楊立榮 孫秀秀 陳加利 云 勇 陳 宣 鄭道君*

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶園藝研究所，?？?571100； 2.海南省熱帶特種經(jīng)濟(jì)植物種質(zhì)資源創(chuàng)新利用重點實驗室，?？?571100)

文昌錐(Castanopsiswenchangensis)俗稱“杠酸”“油酸”為殼斗科(Fagaceae)錐屬(Castanopsis)植物，僅分布于海南文昌東北部常綠季雨林地區(qū)[1]。文昌錐堅果淀粉含量在60%～80%，其味美可口，營養(yǎng)價值高，在文昌及?？诘貐^(qū)食用歷史悠久，為優(yōu)良的特色干果經(jīng)濟(jì)樹種資源，具有良好的開發(fā)前景。文昌錐分布范圍小，居群數(shù)量少，個體數(shù)量少，為海南特有的極小種群物種。野外調(diào)查僅發(fā)現(xiàn)7個文昌錐居群，全部的個體數(shù)量700株左右。文昌錐是其群落中的優(yōu)勢種或建群種之一，對穩(wěn)定脆弱的海南島東北部常綠季雨林生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義[2]。文昌錐主要分布在土壤貧瘠的沙地，生長環(huán)境惡劣，且其資源及生境經(jīng)常受到臺風(fēng)干擾和人為破壞，種質(zhì)資源數(shù)量日趨變少。因此，文昌錐種群的保護(hù)和擴(kuò)種迫在眉睫，本研究系統(tǒng)地從文昌錐種群生態(tài)、生殖生態(tài)、種群遺傳等方面進(jìn)行研究，對揭示文昌錐種群進(jìn)化歷史及有效保護(hù)和恢復(fù)該種群具有重要作用。目前針對文昌錐種群保護(hù)生物學(xué)方面的研究幾乎處于空白。

目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(start codon targeted polymorphism，SCoT)標(biāo)記是Collard和Mackill在2009年開發(fā)的一種新型單引物擴(kuò)增的分子標(biāo)記技術(shù)[3～4]。該標(biāo)記是根據(jù)基因翻譯起始點(ATG)的側(cè)翼序列的一致性和保守性，設(shè)計引物擴(kuò)增目的基因。具有操作簡單方便，引物通用性強(qiáng)，成本低，多態(tài)性高，遺傳信息豐富等優(yōu)點。近幾年已經(jīng)在柑橘[5]、枇杷[6]、龍眼[7]等植物完成體系建立與優(yōu)化；在甘蔗[8]、鐵皮石斛[9]、裸果木[10]等植物進(jìn)行遺傳多樣性與親緣關(guān)系的研究；在皂莢[11]、甜橙[12]、馬鈴薯[13]等植物建立種質(zhì)資源鑒定與指紋遺傳圖譜；在花生[14]、甘蔗[15]、柑橘[16]完成基因差異表達(dá)和分子遺傳圖譜的建立。但SCoT標(biāo)記技術(shù)尚未在殼斗科植物上應(yīng)用。

本研究利用單因子試驗和正交試驗研究文昌錐SCoT分析的最佳反應(yīng)條件，首次建立了一套穩(wěn)定的文昌錐SCoT-PCR反應(yīng)體系并篩選出有效SCoT引物，為后期文昌錐種質(zhì)資源鑒定、譜系地理學(xué)和保護(hù)遺傳學(xué)等提供技術(shù)支持，也對SCoT標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于其他殼斗科植物研究具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用材料取自海南省文昌市公坡鎮(zhèn)龍飛頭村文昌錐居群和海南省文昌市昌灑鎮(zhèn)寶彩山村文昌錐居群，材料編號依次為：LFT-01、BC-02和BC-20。取健康葉片用硅膠干燥保存?zhèn)溆?。實驗材料憑證標(biāo)本編號LFT-001(19.800054N，110.845677E，海拔33.1 m)，憑證標(biāo)本現(xiàn)存放于海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶園藝研究所實驗室。

