宋晶 劉愛(ài)東 郭家娟 高楠 李鵬飛

(1長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 2附屬第三臨床醫(yī)院；3附屬醫(yī)院)

心肌纖維化是很多心血管疾病發(fā)展終末期心臟的病理改變，如冠狀動(dòng)脈慢性缺血，或血管狹窄、堵塞導(dǎo)致的急性心肌缺血；或是擴(kuò)張型心肌病、肥厚型心肌??；或者是非血管因素導(dǎo)致高血壓性心肌病及炎癥性心肌病等。心肌發(fā)生纖維化改變時(shí)，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)、波形蛋白(Vimentin)為肌成纖維細(xì)胞骨架中主要標(biāo)志蛋白，目前認(rèn)為α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的主要標(biāo)志，Vimentin是上皮細(xì)胞向肌成纖維轉(zhuǎn)化過(guò)程中的產(chǎn)物。目前研究中心肌纖維化有多種信號(hào)通路，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β信號(hào)通路是最為廣泛、常見(jiàn)的信號(hào)通路，而人單絲氨酸蛋白激酶(LIMK)是TGF-β信號(hào)通路中下游的相關(guān)因子，且多數(shù)用于研究腫瘤細(xì)胞的發(fā)生機(jī)制〔1～4〕，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)LIMK的表達(dá)亦參與心肌纖維化過(guò)程。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)類(lèi)藥物可有效抑制心肌重構(gòu)，減輕心肌纖維化。研究卡托普利抑制心肌纖維化的機(jī)制有助于對(duì)其病理生理有更進(jìn)一步的了解，從而對(duì)其臨床治療與新藥開(kāi)發(fā)有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠30只(長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，體重(180±10)g，動(dòng)物合格編號(hào)：SCXK(吉)-2018-0007。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 卡托普利片由杭州民生藥業(yè)有限公司提供(批號(hào)：T15H048)，鹽酸異丙腎上腺素由Sigma-adrich公司提供(批號(hào)：1351005)。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑 RNA提取試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司)，基因引物(吉瑪基因-九牧農(nóng)校)，α-SMA抗體和Vimentin抗體(愛(ài)博泰克生物技術(shù)有限公司)。LIMK抗體(ab-clon)、預(yù)制膠(碧云天生物技術(shù)公司)。胎牛血清(Cellmax)。

1.4實(shí)驗(yàn)器材 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀器(AnalytikJena)；離心機(jī)為長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；移液管和培養(yǎng)皿(Corning)。

1.5造模與含藥血清的制備 分為對(duì)照組、模型組、卡托普利組各10只。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d適應(yīng)環(huán)境后，此過(guò)程無(wú)死亡，對(duì)照組常規(guī)喂養(yǎng)，模型組、卡托普利組給予異丙腎上腺素注射液5 mg/kg腹腔注射。造模當(dāng)天，卡托普利組每日按5 mg/kg灌胃卡托普利片懸液；對(duì)照組每日給予等體積自來(lái)水灌胃，共連續(xù)進(jìn)行3 d后將各組麻醉取心尖部，放入4%多聚甲醛固定液，眼球摘除收集血清在離心管中，-20℃冰箱保存。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察大鼠心肌組織變化 心肌組織取中間1/3置于4%甲醛固定液試管中固定，梯度酒精溶液脫水，二甲苯溶液中透明后，進(jìn)行浸蠟與包埋，最后將蠟塊切片、烘箱內(nèi)烤片。HE染色：將切片脫蠟，水洗，蘇木精染色3～5 min，普通清水水洗，分化液分化，水洗，伊紅染色液中染色，酒精脫水(酒精濃度遞減)，二甲苯溶液脫水透明，封片，顯微鏡下觀察。

1.7羥脯氨酸含量測(cè)定 取心肌組織心尖部位，鹽水洗滌后剪碎，沸水水浴水解，按照說(shuō)明書(shū)加入試劑后離心，根據(jù)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)測(cè)定。

