魯紅俠，許年歷，耿 明，李 玲，徐德聰，鄧俠

(1.合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230601；2.合肥第一中學(xué)，安徽 合肥 230601)

果膠是一種普遍存在于植物細(xì)胞壁中的雜多糖，易溶于水[1-3]，作為一種功能性多糖，逐漸受到食品添加劑等行業(yè)的重視。果膠主要存在于各種水果的果皮之中，是一種食品加工廠的副產(chǎn)物，因此，從水果果皮中提取果膠不僅可以變廢為寶，資源回收利用，還可以減少環(huán)境污染，保護(hù)環(huán)境?？蒲腥藛T已從香蕉皮、柚子皮、橘子皮等多種水果果皮中提取果膠，得到了良好的效果，并投入到食品添加劑等行業(yè)的使用之中[4-6]，有時(shí)還以生產(chǎn)輔料的成分應(yīng)用于化妝品工業(yè)以及醫(yī)療行業(yè)[7-9]。因此，對我國的果膠資源進(jìn)行大力開發(fā)已顯得極為重要，生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的果膠，滿足海內(nèi)外各行業(yè)對果膠的需求更是極為迫切。

藍(lán)莓被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一，列入世界第三代水果行列，被譽(yù)為“漿果之王”[11]。科研人員對藍(lán)莓進(jìn)行了大量的研究，大多集中在營養(yǎng)成分、栽培技術(shù)[12-13]等方面，對藍(lán)莓酒渣中果膠提取的研究卻鮮見報(bào)道。藍(lán)莓酒渣是由藍(lán)莓果實(shí)進(jìn)行發(fā)酵后剩下的殘?jiān)?，其中果膠含量約占20%。很多利用藍(lán)莓發(fā)酵的產(chǎn)業(yè)或科研工作者在藍(lán)莓發(fā)酵以后直接將藍(lán)莓酒渣丟棄，無疑是一種很大的資源浪費(fèi)。本研究提出了從藍(lán)莓酒渣中提取果膠的工藝方案，并探究了不同pH值、提取時(shí)間、提取溫度以及水料比對藍(lán)莓酒渣中果膠得率的影響，通過單因素以及響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出藍(lán)莓酒渣中果膠提取的最佳條件，為綜合利用藍(lán)莓酒渣，開發(fā)利用生物活性物質(zhì)提供理論依據(jù)，并為工業(yè)化生產(chǎn)藍(lán)莓酒渣中的果膠提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

材料：藍(lán)莓酒渣(安徽藍(lán)莓工程技術(shù)研究中心提供)

試劑：乙醇、鹽酸、六偏磷酸鈉等均為分析純，由上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10型pH計(jì)(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，HB10數(shù)顯型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA儀器有限公司)，SHZ-D-III型循環(huán)水真空泵(河南百澤儀器有限公司)，DHG-9143BS-III型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，HH-4型電熱數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司)，BCD-190ZM2型電冰箱(美菱股份有限公司)，F(xiàn)A1104N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 果膠提取工藝流程

藍(lán)莓酒渣→預(yù)處理→水解→過濾→脫色→濃縮→沉淀→抽濾→濕果膠→干燥→干果膠[14-15]

(1)預(yù)處理：稱取10.000 g藍(lán)莓酒渣，放入燒杯中，向其中加入沸水，水浴加熱保溫20 min,使果膠酶失活。

(2)水解：將預(yù)處理過的藍(lán)莓酒渣放入燒杯中，向其中滴加鹽酸并用pH計(jì)調(diào)節(jié)溶液的pH值，然后加入3%的六偏磷酸鈉，將燒杯放在恒溫水浴鍋中提取果膠。

(3)過濾：果膠提取結(jié)束后，趁熱立即用紗布過濾除去藍(lán)莓殘?jiān)?/p>

(4)脫色：將過濾除去藍(lán)莓殘?jiān)蟮娜芤恨D(zhuǎn)移到燒杯中，并向其中加入7%的活性炭，進(jìn)行脫色，脫色時(shí)間15 min。

(5)濃縮：將脫色后的液體在50～60 ℃，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀連續(xù)真空濃縮。

