錢佳琳 余水靜 周亮亮

摘要：柑桔潰瘍病是由地毯黃單胞桿菌（Xanthomonas axonopodis pv.Cirri.Xac）引起的危害全球柑桔的重要病害。生物防治以其高效、安全、環(huán)保受到柑桔潰瘍病防控研究工作者們的青睞。從基因工程技術(shù)、生物拮抗菌及噬菌體技術(shù)等方面綜述了柑桔潰瘍病生物防治的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：柑桔潰瘍病;病原菌;基因工程;拮杭菌;噬菌體

柑桔潰瘍?。–itrus Bacterial Canker Disease，CBCD）是由地毯黃單胞桿菌（Xanthomonas axonopodispv.Citri.Xac）引起的危害全球柑桔的重要病害，是國內(nèi)外檢疫的對象[1]。該病害對柑桔造成極大的破壞，感染的嚴(yán)重程度會因不同的物種和品種以及氣候條件而異。潮濕天氣，細(xì)菌細(xì)胞從現(xiàn)有病變中滲出，為病害的進(jìn)一步發(fā)展提供接種物。與許多其他細(xì)菌性疾病一樣，病原菌借風(fēng)雨、昆蟲，從氣孔、皮孔和傷口侵入。潛育期的長短因品種的抗（感）病性、組織的老熟程度和溫度而異，一般為3～10d。在氣溫25～30℃下，雨量與病害發(fā)生成正相關(guān)，高溫多雨季節(jié)發(fā)病嚴(yán)重[2]。柑桔潰瘍病雖對人體無害，但會影響新鮮水果的適銷性，造成經(jīng)濟(jì)損失。生物防治以其高效、安全、環(huán)保受到研究工作者們的青睞，利用生物技術(shù)防治潰瘍病具有很大的潛力和市場前景?，F(xiàn)將近年來柑桔潰瘍病生物防治方面的研究進(jìn)展作簡要綜述。

1 柑桔潰瘍病的病原

柑桔潰瘍病菌系具有品種特異性。由X.ax-onopodis pv.Citri（Xac）引起的柑桔潰瘍病，是迄今為止最普遍和最嚴(yán)重的疾病。因最初出現(xiàn)在亞洲，所以稱由該菌株導(dǎo)致的潰瘍病為亞洲潰瘍?。ˋsiatic citruscanker，ACC），即A菌系。該病在印度、巴基斯坦、印度洋島嶼、東南亞、中國和日本流行。B菌系，由X.ax-onopodis pv.aurantifolii引起的B菌系潰瘍病（或假潰瘍?。┦前屠纭⒏?、烏拉圭檸檬上的嚴(yán)重病害，墨西哥萊檬、酸橙和袖子也易受到影響。C菌系，也是由X.axonopodis pv.aurantifolii引起的，已在巴西的墨西哥酸橙中分離出來，癥狀與A菌系潰瘍病相似[3-4]。1981年，在墨西哥的科馬利地區(qū)萊檬上發(fā)現(xiàn)了1株單一菌株，主要為害墨西哥萊檬和袖子樹以及波斯萊檬，即D菌系[5]。佛羅里達(dá)州于1984年發(fā)現(xiàn)了1株新的黃單胞菌株，該細(xì)菌與現(xiàn)有的引起潰瘍病的A、B和C的2株X.axonopodis病原體無關(guān)，命名為X.axonopodis pv.cit-rumelo，即E菌系。在沙特阿曼、阿拉伯、伊朗、印度發(fā)現(xiàn)一種A^*菌系，其宿主范圍僅限于墨西哥萊檬，且與常見的A菌系有所不同[6]。在留尼旺島和印度洋周圍的島嶼發(fā)現(xiàn)了一種A菌株的非典型形式，其對青霉素相關(guān)抗生素具有高水平的抗性[7]。

2 生物防治

由于大量地施用化學(xué)藥劑，造成植物體內(nèi)農(nóng)藥殘留累積、產(chǎn)量降低、環(huán)境污染，當(dāng)前人們對蔬菜瓜果的無污染、無殘留、無公害生產(chǎn)的需求越來越高，國內(nèi)外柑桔產(chǎn)區(qū)都在積極探索生物防治策略以控制柑桔潰瘍病，利用生物農(nóng)藥防治柑桔潰瘍病已經(jīng)成為人們關(guān)注的焦點。目前，柑桔潰瘍病的生物防治仍處于基礎(chǔ)研究階段，主要是通過基因工程技術(shù)、生物拮抗菌及噬菌體技術(shù)等來抑制柑桔潰瘍病的發(fā)生及感染。

