

在調(diào)節(jié)動(dòng)植物生長發(fā)育過程中，H2S與活性氧、Ca2+等信號(hào)路徑存在交叉互作關(guān)系[5]，例如在調(diào)節(jié)神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌過程中，Ca2+通道可以調(diào)節(jié)H2S生物活性，H2S可以增強(qiáng)Cav3.2 T型Ca2+通道活性，從而促進(jìn)軀體和內(nèi)臟疼痛信號(hào)的傳遞[6]。西葫蘆幼苗抵抗鎳（Ni）脅迫時(shí)，Ca2+和H2S供體硫氫化鈉（NaHS）聯(lián)合作用可以有效降低Ni脅迫誘導(dǎo)的氧化脅迫，外源Ca2+可以顯著提高Ni誘導(dǎo)下H2S的積累，用NaHS對(duì)根部進(jìn)行預(yù)處理可增強(qiáng)Ni誘導(dǎo)的鈣調(diào)蛋白基因在葉片中的表達(dá)[7]。Ca2+不僅是一種植物必需的大量元素，也是植物細(xì)胞重要的第二信使[8]，在防御反應(yīng)及對(duì)逆境脅迫的耐受中起到重要作用。外源Ca2+施加增強(qiáng)了鎘脅迫下芥菜植株的抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶等抗氧化酶的活性，使芥菜植株能抵抗鎘的毒害作用[9]。鈣通常以水溶鈣、果膠鈣、磷酸鈣、草酸鈣及殘余的硅酸鈣等形態(tài)存在于植物中，不同形態(tài)的鈣功能有所不同。例如細(xì)胞壁中鈣的形態(tài)主要為果膠鈣用以維持形態(tài)，植物液泡內(nèi)鈣的形態(tài)主要為沉淀的草酸鈣，可避免有機(jī)酸累積產(chǎn)生的毒害[10]。

桑黃 （Phellinus baumii） 屬于擔(dān)子菌亞門（Basidiomycota） 層菌綱 （Hymenomycetes） 多孔菌目 （Aphyllophorales） 多孔菌科 （Polyporaceae） 木層孔菌屬（Phellinus），是一種珍貴而功效多樣的藥用真菌[11]，有“森林黃金”之美稱[12]。桑黃含有多糖、黃酮等多種藥用活性物質(zhì)，具有抗癌、抗腫瘤、預(yù)防肝硬化、調(diào)節(jié)免疫功能等諸多藥理作用，藥用價(jià)值高，并且是國際公認(rèn)的生物治癌藥用真菌中有效率最高的一種[13]。綜上所述，Ca2+與H2S在植物的生長發(fā)育中存在一定的聯(lián)系，但二者的關(guān)系，特別是H2S對(duì)不同形態(tài)鈣含量的影響未見報(bào)道。

為此，以桑黃菌絲為研究對(duì)象，將H2S的供體NaHS添加到桑黃菌絲體培養(yǎng)體系中，分析NaHS對(duì)桑黃菌絲中不同形態(tài)鈣含量和超氧陰離子產(chǎn)生速率的影響，并進(jìn)一步討論Ca2+與H2S信號(hào)間的關(guān)系，以期為2種信號(hào)通路交互作用的進(jìn)一步研究起到一定的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

桑黃菌為暴馬丁香樹種桑黃（Phellinus baumii），東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院森林生物工程學(xué)科實(shí)驗(yàn)室提供，已進(jìn)行形態(tài)和分子水平鑒定。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

鈣阻斷劑：鏈霉素、CaM拮抗劑三氟拉嗪（TFP）、四乙酸（EGTA）、鈣通道抑制劑2-氨基乙酯二苯基硼酸（2-APB）、鈣通道阻斷劑氯化鑭（LaCl3）；鈣提取溶劑：乙醇、醋酸、鹽酸、NaCl溶液和去離子水等。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