(6)沉淀：濃縮的溶液和乙醇按1:1加入500 mL燒杯，靜置30 min，使果膠沉淀。

(7)抽濾：將靜置沉淀后的溶液用循環(huán)水真空泵抽濾，使果膠分離，得到濕果膠。

(8)干燥：將濕果膠轉(zhuǎn)移到表面皿中并攤開，放入70 ℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行烘干，得到干果膠。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 不同pH值對果膠得率的影響

稱取每份藍(lán)莓酒渣10.000g，在水料比25:1、提取時(shí)間75min、提取溫度70℃，以無水乙醇作為沉淀劑的條件下，將溶液的pH值分別調(diào)節(jié)為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0進(jìn)行藍(lán)莓酒渣中果膠提取的試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，并計(jì)算其得率。

1.3.2.2 不同提取時(shí)間對果膠得率的影響

稱取每份藍(lán)莓酒渣10.000g，在水料比25:1、提取溫度70℃、pH值3.0，以無水乙醇作為沉淀劑的條件下，在提取時(shí)間分別為30、45、60、75、90min條件下進(jìn)行藍(lán)莓酒渣中果膠提取試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，并計(jì)算其得率。

1.3.2.3 不同提取溫度對果膠得率的影響

稱取每份藍(lán)莓酒渣10.000g，在水料比25:1、提取時(shí)間75min、pH值3.0，以無水乙醇作為沉淀劑的條件下，在提取溫度分別為50、60、70、80、90 ℃條件下進(jìn)行果膠提取，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，并計(jì)算其得率。

1.3.2.4 不同水料比對果膠得率的影響

稱取每份藍(lán)莓酒渣10.000g，在提取時(shí)間75min、提取溫度70℃、pH值3.0，以無水乙醇作為沉淀劑的條件下，在水料比為10:1、15:1、20:1、25:1、30:1條件下進(jìn)行果膠提取，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，并計(jì)算其得率。

1.3.3 果膠得率計(jì)算

果膠得率表示為：Y = A/B*100%

式中： Y—— 果膠得率，(%)

A—— 提取的干果膠量，g

B——藍(lán) 莓 酒 渣 量，g

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)得出的果膠得率趨于最大時(shí)，pH值、提取溫度、提取時(shí)間和水料比四個(gè)因素的最佳值，按照4因素3水平，使用軟件DX8設(shè)計(jì)出響應(yīng)曲面法優(yōu)化藍(lán)莓酒渣中果膠提取工藝的試驗(yàn)，各因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對藍(lán)莓酒渣中果膠得率的影響

從圖1可以看出：溶液的pH值在1～5范圍內(nèi)時(shí)，藍(lán)莓酒渣中的果膠得率隨著溶液pH值的增加而緩慢增加，當(dāng)溶液的pH值為3時(shí)，果膠得率最高，后隨pH值的升高果膠得率迅速下降。當(dāng)pH值過低時(shí)，果膠在以鹽酸為提取液的溶液中易發(fā)生電離作用，使果膠分子溶解在水中，導(dǎo)致果膠的得率不高[16-18]；當(dāng)溶液的pH值大于3.0以后，在高pH溶液的條件下，果膠很不穩(wěn)定，已經(jīng)提取出的果膠發(fā)生水解作用，導(dǎo)致果膠得率降低。因此對藍(lán)莓酒渣中的果膠進(jìn)行提取時(shí)，pH值不宜過大，也不易過小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，藍(lán)莓酒渣中提取果膠的最適宜pH值為3.0。

圖1 不同pH值對藍(lán)莓酒渣中果膠得率的影響

2.2 提取時(shí)間對藍(lán)莓酒渣中果膠得率的影響

從圖2可以看出：當(dāng)提取時(shí)間設(shè)置在30～90min范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長，藍(lán)莓酒渣中的果膠得率開始緩慢增加，當(dāng)提取時(shí)間為75min時(shí)，果膠得率最高，后隨時(shí)間的延長，果膠得率下降。這是因?yàn)樘崛r(shí)間太短，藍(lán)莓酒渣中的果膠沒有被完全溶解出來，果膠得率較低，延長提取時(shí)間，果膠逐漸溶解，果膠得率增加；當(dāng)提取時(shí)間過長時(shí)，已經(jīng)提取出的果膠會發(fā)生水解，而且果膠長時(shí)間在酸性環(huán)境下，酸也會破壞果膠的分子結(jié)構(gòu)，使果膠得率降低，所以果膠得率也不高，因此，對藍(lán)莓酒渣中的果膠進(jìn)行提取時(shí)，提取時(shí)間不宜太長，也不宜太短。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，藍(lán)莓酒渣中提取果膠的最適宜時(shí)間是75min。