1.8細(xì)胞培養(yǎng) 將大鼠來(lái)源的心肌成纖維細(xì)胞用10%高糖血清培養(yǎng)液，加1%雙抗，37℃、二氧化碳濃度為5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，2～3 d換液，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右時(shí)，胰蛋白酶(濃度為0.25%)消化2～4 min，待細(xì)胞變圓后，用移液槍吹打至懸浮狀態(tài)后，移至移液管中，12 000 r/min，5 min離心機(jī)離心。加入有血清培養(yǎng)液，反復(fù)吹打至細(xì)胞均勻，分組依次為對(duì)照組、模型組、卡托普利組。24 h后細(xì)胞貼壁，換液并加入無(wú)血清培養(yǎng)液2 ml(細(xì)胞饑餓)，24 h后，棄廢液，每組加入2 ml對(duì)應(yīng)的血清，24 h后收集細(xì)胞。

1.9熒光定量PCR 每孔細(xì)胞棄廢液后用冷卻的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，加入1 ml裂解液，反復(fù)吹打，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作對(duì)cDNA進(jìn)行合成，將cDNA當(dāng)做模板，借助熒光定量 PCR 儀實(shí)施測(cè)定，以GAPDH作內(nèi)參，計(jì)算出各組細(xì)胞中α-SMA、Vimentin、LIMK的相對(duì)表達(dá)量。相關(guān)基因引物序列如下：α-SMA-正向-3 TCT TGA CCT GGC TGG ACG,反向-3 TCTC CTT GAT GTC TCG CAC A;Vim-正向-3 CCG CTT CGC CAA CTA CAT,反向-3 GCT GAT CCA CCT GCC G;LIMK-正向-2 TCC CTC CGA GTG GTT TGT C,反向-2 GAA GTT CAG CCG CTT GTC C。

1.10Western印跡法 蛋白裂解液按照放射免疫沉淀(RIPA)：苯甲磺酰氟(PMSF)=100∶1配制，每孔細(xì)胞棄廢液后用冷卻的PBS洗3次，每孔加入150～200 μl裂解液，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞及細(xì)胞試劑刮下，收集到離心管中，并標(biāo)記分組。離心機(jī)12 000 r/min、15 min離心，收集上清液即為提取的蛋白。二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性后上樣。電泳：130 V電壓、50 min。轉(zhuǎn)膜：按照分子量大小，低溫，200 mA轉(zhuǎn)膜15～60 min；封閉：5%脫脂奶粉封閉1 h；加一抗：脫脂奶粉用Tween-20 Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗3遍，加入一抗(1∶500)，4℃冰箱過(guò)夜。第二天一抗室溫?fù)u床1 h，收集一抗，TBST洗一抗3遍。加二抗：根據(jù)一抗來(lái)源屬性加入相應(yīng)的二抗。洗膜：TBST洗二抗洗3遍。顯影：將電化學(xué)增強(qiáng)(ECL)曝光液滴于膜上，由凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光處理。 借助軟件Image-J來(lái)分析各抗體條帶灰度值。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1HE染色 與對(duì)照組比較，模型組與卡托普利組細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞變大，細(xì)胞核分布不均勻，出現(xiàn)壞死灶。與模型組比較，卡托普利組心肌細(xì)胞壞死面積較小。見(jiàn)圖1。說(shuō)明異丙腎上腺素注射液5 mg/kg腹腔注射大鼠后，大鼠心肌出現(xiàn)纖維化改變，纖維組織增多?？ㄍ衅绽M與模型組比較，出現(xiàn)心肌纖維化改善，說(shuō)明卡托普利可以抑制心肌重構(gòu)，改善心肌纖維化。

2.2心肌組織中羥脯氨酸含量 與對(duì)照組〔(0.168±0.024)μg/mg〕比較，模型組羥脯氨酸含量〔(0.228±0.011)μg/mg〕明顯增加(P<0.05);與模型組比較，卡托普利組羥脯胺酸含量〔(0.180±0.015)μg/mg〕明顯減少(P<0.05)。