2.1 基因工程技術(shù)

采用基因工程技術(shù)，可通過編碼抗菌肽基因的過量表達(dá)、抗病蛋白和來自非植物來源的轉(zhuǎn)錄因子等策略，增強(qiáng)柑桔防御或在感染部位參與誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡以提高柑桔對潰瘍病的抵抗力。羅賽男等[8]將獲得轉(zhuǎn)TERF1基因糖橙的春梢葉片進(jìn)行柑桔潰瘍病病原菌的接種。試驗表明，在接種病原菌后，轉(zhuǎn)基因植株的平均發(fā)病率下降了50%左右，且發(fā)病的時間比冰糖橙和對照推遲了7d，其中3號株系的抗病性最強(qiáng)，葉片無病癥。Yang等[9]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將pth A-nls轉(zhuǎn)移到甜橙中。體外試驗顯示，當(dāng)用2.5×107cfu/mL的潰瘍病病原菌溶液進(jìn)行針刺接種時，nls+轉(zhuǎn)基因克隆沒有顯示典型的病變發(fā)展，體內(nèi)試驗結(jié)果表明，當(dāng)針刺接種以104～105cfu/mL進(jìn)行時，Sucarri甜橙的最低發(fā)病率為23.3%，Bingtang甜橙的發(fā)病率最低為33.3%。當(dāng)噴霧接種104～107cfu/mL病原體時，nls+轉(zhuǎn)基因克隆沒有出現(xiàn)任何癥狀，甚至濃度升至109cfu/mL，發(fā)病率為20%～80%。

X Zhang等[10]生成表達(dá)擬南芥NPR1基因（At-NPR1）的轉(zhuǎn)基因Duncan葡萄袖（DG）和Hamlin甜橙（Ham）。柑桔中AtNPR1的過量表達(dá)增加了對柑桔潰瘍病的抗性，具有最高表達(dá)水平的AtNPR1的品系（DG 42-2）是最具抗性的，伴隨著黃單胞菌屬群體減少10倍，其產(chǎn)生明顯較少的病變。Nicolas等[11]將菠蘿甜橙植物用遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，促使蛙皮抗菌肽的組成型積累;與未轉(zhuǎn)化的植物相比，轉(zhuǎn)基因植物在受控條件下進(jìn)行的植物測定中顯示出減少了高達(dá)50%的柑桔潰瘍病癥狀。此外，轉(zhuǎn)基因植物中存在的較小尺寸的潰瘍和在癥狀發(fā)展中觀察到的延遲表明疾病嚴(yán)重程度顯著降低。

Li等[12]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化，將水稻基因Xa21與GUS報告基因和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPT）一起導(dǎo)入安柳城甜橙。通過體外針刺接種評估3種回收的轉(zhuǎn)基因系T2、T4和T6對柑桔潰瘍病的耐受性，發(fā)現(xiàn)3種轉(zhuǎn)基因株系均對柑桔潰瘍病菌感染具有較高的抗性，T4轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出較高的抗性。表明水稻Xa21基因為對抗柑桔潰瘍病是可行的。

Sendin等[13]在柑桔轉(zhuǎn)基因植株中評價了辣椒Bs2基因穩(wěn)定表達(dá)對柑桔潰瘍病抗性的影響。在表達(dá)Bs2的轉(zhuǎn)基因品系中觀察到相對于未轉(zhuǎn)化的對照植物，潰瘍病癥狀減少高達(dá)70%。Takehiko等[14]產(chǎn)生過量表達(dá)芳樟醇合成酶基因（CuSTS3-1）的轉(zhuǎn)基因Hamlin甜橙（Citrus sinensis L.Osheck）植物，具有最高芳樟醇含量的轉(zhuǎn)基因品系（LIL），在噴灑細(xì)菌時顯示出對柑桔潰瘍病的強(qiáng)抗性。

Adilson等[15]使用成熟外植體的薄切片的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化獲得組成型表達(dá)與來自煙草的PR1a信號肽融合的肌肉毒素IA肽的轉(zhuǎn)基因Pera甜橙，通過滲入和噴霧接種黃單胞菌進(jìn)行轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物葉片中的柑桔潰瘍病抗性評估。與非轉(zhuǎn)基因植物相比，轉(zhuǎn)基因植物葉片中的黃單胞菌群體低至2個對數(shù)單位。在注射浸潤或用黃單胞菌接種物噴霧后，非轉(zhuǎn)化對照（大于10個病灶/cm²）中潰瘍病灶的發(fā)生率顯著高于轉(zhuǎn)基因植物（小于5個病灶/cm²）。