圖2 提取時(shí)間對藍(lán)莓酒渣中果膠得率的影響

2.3 提取溫度對藍(lán)莓酒渣中果膠得率的影響

從圖3可以看出：提取溫度在50～90℃范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高藍(lán)莓酒渣中的果膠得率逐漸升高，當(dāng)提取溫度為70℃時(shí)，果膠得率最高，后隨著提取溫度的升高，藍(lán)莓酒渣中的果膠得率下降。這是由于提取溫度低時(shí)，酒渣中的果膠不能完全溶解在溶液中，果膠得率低，當(dāng)溫度逐漸升高時(shí)，果膠得以充分溶解，果膠得率增加，當(dāng)溫度超過70℃時(shí)，果膠得率開始下降，因?yàn)楦邷乜梢约涌旃z的水解速度，而且果膠對熱不穩(wěn)定，高溫條件下，果膠得率不高。所以，對藍(lán)莓酒渣中的果膠進(jìn)行提取時(shí)，提取溫度不宜太高也不宜太低，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取果膠的最適宜溫度在70℃。

圖3 提取溫度對藍(lán)莓酒渣中果膠得率的影響

2.4 水料比對藍(lán)莓酒渣中果膠得率的影響

從圖4可以看出：在水料比為10∶1～30∶1范圍內(nèi)時(shí)，藍(lán)莓酒渣中的果膠得率隨著水料比的增加而增加，當(dāng)水料比等于25∶1時(shí)，果膠得率最高，后隨著水料比的增加而降低。這是由于水料比小時(shí)，溶液濃度大，藍(lán)莓酒渣中的果膠不能完全轉(zhuǎn)移到溶液中，所以果膠得率低，水料比逐漸增大，溶液濃度逐漸減小，藍(lán)莓酒渣中的果膠可以完全轉(zhuǎn)移出來，使得果膠得率逐漸增加，當(dāng)水料比大于25∶1時(shí)，水料比太大，抽濾所需時(shí)間過長，期間果膠會發(fā)生水解，而且果膠的濃度減小，很容易隨著溶液過濾掉，所以，對藍(lán)莓酒渣中的果膠進(jìn)行提取時(shí)，水料比不宜過小也不宜過大，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取果膠的最適宜水料比為25∶1。

圖4 水料比對藍(lán)莓酒渣中果膠得率的影響

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化果膠提取工藝

2.5.1 響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取pH值、提取溫度(℃)、提取時(shí)間(min)和水料比(v/m)為因素，采用軟件DX8 進(jìn)行4因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果

2.5.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到藍(lán)莓酒渣中的果膠得率對pH值、提取溫度、提取時(shí)間和水料比的二次多項(xiàng)回歸模型：

果膠得率=2.84+0.07A+0.1B-0.009C-0.06D+0.001AB+0.02AC-0.06AD-0.07BC +0.42BD-0.07CD-0.67A2-0.37B2-0.45C2-0.31D2

回歸方程的方差分析及模型顯著性分析結(jié)果見表3。

由表3可以看出，模型回歸極顯著(p<0.0001)，失擬項(xiàng)不顯著(p=0.1040>0.05)，說明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合很好，對該回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9591，即表明模型可以解釋95.91%的藍(lán)莓酒渣中果膠水平的變化，進(jìn)一步說明回歸方程的擬合程度較好。此外，從表中可以看出，A、B、D、A2、B2、C2、D2對果膠的得率有顯著影響，其中提取溫度的影響最大，然后依次是pH值和水料比。在所有的影響因素中，一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對果膠得率的影響巨大，交互作用項(xiàng)的影響則很不明顯，說明在藍(lán)莓酒渣中果膠的提取實(shí)驗(yàn)中，各因素之間不存在顯著的交互作用。

