閆帥帥， 郭 亮， 張聞桐， 李孟華， 劉 箐

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093

作為生命中最小的功能單元，單個(gè)細(xì)胞是地球上所有生物的基本組成部分和進(jìn)化的基本單位[1]。在看似相同的細(xì)胞群中，細(xì)胞個(gè)體性和差異性在生物學(xué)的許多關(guān)鍵領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用[2]。充分了解單個(gè)細(xì)胞的異質(zhì)性是闡述細(xì)胞分化、癌癥的起源、微生物進(jìn)化以及環(huán)境微生物群落功能等分子機(jī)制的基礎(chǔ)[3，4]。因此，研究單個(gè)細(xì)胞以了解異質(zhì)群體的復(fù)雜生物學(xué)并應(yīng)用于個(gè)性化醫(yī)療和耐藥細(xì)胞抗性等研究領(lǐng)域[5，6]。對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行無(wú)損、無(wú)標(biāo)記、準(zhǔn)確、高通量的分選是分析細(xì)胞間功能異質(zhì)性并探究自然界尚未培養(yǎng)微生物的關(guān)鍵工具[7]。

傳統(tǒng)的間接細(xì)胞分選是基于外部基因編碼的熒光蛋白標(biāo)記或磁性分子和化合物標(biāo)記進(jìn)行細(xì)胞的預(yù)分選，包括熒光激活細(xì)胞分選(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)和磁激活細(xì)胞分選(magnetically-activated cell sorting, MACS)，盡管它們都滿足高通量的需求，但是外加標(biāo)記或修飾可能會(huì)影響甚至改變細(xì)胞原本的狀態(tài)[8，9]。因此，開發(fā)無(wú)損、無(wú)標(biāo)記的功能性細(xì)胞分選的高通量技術(shù)是發(fā)展單細(xì)胞分析科學(xué)的必要條件[10]。拉曼光譜技術(shù)作為一種無(wú)標(biāo)記的生化指紋技術(shù)，能夠揭示單個(gè)細(xì)胞的內(nèi)在化學(xué)信息，對(duì)單細(xì)胞研究具有很大的潛力[11，12]。此外，拉曼光譜與單細(xì)胞操作技術(shù)(包括液體溶液中的微流控、微液滴、光鑷技術(shù)以及芯片上的激光噴射技術(shù))相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的分選，即拉曼激活細(xì)胞分選技術(shù)(Raman-activated cell sorting, RACS)[13-16]。

1 單細(xì)胞拉曼光譜(Single-cell Raman spectra, SCRS)

在過(guò)去的大約15年中，拉曼光譜已成為一種成熟的分析工具，可用于無(wú)損、快速地表征和鑒定單個(gè)細(xì)胞[17]。拉曼散射由光與分子的非彈性相互作用產(chǎn)生，光譜信號(hào)對(duì)應(yīng)于化學(xué)鍵的振動(dòng)，其依靠激發(fā)光的非彈性散射和分子共振可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生獨(dú)特“指紋圖譜”[18，19]。因?yàn)镾CRS本質(zhì)上是分子振動(dòng)的集合，其通常包含1000多個(gè)拉曼譜帶代表核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)等分類學(xué)標(biāo)記的不同振動(dòng)模式，體現(xiàn)了單個(gè)細(xì)胞豐富而復(fù)雜的固有信息，反映了細(xì)胞的基因表達(dá)、特定化合物的生物合成、細(xì)胞成分、特征結(jié)構(gòu)、生理狀態(tài)和代謝狀況等[20-22]。HANSON等[23]通過(guò)SCRS將置于不同營(yíng)養(yǎng)環(huán)境和生長(zhǎng)階段的分支桿菌進(jìn)行了區(qū)分和鑒定。HO等[24]對(duì)30株臨床病原菌的單層細(xì)胞僅采集1 s的時(shí)間，通過(guò)卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法對(duì)不同菌株進(jìn)行了區(qū)分和鑒定，達(dá)到了82%的準(zhǔn)確率，并成功應(yīng)用于相關(guān)臨床癥狀患者。此外，細(xì)胞中具有強(qiáng)拉曼響應(yīng)的特征物質(zhì)對(duì)靶細(xì)胞的表型表征至關(guān)重要，SONG等[25]基于類胡蘿卜素獨(dú)特的拉曼特征譜帶將海水樣品中光養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行分類，GUO等[26]通過(guò)D2O同位素標(biāo)記鑒定了飲用水中的不可培養(yǎng)細(xì)菌的代謝活性。GERMOND等[27]通過(guò)SCRS將大腸桿菌耐受和不耐受β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類等抗生素的細(xì)菌進(jìn)行了區(qū)分，并進(jìn)行相關(guān)基因型的分析，將單細(xì)胞表型和基因型相聯(lián)系。