1.2 基因組DNA的提取

采用FOREGENE試劑盒提取文昌錐的葉片DNA。紫外分光光度計檢測基因組DNA的純度和濃度，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的質(zhì)量，將葉片所獲的基因組DNA樣品濃度稀釋到20 ng·μL-1保存在-20℃冰箱備用。

1.3 SCoT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化與建立

1.3.1 單因素試驗設(shè)計

80條SCot引物根據(jù)Collard[3]和Luo[17]設(shè)計，由北京諾塞基因組研究中心有限公司合成。以LFT-01基因組DNA為模板，選用引物組合SCoT5(序列為：CAACAATGGCTACCACGA)，初始反應(yīng)條件為2×PCR buffer 2 μL，Taq DNA聚合酶1 U，dNTPs 0.3 mmol·L-1，引物濃度0.8 μmol·L-1和模板DNA 40 ng，用ddH20補(bǔ)足到20 μL。擴(kuò)增程序為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，54℃復(fù)性1 min，72℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物放于4℃保存。保持其他因素不變的情況下變換一種因素的濃度進(jìn)行擴(kuò)增(表1)，篩選適宜的濃度范圍用于正交試驗。

表1 SCoT-PCR單因素試驗設(shè)計

Table 1 SCoT-PCR single factor experiment design

試驗水平Test level模板DNATemplate DNA(ng)引物Primer(μmol·L-1)dNTPs(mmol·L-1)Taq DNA聚合酶Taq DNA polymerase(U)10.00.050.0250.0522.50.100.0500.2535.00.200.1000.50410.00.300.2000.75520.00.400.3001.00630.00.500.4001.50740.00.600.5002.00850.00.800.6003.00960.00.900.8004.001070.01.001.0005.00

1.3.2 正交試驗設(shè)計

基于單因素試驗結(jié)果，進(jìn)行L16(45)方案的正交試驗[18]，確立最優(yōu)反應(yīng)體系。參照鄭道君等[16～17]的直觀分析法，根據(jù)擴(kuò)增條帶的清晰度和豐富度對16個組合的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行打分，最優(yōu)擴(kuò)增結(jié)果為16分，最差為1分。分別進(jìn)行兩次獨立計分，取兩次的平均數(shù)。進(jìn)行極差R值分析。

1.4 SCoT-PCR反應(yīng)體系驗證和多態(tài)性引物評價

以LFT-01的基因組DNA為模板，采用優(yōu)化建立的反應(yīng)條件，對80個SCoT引物進(jìn)行初選，選擇擴(kuò)增條帶3條以上的引物進(jìn)行復(fù)選。

以3份地理距離相差較遠(yuǎn)的文昌錐資源(LFT-01、BC-02、BC-20)的基因組DNA為模板，以多態(tài)性比率(PPB)為主要評價標(biāo)準(zhǔn)，對初選獲得的SCoT引物進(jìn)行多態(tài)性評價和復(fù)選，并進(jìn)行反應(yīng)體系穩(wěn)定性驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 模板DNA的用量對SCoT-PCR的影響

如圖1所示，文昌錐基因組DNA的濃度對SCoT-PCR擴(kuò)增影響差異顯著。DNA用量為2.5～50.0 ng(圖1：泳道2～8)時擴(kuò)增條帶豐富且清晰穩(wěn)定；當(dāng)DNA的用量達(dá)到60 ng以上時(圖1：泳道9～10)，擴(kuò)增強(qiáng)度降低和擴(kuò)增產(chǎn)物減少，在泳道10(DNA用量為70 ng)僅擴(kuò)增獲得1條550 bp的產(chǎn)物?？梢?，文昌錐基因組DNA的用量越多，對SCoT-PCR反應(yīng)效率就越差。經(jīng)初選，確定2.5～20.0 ng為SCoT-PCR的適宜DNA濃度范圍，用于正交試驗。