HY-6A雙層振蕩器、恒溫干燥箱、滅菌鍋、臺(tái)式高速離心機(jī)、組織培養(yǎng)室、Waters公司生產(chǎn)的高效液相色譜儀、PE公司生產(chǎn)的Lambda Bio 10型紫外可見分光光度計(jì)、pH測試計(jì)（上海雷磁公司）冷凍高速離心機(jī)、低溫冰柜、冰箱、水浴鍋等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

總體而言，簡單從黨內(nèi)整風(fēng)的角度認(rèn)識(shí)群眾路線活動(dòng)，雖然會(huì)不可避免地忽視“群眾路線”這一我們黨的根本工作路線對(duì)于中國共產(chǎn)黨發(fā)展的深層次指導(dǎo)意義，甚至一些國外媒體就此提出的觀點(diǎn)我們也并不認(rèn)同，但是其認(rèn)識(shí)問題的角度和方法卻是值得我們思考和回味的。

取試驗(yàn)室保存的桑黃菌株置于固體馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA） 上活化[14]，待桑黃菌絲長滿平板后，挑取少量菌絲于液體PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)。篩選長勢良好的菌絲體繼代多次得到液體培養(yǎng)的桑黃菌絲體備用。

1.2.2 外源NaHS的添加

在桑黃菌絲體液體培養(yǎng)的第8天，向培養(yǎng)基中加入經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾的無菌NaHS溶液，使培養(yǎng)基中NaHS終濃度分別為0.5 mmol·L-1、2.0 mmol·L-1、10.0 mmol·L-1。培養(yǎng)時(shí)間分別為 3 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h、48 h。每種處理重復(fù)3次，取樣后進(jìn)行不同形態(tài)鈣和超氧陰離子含量分析。

1.2.3 外源鈣及其阻斷劑的添加

向培養(yǎng)8 d的液體菌絲體培養(yǎng)基中加入不同的阻斷劑以及外源鈣：加入鏈霉素使終濃度為0.2 mmol·L-1；加入 TFP 使終濃度為 50 μmol·L-1；加入EGTA使終濃度為5 mmol·L-1；加入2-APB使終濃度為 50 μmol·L-1；加入 LaCl3使終濃度為 0.5 mmol·L-1；加入CaCl2溶液使終濃度為10 mmol·L-1。20 min后添加NaHS，終濃度為2 mmol·L-1，每種處理重復(fù)3次，12 h后取新鮮樣品，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 不同形態(tài)鈣含量的測定

采用80%乙醇、2%醋酸、0.6 mol·L-1鹽酸、1.0 mol·L-1NaCl溶液和去離子水5種浸提液，分別提取醇溶鈣、磷酸鈣、草酸鈣、果膠鈣和水溶鈣。每種形態(tài)鈣均按如下步驟浸提、測定。

精確稱取桑黃菌絲體鮮樣1.0 g，分別加入上述浸提液5 mL充分研磨，研磨后放入10 mL離心管中，25℃震蕩提取12 h，在4℃冷凍離心機(jī)中8 000 r·min-1離心10 min，取適量上清液采用偶氮氯膦-mA分光光度法測定不同形態(tài)鈣的濃度[15]。

取桑黃菌絲鮮樣0.5 g，加入1 mL提取緩沖液（pH 7.4 的 20.0 mmol·L-1的 Tris-HCl，0.3%Triton、1.0 mmol·L-1DTT、1.0 mmol·L-1EGTA、0.1 mmol·L-1PMSF），在冰浴上充分研磨使其成為勻漿。4℃、12 000 r·min-1離心 20 min，取上清液 20 μL 加入到裝有底物溶液380 μL的4 mL離心管中混合均勻。將其放置到30℃水浴中反應(yīng)30 min后，將反應(yīng)終止液（4 mmol·L-1EGTA、0.5 mmol·L-1Na2CO3）1.6 mL立即加入其中，在410 nm波長下檢測吸光度。