2 液體中的單細(xì)胞拉曼分選

2.1 基于通道微流體技術(shù)的拉曼單細(xì)胞分選

將傳統(tǒng)的SCRS技術(shù)與通道微流體系統(tǒng)相結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)單細(xì)胞的計(jì)數(shù)和分選，并維持靶細(xì)胞活力。通道微流體系統(tǒng)是由軟光刻技術(shù)修飾的聚二甲基硅氧烷(PDMS)與玻璃組件相粘連形成多層、多通道的納米級(jí)微管、腔室和閥門組成[28，29]。通過(guò)施加壓力使微流體獲得流體動(dòng)力，以一定的流速來(lái)控制細(xì)胞樣品量，經(jīng)過(guò)下游的單細(xì)胞拉曼特異性檢測(cè)，利用滯留力(機(jī)械力、光學(xué)、磁力、介電泳等)對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行捕獲[30]。例如，LI等[31]基于特異性類胡蘿卜素拉曼譜帶信號(hào)強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，在微流體系統(tǒng)中對(duì)C12和C13標(biāo)記的藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。針對(duì)單細(xì)胞自發(fā)拉曼信號(hào)弱的劣勢(shì)，NOLAN等[32]將金屬納米粒子多重SERS標(biāo)簽與抗體或靶標(biāo)分子相偶聯(lián)，在微流體系統(tǒng)中特異性的捕獲靶細(xì)胞，通過(guò)SERS納米標(biāo)簽產(chǎn)生強(qiáng)而窄拉曼信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶細(xì)胞的多參數(shù)單細(xì)胞群體分析。

介電電泳(Dielectrophoresis, DEP)是在非均勻電場(chǎng)中由極化效應(yīng)引起的中性物質(zhì)的平移運(yùn)動(dòng)，可以直接在流體中捕獲微米級(jí)、納米級(jí)的微粒，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶細(xì)胞的捕獲[33]。在SCHR?DER等研究中，通過(guò)DEP可以在幾分鐘內(nèi)將懸浮液中大腸桿菌和糞腸球菌進(jìn)行分離和捕獲，并結(jié)合SCRS和多元統(tǒng)計(jì)分析實(shí)現(xiàn)對(duì)尿路感染患者的病原微生物分類[34]。CHRIMES等[35]首創(chuàng)的微流體-SERS-DEP系統(tǒng)對(duì)單個(gè)酵母細(xì)胞在不同生長(zhǎng)階段所分泌的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行了原位動(dòng)態(tài)檢測(cè)。利用SERS信號(hào)的強(qiáng)度對(duì)基于DEP固定在微流體環(huán)境中的細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)監(jiān)測(cè)，從而分析酵母細(xì)胞的代謝、增殖、凋亡以及細(xì)胞之間的化學(xué)傳遞。ZHANG等[36]開發(fā)了一種間歇排序的RACS微流控系統(tǒng)，通過(guò)施加周期性的正介電電泳(positive DEP, pDEP)場(chǎng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)胞的捕獲、排序并分別定位到用于拉曼測(cè)量的檢測(cè)點(diǎn)，并結(jié)合電磁閥吸氣的開關(guān)以進(jìn)行細(xì)胞分離，并成功用于基于類胡蘿卜素譜帶的酵母細(xì)胞的亞秒級(jí)分選。使得在高速流微流體中通過(guò)拉曼識(shí)別單個(gè)細(xì)胞和自動(dòng)分選成為可能。