2.2 生防拮杭菌

已知對柑桔潰瘍病菌有拮抗作用的微生物有枯草芽孢桿菌（Bacillus suhtilis（Ehrenherg）Cohn 1872，174）、草生歐氏桿菌（Erwinia herhicola（Lohnis）Dye 1964，268）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens Migula1895，29）和丁香假單胞桿菌（Pseudomonas syringae vanHall 1902，141）以及腐生的Xanthomonas sp.[3]。

譚小艷等[16]從南寧柑桔園土壤中分離到1株對柑桔潰瘍病菌具有強(qiáng)抑制力的鮑氏不動桿菌Bt8。在溫室條件下將該細(xì)菌懸浮液噴施到柑桔葉片上，該菌對柑桔潰瘍病具有53%的抑制率。

張洪波等[17]從柑桔葉表篩選出菌株KxI5和Kx48（初步鑒定分別屬于葡萄糖桿菌屬和乳酸桿菌屬）對柑桔潰瘍病防治效果明顯，在溫室條件下對柑桔潰瘍病的防治效果分別達(dá)到45.6%和55.6%，在重病果園中的防治效果分別為40.3%、47.7%，且Kx48要優(yōu)于KxI5。董玉蘭等[18]從湖南省不同地區(qū)的土壤樣品中篩選獲得3株拮抗效果突出的菌株CLT3、CLH2、CZRI，且防效基本都在50%以上。其中以CLT3的防效最佳，達(dá)到83.85%。經(jīng)鑒定CLT3為鏈霉菌屬，CLH2為假甲胞蔚屬，CZRI為克氏菌屬。

馬冠華等[19]篩選出3個對柑桔潰瘍病菌有拮抗作用的放線菌菌株，抑菌圈直徑達(dá)42.0～60.0mm，且能破壞柑桔潰瘍病菌細(xì)胞膜完整性，增加細(xì)胞膜通透性，引起細(xì)胞質(zhì)外滲。劉冰等[20]從贛南臍橙篩選到1株柑桔潰瘍病生防內(nèi)生細(xì)菌GN232，經(jīng)鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis sub sp.Subtilis），其抗細(xì)菌活性代謝產(chǎn)物在中性環(huán)境下穩(wěn)定，對溫度不敏感，紫外線照射25min后發(fā)酵濾液抑菌活性降低，胰蛋白酶對發(fā)酵濾液活性無明顯影響;此外，該菌株發(fā)酵上清液和農(nóng)用鏈霉素混用后對潰瘍病菌的抑制效果較單獨發(fā)酵濾液、農(nóng)用鏈霉素的抑菌效果分別提高26.8%和20.7%。

Julia等[21]從巴西Caatinga生物群系中分離的放線菌及其粗提取物針對不同的黃單胞菌屬（Xan-thomonas citri）亞種菌株進(jìn)行了測試。研究發(fā)現(xiàn)，Caat1-54提取物可有效預(yù)防Xcc對葉片的新感染，但不能減少預(yù)先建立的柑桔潰瘍病灶中的Xcc群體。OrawanDaungfu等[22]從6種健康柑桔屬植物中分離獲得內(nèi)生細(xì)菌。用解淀粉芽孢桿菌LE109或枯草芽孢桿菌LE24的細(xì)胞懸浮液接種的葉子可以完全控制柑桔潰瘍病。而接種了B.tequilensis PO80的葉子顯示出10%的發(fā)病率。用解淀粉芽孢桿菌LE109或枯草芽孢桿菌LE24的粗生物活性化合物處理的葉子可以完全控制柑桔潰瘍病。但用B.tequilensis PO80的粗生物活性化合物處理的葉子顯示出5%的發(fā)病率。

2.3 噬菌體技術(shù)

用于疾病控制的噬菌體的使用是植物保護(hù)的快速擴(kuò)展領(lǐng)域，具有替代現(xiàn)有化學(xué)控制措施的巨大潛力。Balogh等[23]在溫室實驗中發(fā)現(xiàn)，噬菌體處理柑桔潰瘍病，導(dǎo)致疾病嚴(yán)重程度平均降低59%。在商業(yè)柑桔苗圃試驗中，噬菌體處理顯著減少了中度敏感的瓦倫西亞橙潰瘍病感染（48%和35%）;然而，在高度敏感的葡萄袖宿主上，它是無效的。在實驗性柑桔苗圃中，噬菌體處理提供了由噬菌體敏感菌株引起的柑桔細(xì)菌斑的顯著控制。