底物溶液有底物I液和底物II液，底物I液為pH 7.4 的 50 mmol·L-1Tris-HCl、0.2 g·L-1BSA、0.5 mmol·L-1DTT、0.5 mmol·L-1MnCl2、20 mmol·L-1PNPP、0.3 μmol·L-1CaM、0.2 mmol·L-1CaCl2；底物II液為 pH7.4 的 50 mmol·L-1Tris-HCl、0.2 g·L-1BSA、0.5 mmol·L-1DTT、0.5 mmol·L-1MnCl2、20 mmol·L-1PNPP、3 mmol·L-1EGTA。用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)樣本進(jìn)行蛋白定量，底物I液和底物II液的酶活力的差值即為鈣調(diào)磷酸酶的活力，結(jié)果以比活力（△OD410）表示[16]。

1.2.6 鈣調(diào)蛋白活性的測定

取0.3 g桑黃菌絲鮮樣，用0.5 mL提取緩沖液（50 mmol·L-1Tris-HCl、20 mmol·L-1NaHSO3、1 mmol·L-1EGTA、0.15 mmol·L-1NaCl、1 mmol·L-1PMSF，pH 7.5） 研磨為勻漿后，12 000 r·min-1、4℃條件下離心5 min，取20 μL上清液加入含有0.005 U的PDE的0.5 mL反應(yīng)緩沖液（40 mmol·L-1Tris-HCl、0.5 mmol·L-1CaCl2、5 mmol·L-1MgCl2、40 mmol·L-1咪唑，pH 7.5） 中，向其中加入 20 mmol·L-1cAMP 50 μL啟動(dòng)反應(yīng)，后將其轉(zhuǎn)移到30℃的水浴中放置30 min進(jìn)行反應(yīng)。取出沸水浴4 min以終止反應(yīng)，并立即進(jìn)行冰水浴冷卻，加入1 mg·mL-1的蛇毒100 μL，30℃水浴反應(yīng) 20 min，加入 55%的TCA 70 μL 終止反應(yīng)。12 000 r·min-1、4℃條件下離心5 min[17-18]。

取600 μL上清液，測定無機(jī)磷。向其中加入試劑A（用1 mol·L-1的HCl配制成的6%的抗壞血酸）和試劑B（1%的鉬酸銨） 的等體積混合溶液600 μL?；靹虺浞? min～10 min后，加入試劑C（含2%的偏亞砷酸鈉、2%的檸檬酸鈉和2%的乙酸）1.2 mL，混勻后將其轉(zhuǎn)移到37℃的水浴中反應(yīng)10 min，或在室溫條件下放置20 min，然后在3 h內(nèi)測定波長為850 nm處的吸光度[19]，最后結(jié)果以酶活力單位U·g-1表示。

1.2.7 超氧陰離子產(chǎn)生速率的測定

取桑黃菌絲的鮮樣0.5 g，用50 mmol·L-1的磷酸緩沖液PBS（pH7.8） 2 mL充分研磨，勻漿5 000 r·min-1離心10 min，取1 mL上清液加入離心管中，再分別加入0.9 mL磷酸緩沖液以及0.1 mL 10 mmol·L-1的鹽酸羥胺溶液，充分混勻后于25℃水浴中反應(yīng)20 min。將0.5 mL反應(yīng)后的提取液加入新的離心管中，分別加入17 mmol·L-1的對(duì)氨基苯磺酸溶液0.5 mL和7 mmol·L-1的α-萘胺溶液0.5 mL，混合均勻后于25℃水浴20 min，再加入同體積的乙醚，1 500 r·min-1、4℃離心5 min，后吸取粉紅色的液體在530 nm處進(jìn)行吸光度的測定[20]。