當(dāng)基于外在的“滯留力”對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行捕獲或固定化時(shí)，可能會(huì)影響細(xì)胞原有的生理狀態(tài)，對(duì)檢測(cè)、分析細(xì)胞群體異質(zhì)性造成影響。MCLLVENNA等[37]開發(fā)無(wú)需靶細(xì)胞捕獲的拉曼微流控系統(tǒng)，其中的微流體壓力分配器基于內(nèi)在拉曼信號(hào)對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)和自動(dòng)分選。其中根據(jù)C12或C13標(biāo)記的藍(lán)細(xì)菌中的特異性類胡蘿卜素拉曼譜帶在2 s內(nèi)實(shí)現(xiàn)了單個(gè)細(xì)胞的拉曼光譜測(cè)量和分選。ZHANG等[38]建立的32通道多重受激拉曼散射流式細(xì)胞系統(tǒng)，在3 s內(nèi)將約400分化的和1 300個(gè)未分化的3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行分類和鑒定。

2.2 基于液滴微流體技術(shù)的拉曼單細(xì)胞分選

液滴微流體技術(shù)是微流控技術(shù)的重要分支，它利用水和油的不相溶性來(lái)制造微升或納升級(jí)液滴微反應(yīng)器，簡(jiǎn)單、快速的實(shí)現(xiàn)對(duì)懸浮液中的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行封裝[39，40]。微液滴基于其直徑的可控性、對(duì)單細(xì)胞封裝的便捷性、避免交叉感染的微反應(yīng)器等優(yōu)勢(shì)，使其成為的理想高通量單細(xì)胞分析技術(shù)[41]。

KIM等[42]將拉曼光譜、PDMS與微液滴系統(tǒng)偶聯(lián)，用微液滴包裹萊茵衣藻細(xì)胞，原位表征了其脂質(zhì)隨時(shí)間的變化。但是，微液滴凹凸表面和油性介質(zhì)可能對(duì)靶細(xì)胞的拉曼信號(hào)產(chǎn)生影響。WANG等[43]開發(fā)的拉曼激活液滴分選系統(tǒng)(Raman-activated droplet sorting，RADS)針對(duì)上述缺陷進(jìn)行了改進(jìn)，在液滴產(chǎn)生之前就對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行SCRS檢測(cè)，其主要對(duì)不同蝦青素產(chǎn)能的單細(xì)胞綠藻進(jìn)行了分選和鑒定。首先將細(xì)胞懸液加載到芯片為通道中，在兩個(gè)夾流的作用下使其形成單細(xì)胞流，當(dāng)細(xì)胞通過(guò)激光點(diǎn)時(shí)獲得SCRS，然后用微液滴將單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行封裝，經(jīng)過(guò)特定的延遲后，含有靶細(xì)胞的液滴通過(guò)DEP進(jìn)行分選并流入收集通道，而非目標(biāo)液滴將流入廢物通道。并且此系統(tǒng)的通量為每分鐘分選260個(gè)細(xì)胞，且可以維持分選靶細(xì)胞的活性。

XU等將微液滴系統(tǒng)與SERS相結(jié)合對(duì)不同癌癥細(xì)胞代謝異質(zhì)性進(jìn)行了分析。研究了癌細(xì)胞系(HepG2和BNL.CL2)中堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，API)的表達(dá)，將細(xì)胞懸液、BCIP(API的催化底物)和金納米顆粒共孵育后作為整體被包裹于微液滴中，將其置于三個(gè)平行通道的微芯片中，對(duì)產(chǎn)生的共振拉曼活性物質(zhì)BCI(API的催化產(chǎn)物)進(jìn)行SERS檢測(cè)[44]。此外，還建立了一種高通量、雙通道、基于SERS的等離子體微滴平臺(tái)用于檢測(cè)癌細(xì)胞系(MCF-7，HepG2，SGC和BNL.CL2)表面的唾液酸，并且在單細(xì)胞水平上成功的區(qū)分了不同癌細(xì)胞系。因此微液滴系統(tǒng)不僅可以分選單個(gè)靶細(xì)胞直接用于分類和鑒定，還可以通過(guò)分選靶細(xì)胞來(lái)間接研究相關(guān)代謝活性物質(zhì)，有利于全面研究細(xì)胞群體的異質(zhì)性和復(fù)雜性[45]。在藥物醫(yī)學(xué)，癌癥診斷和單細(xì)胞遺傳分析等臨床應(yīng)用中具有潛在的價(jià)值。