Ahmad等[24]分離并表征絲狀噬菌體XacF1可以感染柑桔潰瘍病菌。XacF1噬菌體的感染引起細(xì)菌宿主細(xì)胞的幾種生理變化，包括較低水平的細(xì)胞外多糖產(chǎn)生，運(yùn)動性降低，生長速度較慢以及毒力顯著降低。毒力的降低表明可能利用XacF1作為抗柑桔潰瘍病的生物控制劑。

當(dāng)用商業(yè)系統(tǒng)獲得性抗性（Systemic acquired re-sistance，SAR）誘導(dǎo)劑和拮抗性細(xì)菌作為柑桔潰瘍病綜合管理方法的一部分時，噬菌體處理表現(xiàn)出良好的效果。Ibrahim等固特阿拉伯溫室和田間條件下的柑桔潰瘍病葉子上，將配制的噬菌體與脫脂乳和蔗糖或非配制的噬菌體與acibenzolar-S-methy]（ASM）的組合應(yīng)用與銅殺菌劑應(yīng)用以抑制柑桔潰瘍病相比較。在溫室條件下，用氫氧化銅或噬菌體與ASM組合處理的植物，ACC在葉片上的發(fā)生率分別從75.2%顯著降低至12.8%或18.3%。與未處理的對照植物相比，在田間條件下配制的噬菌體與ASM組合作為土壤灌溉的應(yīng)用顯著降低了14.8%（試驗1）和16.8%（試驗2）的發(fā)病率。用噬菌體與ASM組合處理的Xcc接種的植物在溫室和田間條件下顯示出顯著的ACC降低。

3 問題與展望

柑桔潰瘍病嚴(yán)重感染會導(dǎo)致多種后果，包括葉片脫落、果實品質(zhì)下降和過早落果，是威脅柑桔產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的嚴(yán)重病害。目前，生物防治試驗研究方法雖然能在一定程度上減輕柑桔潰瘍病。但是，許多的生物拮抗菌及噬菌體的試驗研究都是在室內(nèi)進(jìn)行，可以人為控制某些環(huán)境因素，田間環(huán)境多變且有許多不定因素，對其防治效果還有待研究?？剐栽耘嗥贩N的使用是最好的、長期的、最具成本效益和永久有效的管理柑桔潰瘍病的方案，而基因工程可以補(bǔ)充經(jīng)典的柑桔育種并增強(qiáng)易感商業(yè)品種的抗病性。已有大量的研究表明，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)引入抗性基因至感病品種能降低潰瘍病的發(fā)生。雖然目前可通過基因工程技術(shù)提升植株抗?jié)儾∧芰?，但仍未大面積田間推廣栽培。由于突變新菌株的產(chǎn)生，需要更好地了解Xac菌株的致病特性及正確鑒定，這對于培育新的柑桔潰瘍病抗性品種具有重要意義。（收稿：2019-07-01）

參考文獻(xiàn)：

[1]MA Favaro，RA Roeschlin，GG Ribero，et al.Relationships betweencopper content in orange leaves，bacterial biofilm formation and citruscanker disease control after different copper treatments[J].Crop Protec-tion，2017，92：182-189.

[2]朱明磊，陸學(xué)忠，郭鄂平，等.柑桔潰瘍病的發(fā)生規(guī)律及綜合防治研究[J].現(xiàn)代園藝，2012，21：015.

[3]E，L.Civero.世界柑桔潰瘍病及其病原菌的研究現(xiàn)狀和進(jìn)展[J].植物檢疫，1990，02：115-120.

[4]Gottwald，T.R.，Graham，J.H.，Schubert，T.S.2002.Citrus canker：Thepathogen and its impact.Online[J].Plant Health Progress.doi：10.1094/PHP-2002-0812-01-RV.

[5]Medina-Urrutia，V.M.，Stapleton，J.J.Confrol of Mexican lime bacte-riosis with copper-based products[J].Proc.FI.State Hort.Soc.1986.98：22-25.

[6]Verni a re，C.，Hartung，J.S.，Pruvost，O.P.，et al.Characterization of phe-notypically distinct strains of Xanthomonas axonopodis pv.citri fromSouthwest Asia[J].Europ.J.Plant Patho1，1998.104：477-487.