2.5.3 響應(yīng)面分析與驗(yàn)證

各因素之間的交互作用等高線和響應(yīng)面圖如圖5～10所示。

表3 各實(shí)驗(yàn)因素的方差分析

圖5 pH和溫度對果膠得率影響的等高線和響應(yīng)面

由圖5可知，當(dāng)溫度從60℃增加到80℃的過程中，隨著pH值的逐漸增加，藍(lán)莓酒渣中的果膠得率增加，當(dāng)pH值達(dá)到3.0左右時(shí)果膠得率達(dá)到最大，然后隨著pH的繼續(xù)增大，果膠得率又開始下降。同理，在pH在2～4范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高，藍(lán)莓酒渣中的果膠得率增加，當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)，果膠得率最大，然后溫度繼續(xù)升高，果膠得率開始下降。

由圖6可知，水料比在20:1～30:1的范圍內(nèi)，果膠得率隨著pH的增加而增大，pH增加到3.0時(shí)，果膠得率達(dá)到峰值，隨后pH繼續(xù)增加，果膠得率反而下降。同理，在pH為2～4范圍內(nèi)時(shí)，果膠得率隨著水料比的增加而增大，當(dāng)水料比為25:1時(shí)，果膠得率最大，隨后，水料比繼續(xù)增加，果膠得率開始降低。

由圖7可知，水料比在20:1～30:1的范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高，果膠得率迅速增加，當(dāng)溫度到達(dá)70℃時(shí)，果膠得率達(dá)到最大，隨后溫度繼續(xù)增加，果膠得率開始下降。同理，溫度在60～80 ℃范圍內(nèi)，隨著水料比的增加，果膠得率增加，當(dāng)水料比為25:1時(shí)，果膠得率最大，隨后水料比繼續(xù)增大，果膠得率開始下降。

圖6 pH和水料比對果膠得率影響的等高線和響應(yīng)面

圖7 溫度和水料比對果膠得率影響的等高線和響應(yīng)面

圖8 pH和時(shí)間對果膠得率影響的等高線和響應(yīng)面

由圖8可知，在提取時(shí)間60～90min范圍內(nèi)，隨著pH的增加，果膠得率增加，pH值增加到3.0時(shí)，果膠得率達(dá)到最大，隨后pH繼續(xù)增大，果膠得率開始下降。同理，在pH2～4范圍內(nèi)時(shí)，隨著時(shí)間的延長，果膠得率增加，當(dāng)時(shí)間達(dá)到75min時(shí)，果膠得率最大，隨后時(shí)間繼續(xù)延長，果膠得率開始下降。

由圖9可知，提取時(shí)間在60～90min范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高，果膠得率增加，溫度達(dá)到70℃時(shí)，果膠得率最大，隨后溫度繼續(xù)增加，果膠得率開始下降。同理，提取溫度在60～80℃范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長，果膠得率逐漸增加，時(shí)間達(dá)到75min時(shí)，果膠得率最大，提取時(shí)間繼續(xù)延長，果膠得率開始下降。

圖9 溫度和時(shí)間對果膠得率影響的等高線和響應(yīng)面

圖10 時(shí)間和水料比對果膠得率影響的等高線和響應(yīng)面

由圖10可看出，在水料比20∶1～30∶1的范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長，果膠得率緩慢的增加，當(dāng)時(shí)間增加到75min時(shí)，果膠得率最大，隨著時(shí)間繼續(xù)增加，果膠得率開始下降。同理，在提取時(shí)間為60～90min范圍內(nèi)時(shí)，隨著水料比的增加，果膠得率增加，水料比為25∶1時(shí)，果膠得率最大，水料比繼續(xù)增加，果膠得率開始下降。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法確定藍(lán)莓酒渣中果膠的最佳提取工藝。研究結(jié)果表明最佳提取工藝為：在溶液pH值3.0，提取溫度70℃、提取時(shí)間75min、水料比25∶1的條件下，藍(lán)莓酒渣中果膠得率為2.68%，與理論預(yù)測值2.7%接近，說明本實(shí)驗(yàn)的提取工藝合理可行，為綜合利用藍(lán)莓酒渣開發(fā)利用生物活性物質(zhì)提供依據(jù)，并為工業(yè)化生產(chǎn)藍(lán)莓酒渣中的果膠提供實(shí)踐指導(dǎo)，同時(shí)避免了直接將藍(lán)莓酒渣丟棄造成的浪費(fèi)及環(huán)境污染。