2.3 基于光鑷技術(shù)的拉曼單細(xì)胞分選

高度聚焦的激光束形成的光學(xué)鑷子提供非接觸式捕獲力來(lái)物理固定和移動(dòng)溶液中的單個(gè)細(xì)胞，同時(shí)，激光束作為激發(fā)源以生成靶細(xì)胞的拉曼指紋圖譜用于分類或鑒定[46]。近年來(lái)，這種高通量、無(wú)標(biāo)記的拉曼光譜與光鑷技術(shù)相結(jié)合，用于研究微通道中的單個(gè)細(xì)胞已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。

在早期拉曼光鑷技術(shù)用于單細(xì)胞分析時(shí)，通常是光鑷捕獲、固定細(xì)胞后，人工進(jìn)行輔助操作，將靶細(xì)胞移至收集區(qū)域。XIE等[47]利用拉曼光鑷技術(shù)將有活性和無(wú)活性的酵母細(xì)胞選擇性的分類到不同的收集區(qū)域，并進(jìn)行驗(yàn)證。HUANG等[48]利用拉曼光鑷技術(shù)識(shí)別毛細(xì)管中的目標(biāo)細(xì)胞，然后手動(dòng)將單細(xì)胞移至毛細(xì)管一端，進(jìn)行下游分析。隨著高通量、自動(dòng)化要求越來(lái)越高，更加符合單細(xì)胞分選條件的拉曼光鑷的技術(shù)平臺(tái)被逐步開發(fā)和完善。LAU等[49]將多通道微流體設(shè)備和激光鑷子拉曼光譜相結(jié)合，集成的RACS自動(dòng)化平臺(tái)直接將細(xì)胞遞送至激光阱拉曼系統(tǒng)并基于其拉曼特征對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選，并成功用于識(shí)別和分類兩種白血病細(xì)胞系，但是每個(gè)光譜采集時(shí)間需要120 s，耗時(shí)較高。DOCHOW等[50]將上述分選系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)，僅用10 s就可以對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行光譜采集、捕獲和收集，大大提高了分選的速率，并且可以用線性判別分析對(duì)五種細(xì)胞進(jìn)行分類和識(shí)別。FANG等[51]設(shè)計(jì)了一個(gè)葫蘆狀的微通道分選芯片，與拉曼光鑷相結(jié)合可以同時(shí)獲得一個(gè)獨(dú)立的單個(gè)細(xì)胞及其拉曼光譜，對(duì)四種不同細(xì)胞進(jìn)行了精確的單細(xì)胞分離，但是每次細(xì)胞分離需要3 min，分選速度收到了極大的限制。為了研究多種細(xì)菌群落的復(fù)雜性和異質(zhì)性，LEE等[52]建立了一個(gè)基于同位素標(biāo)記對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行分類的拉曼光鑷的自動(dòng)化光流體平臺(tái)，此方法與前人研究最大的區(qū)別是不受限于包含強(qiáng)拉曼相應(yīng)的標(biāo)志物的影響，適用于廣泛的單細(xì)胞分選。通過(guò)對(duì)四種模型細(xì)菌的分選，在高精度的提前下，每分鐘可以分選3.3～3.8個(gè)細(xì)胞。雖然，拉曼光鑷與微流控結(jié)合大大提高了單細(xì)胞的分選精度，但是需要進(jìn)一步的創(chuàng)新以實(shí)現(xiàn)更高的細(xì)胞分選率。