2 結(jié)果分析

2.1 NaHS處理對(duì)桑黃菌絲中不同形態(tài)鈣含量的影響

NaHS處理對(duì)桑黃菌絲中不同形態(tài)鈣含量的影響見圖1。

圖 1A 表明，使用 0.5 mmol·L-1、2.0 mmol·L-1和10.0 mmol·L-1NaHS分別處理桑黃菌絲3 h～48 h后，桑黃菌絲體中的醇溶鈣含量基本呈增加趨勢。其中，2.0 mmol·L-1NaHS處理下增加的醇溶鈣含量高于其他2個(gè)處理濃度，且在處理48 h時(shí)達(dá)最大值，比同期對(duì)照增加了76.70%。

圖1B和1C表明，除NaHS處理12 h和24 h外，0.5 mmol·L-1、2.0 mmol·L-1和 10.0 mmol·L-1NaHS分別處理桑黃菌絲3 h～48 h后，桑黃菌絲體中的磷酸鈣和草酸鈣含量基本與對(duì)照相同。3種濃度的NaHS處理桑黃菌絲12 h時(shí)，桑黃菌絲中的磷酸鈣含量均達(dá)到處理下的最大值，分別比同期對(duì)照增加了12.73%、19.28%和17.41%；同樣，0.5 mmol·L-1和 2.0 mmol·L-1NaHS 處理桑黃菌絲 12 h時(shí)，桑黃菌絲體中的草酸鈣含量也達(dá)到最大值，分別比同期對(duì)照增加了10.16%和15.96%。

圖1D表明，除10 mmol·L-1NaHS處理桑黃菌絲9 h外，NaHS處理增加了桑黃菌絲中的果膠鈣含量，其中2.0 mmol·L-1NaHS處理的48 h時(shí)含量達(dá)到最大值，比同期對(duì)照增加了93.30%。

圖1E表明，水溶鈣含量對(duì)NaHS處理的響應(yīng)趨勢與上述不同形態(tài)鈣不同，除個(gè)別處理時(shí)間增加外，NaHS處理降低了水溶鈣含量。

圖1F表明，NaHS處理對(duì)總鈣含量的影響也呈現(xiàn)濃度和時(shí)間效應(yīng)，其中0.5 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1NaHS處理桑黃菌絲中的總鈣含量基本呈增加趨勢（除12 h外），10 mmol·L-1NaHS處理后黃菌絲中的總鈣含量基本呈降低趨勢（除18 h外）。

2.2 NaHS處理對(duì)桑黃菌絲中鈣調(diào)磷酸酶活性的影響

NaHS處理對(duì)桑黃菌絲中鈣調(diào)磷酸酶活性的影響見圖2。

如圖 2 所示，0.5 mmol·L-1和 2.0 mmol·L-1NaHS處理桑黃菌絲后，鈣調(diào)磷酸酶活性呈增加趨勢，其中2.0 mmol·L-1NaHS處理48 h時(shí)達(dá)到最大值，比對(duì)照增加了52.13%；而10 mmol·L-1NaHS處理桑黃菌絲后，鈣調(diào)磷酸酶活性呈降低趨勢，活性下降了 1.16%（9 h）～19.30%（18 h）。

2.3 NaHS處理對(duì)桑黃菌絲中鈣調(diào)蛋白活性的影響

NaHS處理對(duì)桑黃菌絲中鈣調(diào)蛋白活性的影響見圖3。

由圖3所示，0.5 mmol·L-1NaHS處理桑黃菌絲后，鈣調(diào)蛋白活性與對(duì)照相比增長了2.69%（24 h） ～18.35%（12 h）；2.0 mmol·L-1NaHS 處理桑黃菌絲后，鈣調(diào)蛋白活性與對(duì)照相比增長了15.89%（24 h） ～48.06% （48 h）；10.0 mmol·L-1NaHS 處理桑黃菌絲3 h～9 h內(nèi)，鈣調(diào)蛋白活性基本維持在對(duì)照水平，而后隨著處理時(shí)間的延長呈降低趨勢。