2.1.2 引物濃度對SCoT-PCR的影響

引物是PCR反應(yīng)中的重要原料之一，引物濃度過低時擴(kuò)增產(chǎn)物少或沒有，引物濃度過高時反應(yīng)的特異性降低[18]。本試驗結(jié)果表明，設(shè)計的濃度范圍內(nèi)，引物濃度越高時，文昌錐SCoT-PCR擴(kuò)增效果越好(圖1：泳道11～20)。引物濃度小于0.2 μmol·L-1時無擴(kuò)增產(chǎn)物；當(dāng)引物濃度為0.2 μmol·L-1(圖1：泳道13)時僅擴(kuò)增1條大于2 000 bp的產(chǎn)物；當(dāng)達(dá)到在0.5 μmol·L-1及以上濃度(圖1：泳道16～20)時達(dá)到穩(wěn)定，擴(kuò)增條帶多且條帶清晰。因此，選擇引物濃度范圍0.5～1.0 μmol·L-1作為正交試驗設(shè)計的適宜濃度。

圖1 DNA模板用量和引物濃度對SCoT-PCR反應(yīng)體系的影響Fig.1 Effect of template DNA concentration and primer concentration on SCoT-PCR reaction system M. 100 bp DNA marker; 1-10. 0,2.5,5,10,20,30,40,50,60 and 70 ng(DNA); 11-20. 0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.8,0.9 and 1.0 μmol·L-1(Primer)

2.1.3 dNTPs濃度對SCoT-PCR的影響

dNTPs作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的原材料，其濃度過低時，會導(dǎo)致擴(kuò)增效率低，條帶弱或不產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物[19]；當(dāng)濃度過高時，會降低鎂離子與Taq DNA聚合酶的結(jié)合效率。隨著dNTPs濃度的增加，SCoT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由有到無(圖2)。dNTPs濃度為0.025 mmol·L-1時，泳道1擴(kuò)增效率低且擴(kuò)增條帶少。當(dāng)濃度在0.05～0.30 mmol·L-1范圍內(nèi)時，擴(kuò)增條帶豐富且主帶清晰；濃度高于0.3 mmol·L-1，泳道6～10無擴(kuò)增產(chǎn)物?？梢?，過高的dNTPs濃度會抑制文昌錐的SCoT-PCR反應(yīng)。所以選擇0.05～0.30 mmol·L-1范圍為正交試驗設(shè)計的dNTPs適宜濃度范圍。

2.1.4 Taq DNA聚合酶用量對SCoT-PCR的影響

由圖2可知(泳道11～20)，當(dāng)Taq DNA聚合酶濃度低于0.5 U，Taq DNA聚合酶活性低，導(dǎo)致SCoT-PCR反應(yīng)不完全，泳道11-12沒有擴(kuò)增產(chǎn)物；隨著酶用量的增加，擴(kuò)增條帶逐漸增多并清晰，尤其是Taq DNA聚合酶濃度在0.75～2.00 U(圖2：泳道14～17)時擴(kuò)增效果最好；當(dāng)高于2 U時，開始出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。因此，選擇Taq DNA聚合酶0.75～2.00 U范圍用于正交試驗設(shè)計。

圖2 dNTPs濃度和Taq DNA聚合酶濃度對SCoT-PCR反應(yīng)體系的影響Fig.2 Effect of dNTPs concentration and Taq DNA polymerase on SCoT-PCR reaction system M. 100 bp DNA marker; 1-10. 0.025,0.05l,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.8,1.0 mmol·L-1 (dNTP); 11-20. 0.05,0.25,0.5,0.75,1,1.5,2.0,3.0,4.0,5.0 U(Taq)

圖3 不同正交試驗組合的擴(kuò)增結(jié)果 M. 100 bp DNA marker；1～16. 16個處理，編號與表2一致Fig.3 Orthogonal test combination M. 100 bp DNA marker; 1-16. 16 processing,the number is consistent with Table 2.