[7]A.K.Das.Citrus canker-A review[J].J.AppI.Hort，2003.5（1）：52-60.

[8]羅賽男，鄧子牛，鐘曉紅，等.TERF1基因增強(qiáng)糖橙抗病性的初步研[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報.2008，28（5）：71-76.

[9]L Yang，C Hu，N Li，et al.Transformation of sweet orange[Citrussinensis（L.）Osbeck] with pthA-nls for acquiring resistance to citruscanker disease[J].Plant Molecular Biology，2011，75（1-2）：11-23.

[70]X Zhang，MI Francis，WO Dawson，et al.Over-expression of theArabidopsis NPR1 gene in citrus increases resistance to citrus canker[J].European Journal of Plant Pathology.2010，1128（1）：91-100.

[11]N Furman，K Kobayashi，MC Zanek，et al.Transgenic sweet orangeplants expressing a dermaseptin coding sequence show reduced symptomsof citrus canker disease[J].Journal of Biotechnology，2013，167（4）：412-419.

[12]D LI，X Xuan，W GUO.Production of Transgenic AnliuchengSweet Orange（Citrus sinensis Osbeck）with Xa21 Gene for PotentialCanker Resistance[J].Journal of Integrative Agriculture，2014，13（11）：2370-2377.

[13]LN Send i n，IG Orce，RL G o mezet al.lnducible expression of Bs2R gene from Capsicum chacoense in sweet orange（Citrus sinensis L.Os-beck）confers enhanced resistance to citrus canker disease[J].Plant Molec-ular Biology，2017，93（6）：607-621.

[14]T Shimada，T Endo，A Rodr i guez，et al.Ectopic accumulation oflinalool confers resistance to Xanthomonas citri subsp.citri in transgenicsweet orange plants[J].Tree Physiology Journa1，2017，37（5）：654-664

[15]AK Kobayashi，LGE Vieira，JC Bespalhok Filho，et al.Enhanced resis-tance to citrus canker in transgenic sweet orange expressing the sarcotox-in IA gene[J].European Journal of Plant Pathology，2017，149（4）：865-873.

[16]譚小艷，黃思良，任建國，等.柑桔潰瘍病生防細(xì)菌Bt8的研究[J].微生物學(xué)報，2006，46（2）：292-296.

[17]張洪波，巢進(jìn)，王躍強(qiáng)，等.柑桔潰瘍病拮杭菌的分離篩選及其田間防效[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，33（5）：605-607.

[18]董玉蘭，唐前君易圖永等.柑桔潰瘍病土壤拮抗菌的篩選、鑒定及防效測定[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，（09）：77-80.

[19]馬冠華，楊鏡禎，易龍，等.柑桔潰瘍病拮抗放線菌篩選及其抑菌機(jī)理研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（30）：10547-10549.

[20]劉冰，宋水林，劉曉麗，等.柑桔潰瘍病生防內(nèi)生細(xì)菌的篩選、鑒定及其活性代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，27（12）：2152-2158.

[2]]JP Rodrigues，APF Peti，F(xiàn)S Figueir 6 ，et al.Bioguided isolation，char-acterization and media optimization for production of Lysolipins by acti-nomycete as antimicrobial compound against Xanthomonas citri subsp.Citri[J].Molecular Biology Reports，2018，45（6）：2455-2467.

[22]Daungfu O，Youpensuk S，Lumyong S.Endophytic Bacteria Isolatedfrom Citrus Plants for Biological Control of Citrus Canker in Lime Plants[J].Trop Life Sci Res.2019，30（1）：73-88.

[23]Balogh B，Canteros BI，Stall RE，et al.Control of Citrus Canker andCitrus Bacterial Spot with Bacteriophages[J].Plant Disease，2008，92（7）：1048-1052.

[24]Ahmad AA，Askora A，Kawasaki T，et al.The filamentous phageXacF1 causes loss of virulence in Xanthomonas axonopodis pv.citri，thecausative agent of citrus canker disease[J].Frontiers in Microbiology，2014，5：321.

[25]Ibrahim YE，Saleh AA，AI-Saleh MA.Management of Asiatic CitrusCanker Under Field Conditions in Saudi Arabia Using Bacteriophagesand Acibenzolar-S-Methyl[J].Plant Disease，2017，101（5）：761-765.

作者簡介：錢佳琳（1995-），女，碩士研究生，主要研究方向：柑桔潰瘍病生物防治。

通信作者：余水靜（1976-），男，副教授，博士，主要研究方向：環(huán)境微生物。