2.4 NaHS處理對(duì)桑黃菌絲中超氧陰離子產(chǎn)生速率的影響

NaHS處理對(duì)桑黃菌絲中超氧陰離子產(chǎn)生速率的影響見圖4。

由圖4A所示，除0.5 mmol·L-1NaHS處理18 h外，0.5 mmol·L-1和 2.0 mmol·L-1NaHS 處理桑黃菌絲后，超氧陰離子產(chǎn)生速率分別比對(duì)照降低了4.61%（24 h）～17.79%（12 h） 和 25.62%（9 h） ～57.79%（48 h）；而 10.0 mmol·L-1NaHS 處理桑黃菌絲后，超氧陰離子產(chǎn)生速率呈增加趨勢，且在處理的18 h時(shí)達(dá)到最大值，比對(duì)照增加了128.13%。

2 mmol·L-1NaHS 分別與 10 mmol·L-1CaCl2、0.3 mmol·L-1鈣離子通道阻斷劑鏈霉素、50 μmol·L-1CaM 拮抗劑三氟拉嗪 （TFP）、5 mmol·L-1Ca2+螯合劑EGTA、100 μmol·L-1鈣通道抑制劑 2-氨基乙酯二苯基硼酸（2-APB） 和0.5 mmol·L-1鈣通道阻斷劑氯化鑭（LaCl3）處理桑黃菌絲12 h后，超氧陰離子產(chǎn)生速率的變化趨勢如圖4B所示，2 mmol·L-1NaHS處理后桑黃菌絲中的超氧陰離子產(chǎn)生速率降低了48.38%，NaHS與10 mmol·L-1CaCl2共同處理桑黃菌絲后，超氧陰離子產(chǎn)生速率比NaHS單獨(dú)處理降低了34.38%，而NaHS與鈣通道阻斷劑或鈣離子螯合劑共同處理后，桑黃菌絲中的超氧陰離子產(chǎn)生速率均高于NaHS處理，并基本恢復(fù)到對(duì)照水平。

3 討論

3.1 NaHS處理下桑黃菌絲中不同形態(tài)鈣的轉(zhuǎn)化

植物體中不同形態(tài)的鈣具有其各自獨(dú)特的生理意義，且在不同外界條件下可相互轉(zhuǎn)化[21]。例如，小白菜在酸雨脅迫前期，其總鈣的增加主要體現(xiàn)在草酸鈣含量增加，而Ca(NO3)2/CaCl2和水溶性有機(jī)鈣之間出現(xiàn)了一個(gè)相互轉(zhuǎn)化的過程，即部分的水溶性有機(jī)鈣可能轉(zhuǎn)化為Ca(NO3)2/CaCl2。在酸雨脅迫后期，由于適應(yīng)了外界環(huán)境，不同形態(tài)鈣間轉(zhuǎn)化不明顯[22]。目前，對(duì)不同處理下細(xì)胞內(nèi)不同形態(tài)鈣具體變化的研究較少，尤其是在藥用真菌方面。試驗(yàn)分析了NaHS處理下桑黃菌絲中醇溶鈣、磷酸鈣、草酸鈣、果膠鈣、水溶鈣和總鈣含量的變化。研究發(fā)現(xiàn)，在0.5 mmol·L-1NaHS處理中期，桑黃菌絲中水溶鈣和醇溶鈣可能向果膠鈣發(fā)生了轉(zhuǎn)換，果膠鈣含量有較大增加，而10.0 mmol·L-1NaHS處理9 h左右果膠鈣可能向醇溶鈣和水溶鈣發(fā)生轉(zhuǎn)換。2.0 mmol·L-1NaHS處理后期，不同形態(tài)鈣含量均有所增加。