3 基于玻片的拉曼單細(xì)胞分選

對(duì)于復(fù)雜的自然界微生物群體在單細(xì)胞水平進(jìn)行異質(zhì)性分析時(shí)，最好保持其原始的環(huán)境和狀態(tài)。此外，許多微生物存在于土壤、糞便、生物膜等復(fù)雜固體介質(zhì)中，不適用于微液體相關(guān)的RACS技術(shù)進(jìn)行分析[53]。因此，利用拉曼激活細(xì)胞彈射(Raman-activated cell ejection, RACE)技術(shù)能夠?qū)Ω信d趣的單細(xì)胞進(jìn)行原位分選[54]。

RACE的概念在2013年第一次被提出，目標(biāo)細(xì)胞置于涂有CaF2的載玻片上進(jìn)行SCRS的采集，然后用激光誘導(dǎo)正向轉(zhuǎn)移技術(shù)從玻片上對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行分離[16]。但是此系統(tǒng)由個(gè)模塊配合完成，并且通過(guò)高功率激光的作用，會(huì)對(duì)單細(xì)胞造成損傷，不利于下游的測(cè)序分析。因此，SONG等[25]開發(fā)了一套多合一的RACE系統(tǒng)，在玻片上涂無(wú)拉曼信號(hào)Al層對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行SCRS采集，記錄靶細(xì)胞位置，將玻片翻轉(zhuǎn)后再進(jìn)行單細(xì)胞分選，通過(guò)基于類胡蘿卜素拉曼信號(hào)作為生物標(biāo)記物成功鑒定了紅海樣品中的潛在光養(yǎng)細(xì)菌，并推測(cè)了相關(guān)基因型。但是，所使用的玻片在翻轉(zhuǎn)過(guò)程中可能造成污染，對(duì)下游的全基因組擴(kuò)增和測(cè)序造成影響。JING等[55]基于上述劣勢(shì)，將涂有銦錫氧化物的透明的石英分選芯片與收集裝置合二為一，更完善了RACE的分選模塊，通過(guò)對(duì)中國(guó)黃海中光合細(xì)菌的同位素標(biāo)記和靶細(xì)胞的RACE，并結(jié)合下游測(cè)序重新編碼了兩個(gè)關(guān)鍵細(xì)菌CO2固定代謝途徑的近乎完整的基因組。WANG等[56,57]在前人研究的基礎(chǔ)上，利用RACE系統(tǒng)對(duì)人類腸道菌群中功能性細(xì)菌的相關(guān)代謝途徑和耐藥性等進(jìn)行了表型和基因型的分析。然而，RACE系統(tǒng)分選的細(xì)胞大多不具有細(xì)胞活性，達(dá)不到對(duì)原位分選的單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的需求。

4 總結(jié)與展望

在過(guò)去十年中，已經(jīng)開發(fā)了許多越來(lái)越準(zhǔn)確、快速、智能化的RACS集成技術(shù)用于分析單個(gè)細(xì)胞。RACS作為一種無(wú)標(biāo)簽的單細(xì)胞分選技術(shù)，為了解同基因細(xì)胞群體中的表型異質(zhì)性和探索復(fù)雜細(xì)胞群體中的單細(xì)胞功能提供了新的研究方法，開辟一個(gè)新的細(xì)胞生物學(xué)的領(lǐng)域。盡管，現(xiàn)階段對(duì)于單個(gè)細(xì)胞分選已達(dá)到了很高的準(zhǔn)確率，但是自動(dòng)化的分選速率還有待提高，這依賴于RACS與更精密的拉曼光譜儀、更先進(jìn)的SERS技術(shù)相集成。更普適的RACS有望在未來(lái)適合所有環(huán)境樣本的單細(xì)胞分析，對(duì)群體中細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及表型和基因型的聯(lián)系有更好的解釋，對(duì)于精準(zhǔn)醫(yī)療和探索環(huán)境不可培養(yǎng)微生物意義重大。