表3 SCoT-PCR正交試驗設(shè)計表

表4 正交設(shè)計結(jié)果直觀分析

注：K表示某影響因素在不同水平下的分?jǐn)?shù)；k表示某影響因素在不同水平下的分?jǐn)?shù)平均數(shù)；1～4表示某影響因素由低到高的4個水平；R表示極差，某影響因素在各個水平分分?jǐn)?shù)平均數(shù)的最大值與最小值之差。

Note:K represents the score of a certain influencing factor at different levels; k represents the average of the scores of a certain influencing factor at different levels; 1-4 represent the four levels of a certain influencing factor from low to high; R is the difference between the maximum and minimum values of the average of the scores of each of the influencing factors at each level.

2.2 正交試驗設(shè)計與分析

在上述單因素實驗基礎(chǔ)上，基于適宜的DNA用量、引物濃度、dNTPs濃度和Taq DNA聚合酶用量，設(shè)計文昌錐SCoT-PCR L16正交試驗表(表3)。從擴(kuò)增的結(jié)果(圖3)看，16個組合均能擴(kuò)增出產(chǎn)物，組合1，2，3，4，7擴(kuò)增的條帶較多且清晰，組合8擴(kuò)增的條帶少且彌散。

依據(jù)條帶多少、強(qiáng)弱和清晰度給16個組合的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行打分，分?jǐn)?shù)依次為13，16，15，14，3，10，13，1，4，4，6，3，4，3，4，3，8，9。組合2的分?jǐn)?shù)最高，為最佳組合，組合8分?jǐn)?shù)最低，為最差組合。因此，組合2是文昌錐SCoT的最佳反應(yīng)組合，即總體系為20 μL，DNA含量為2.5 ng，引物濃度為0.8 μmol·L-1，dNTPs濃度為0.2 mmol·L-1，Taq DNA聚合酶的含量1 U。

根據(jù)打分情況分別求出DNA、引物、dNTPs和Taq DNA聚合酶在同一水平下的K值及均值k。并求出同一影響因子在不同水平下平均值的極差R值(表4)。R值大小說明了每個因素對PCR擴(kuò)增的影響程度，R值越大，影響越顯著。DNA、引物、dNTPs和Taq DNA聚合酶的R值分別為10.25，3.75，4和2.25。可見適宜的DNA、引物、dNTPs和Taq DNA聚合酶濃度條件下，它們對文昌錐SCoT-PCR擴(kuò)增結(jié)果影響大小為：DNA>dNTPs>引物>Taq DNA聚合酶。

2.3 有效引物篩選及穩(wěn)定性檢驗

采用上述已優(yōu)化的反應(yīng)體系(組合2)，以LFT-01基因組DNA為模板對全合成的80條引物進(jìn)行初選，獲得40條效果較好的初選引物(擴(kuò)增獲得3條以上產(chǎn)物)。以文昌錐LFT-01、BC-02、BC-20(地理距離相差較遠(yuǎn))基因組DNA為模板，對40條初選引物進(jìn)行評價與復(fù)選。經(jīng)復(fù)選，獲得15條適合文昌錐的SCoT多態(tài)性引物(圖4，表5)。共有15條引物的擴(kuò)增多態(tài)性百分率在45.45%～78.57%，擴(kuò)增得到的條帶個數(shù)在7～14條。其中SCoT63擴(kuò)增條帶最多(14條)，多態(tài)性最好(78.57%)。從圖4的擴(kuò)增效果看，基于最佳反應(yīng)體系，3份文昌錐均能擴(kuò)增出清晰的條帶且主帶型穩(wěn)定，分散性好、重復(fù)性高，說明該體系穩(wěn)定可靠，適用于文昌錐SCoT分析。

表5 經(jīng)過復(fù)選后獲得的15條SCoT引物組合擴(kuò)增信息分析及最佳退火溫度

Table 5 Amplification information analysis and optimal annealing temperature of 15 SCotT primer combinations obtained after re-selection