3.2 NaHS處理對(duì)鈣含量的作用

在NaHS處理下除不同形態(tài)鈣含量之間存在轉(zhuǎn)化外，總鈣含量也有一定的變化趨勢。H2S可提高植物的一些鈣信號(hào)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，并實(shí)現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子通道的激活，一定濃度的H2S處理對(duì)胞內(nèi)總鈣離子影響為促進(jìn)作用[23-24]，但是高濃度H2S處理會(huì)使動(dòng)物免疫力降低[25]。試驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度的NaHS處理對(duì)真菌中鈣離子影響總體為增加，而高濃度NaHS處理下鈣離子濃度降低。

鈣調(diào)蛋白CaM是真核細(xì)胞中一種與鈣結(jié)合的蛋白質(zhì)，激活許多真核細(xì)胞的酶系統(tǒng)和多個(gè)細(xì)胞代謝過程[26]。鈣調(diào)磷酸酶是Ca2+/CaM依賴性的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶。試驗(yàn)中低濃度NaHS對(duì)鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)磷酸酶活性影響均為促進(jìn)作用，高濃度表現(xiàn)為抑制，低濃度NaHS處理時(shí)胞內(nèi)鈣離子水平增加，胞內(nèi)突然增加的鈣離子與鈣調(diào)蛋白結(jié)合后會(huì)激活鈣調(diào)磷酸酶[27]。因此，CaM與鈣調(diào)磷酸酶的含量變化進(jìn)一步證明了低濃度NaHS處理對(duì)鈣離子含量的促進(jìn)作用。

3.3 NaHS清除超氧陰離子效應(yīng)的分析

H2S具有復(fù)雜的生物學(xué)活性，可參與動(dòng)植物的多種生理和病理過程[28]。在對(duì)動(dòng)植物生長發(fā)育調(diào)節(jié)的研究中發(fā)現(xiàn)，H2S與活性氧、Ca2+等信號(hào)路徑存在交叉互作關(guān)系。NaHS和Ca2+水平變化對(duì)超氧陰離子產(chǎn)生速率的影響的試驗(yàn)中，低濃度NaHS處理下超氧陰離子的產(chǎn)生速率降低，加入外源鈣離子后產(chǎn)生速率降低更多，加入鈣離子抑制劑與只加NaHS相比超氧陰離子產(chǎn)生速率明顯增加。證明低濃度NaHS處理可以清除菌絲中的超氧陰離子，而鈣離子在其中起到重要作用，因而推測低濃度NaHS對(duì)超氧陰離子的清除作用是通過誘導(dǎo)鈣離子產(chǎn)生而實(shí)現(xiàn)的，NaHS與鈣離子的共同調(diào)節(jié)可以大大減少超氧陰離子的含量，H2S與鈣離子在微生物體中有互作系統(tǒng)共同清除超氧陰離子。

低濃度NaHS處理下醇溶鈣、果膠鈣、水溶鈣對(duì)總鈣含量升高均有很大貢獻(xiàn)，但高濃度NaHS處理下水溶性鈣的降低趨勢是幾種形態(tài)鈣中與總鈣降低趨勢最貼合的。水溶鈣可改善植物的鹽脅迫作用、維持細(xì)胞滲透平衡、減少活性氧的產(chǎn)生[29]，高濃度NaHS處理下水溶性鈣含量持續(xù)處于較低水平的現(xiàn)象，與此時(shí)細(xì)胞活性損傷無法調(diào)節(jié)超氧陰離子含量、超氧陰離子大量累積的狀況相符合，由此推測水溶性鈣是總鈣含量變化的主要原因，水溶鈣在真菌中有類似減少活性氧產(chǎn)生的作用。

綜上所述，在外源H2S的影響下，細(xì)胞內(nèi)不同形態(tài)鈣相互轉(zhuǎn)化，而總鈣含量增加，從而激活鈣依賴酶系統(tǒng)，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)，從而共同促進(jìn)桑黃菌絲中超氧陰離子的清除。此互作系統(tǒng)具體聯(lián)系是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，可能是關(guān)于真菌抗逆性的重要機(jī)制，還需進(jìn)一步深入研究其機(jī)理。