引物Primers 總條帶數(shù)Total number of bands多態(tài)性百分率Polymorphism(%)退火溫度Annealing temperature(℃)引物序列Sequence(5′-3′)SCoT81346.1554CAACAATGGCTACCACGTSCoT14955.5660ACGACATGGCGACCACGCSCoT271145.4558ACCATGGCTACCACCGTGSCoT32771.4360CCATGGCTACCACCGCACSCoT411070.0054CAATGGCTACCACTGACASCoT43966.6758CAATGGCTACCACCGCAGSCoT511258.3354ACAATGGCTACCACTGTCSCoT58977.7854ACAATGGCTACCACTAGGSCoT631478.5760ACCATGGCTACCACGGGCSCoT66862.5058ACCATGGCTACCAGCGAGSCoT681050.0058ACCATGGCTACCAGCGTCSCoT731266.6760CCATGGCTACCACCGGCTSCoT751266.6760CCATGGCTACCACCGGAGSCoT761369.2358CCATGGCTACCACTACCGSCoT771250.0058CCATGGCTACCACTACCC

圖4 經(jīng)過復(fù)選后獲得的40條SCoT引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification results of 40 SCoT primers after re-selection

3 討論

SCoT基于PCR反應(yīng)的新型目的基因分子標(biāo)記技術(shù)，雖然有操作方便，成本低，多態(tài)性高，遺傳信息豐富等優(yōu)點，但PCR反應(yīng)是一種復(fù)雜的反應(yīng)體系，受到時間、溫度、循環(huán)數(shù)和體系中各試劑濃度的影響[6]。所以建立文昌錐的SCoT-PCR最優(yōu)體系尤其重要。

雖然SCoT分析已經(jīng)在多個物種上廣泛應(yīng)用，但不同物種SCoT-PCR反應(yīng)體系的主要影響因素不同。對于南瓜和辣椒而言，引物濃度是對SCoT-PCR擴(kuò)增效果影響最主要的因素[20]；對于梨和木薯而言，dNTPs濃度是對SCoT-PCR擴(kuò)增效果影響最主要的因素[21]；藥用菊花和葛根[22]以Taq DNA聚合酶為SCoT-PCR擴(kuò)增的最主要影響因素。本研究通過正交試驗直觀分析表明：各因素對文昌錐SCoT-PCR反應(yīng)體系影響程度大小依次為：DNA>dNTPs>引物>Taq DNA聚合酶。但在其他植物中還未發(fā)現(xiàn)DNA濃度是影響SCoT-PCR體系擴(kuò)增效果的最主要因素。在白檀[23]和光萼荷屬植物[24]的SRAP分析中也發(fā)現(xiàn)DNA濃度是影響擴(kuò)增效果的最主要因素，與本研究結(jié)果一致。通過單因素試驗表明：模板DNA濃度對SCoT-PCR擴(kuò)增影響顯著，本實驗中DNA模板濃度越高，擴(kuò)增條帶越少產(chǎn)量越低，可能是文昌錐葉片細(xì)胞內(nèi)含有Taq DNA聚合酶反應(yīng)效率的抑制性物質(zhì)較多引起。因此，在對包括文昌錐在內(nèi)的諸多殼斗科植物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，需要注意其葉片的DNA溶液中可能含有的Taq DNA聚合酶反應(yīng)效率抑制性物質(zhì)。

通過單因素試驗和正交試驗，本研究獲得文昌錐SCoT-PCR的最佳反應(yīng)體系，即總體系為20 μL，模板DNA含量為2.5 ng，引物濃度為0.8 μmol·L-1，dNTPs濃度為0.2 mmol·L-1，Taq DNA聚合酶的含量1 U。經(jīng)驗證，該體系的穩(wěn)定性好，可靠性高?；谠擉w系，本研究從80條SCoT引物中篩選出15條多態(tài)性在45.45%～78.57%、擴(kuò)增條帶在7～14條且清晰度高的有效引物。文昌錐SCoT-PCR反應(yīng)體系的建立和獲得的有效引物，為海南特有極小種群植物文昌錐的資源評價鑒定、保護(hù)遺傳學(xué)等方面的研究奠定了較好的基礎(chǔ)。