圖1 各組心肌組織(HE染色，×200)

2.3熒光定量PCR檢測(cè)α-SMA、Vim、LIMK mRNA相對(duì)表達(dá)量 與對(duì)照組比較，模型組、卡托普利組α-SMA、Vim、LIMK mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，卡托普利組α-SMA、Vim、LIMK mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組成纖維細(xì)胞中α-SMA、Vim、LIMK mRNA表達(dá)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；表2同

2.4各組成纖維細(xì)胞中α-SMA、Vim、LIMK蛋白相對(duì)表達(dá)量 與對(duì)照組比較，模型組卡托普利組α-SMA、Vim蛋白及模型組LIMI蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯增加(P<0.05);與模型組比較，卡托普利組α-SMA、Vim、LIMK蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)圖2和表2。

圖2 各組成纖維細(xì)胞中α-SMA、Vim、LIMK蛋白表達(dá)

表2 各組成纖維細(xì)胞中α-SMA、Vim、LIMK蛋白相對(duì)表達(dá)

3 討 論

心肌纖維化過(guò)程是復(fù)雜而多樣的，各種原因均可導(dǎo)致纖維化，如炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮功能障礙、氧化應(yīng)激、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)、TGF的激活等。研究〔5，6〕表明通過(guò)調(diào)控TGF相關(guān)蛋白表達(dá)可以降低心肌纖維化的發(fā)生。在纖維化分子生物學(xué)中，上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化(EMT)發(fā)揮重要作用，而發(fā)生間質(zhì)纖維化的間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志性蛋白為α-SMA和Vim〔7，8〕。α-SMA存在于人類(lèi)小鼠(小家鼠)和其他哺乳動(dòng)物的橫紋肌中，包括骨骼和心臟及平滑肌中〔9〕。當(dāng)某些因素如損傷、TGF作用下，使成纖維細(xì)胞激活，進(jìn)而表達(dá)α-SMA，形成Vim細(xì)胞骨架，使其向肌成纖維細(xì)胞分化。同時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成分泌及細(xì)胞增殖能力均顯著增強(qiáng)，參與組織損傷修復(fù)〔10，11〕、纖維化疾病過(guò)程〔12〕。Vim蛋白是EMT過(guò)程中間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，通過(guò)使上皮細(xì)胞失去極性、減弱黏附力、增加運(yùn)動(dòng)能力等，從而破壞細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞纖維化〔13〕?？ㄍ衅绽赡芡ㄟ^(guò)下調(diào)α-SMA及Vim蛋白的相對(duì)表達(dá)量，抑制EMT，從而達(dá)到抑制心肌纖維化的目的。肌成纖維細(xì)胞是從TGF-β中的內(nèi)皮細(xì)胞中衍生而來(lái)的〔14〕，LIMK是TGF信號(hào)通路下游的一個(gè)相關(guān)蛋白，Mardilovich 等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，LIMK 抑制劑可以降低細(xì)胞中磷酸化絲切蛋白(Cofilin)蛋白表達(dá)水平，同時(shí)也可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。TGF-β/LIMK信號(hào)通路雖然被證實(shí)與纖維化有關(guān)，但目前關(guān)于心肌纖維化的研究較少。LIMK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，磷酸化并滅活Cofilin〔16〕，Cofilin與細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白骨架重組關(guān)系密切〔17〕，卡托普利在干預(yù)大鼠心肌成纖維細(xì)胞時(shí)，通過(guò)下調(diào)TGF-β信號(hào)通路中的LIMK蛋白，并且可能進(jìn)一步磷酸化并滅活Cofilin而抑制細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白骨架重組，進(jìn)一步達(dá)到抑制心肌纖維化作用。當(dāng)心肌發(fā)生纖維化改變時(shí)，由于Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白大量沉積，且兩種蛋白具有一定黏附性，一般的酸性或堿性環(huán)境均很難測(cè)定出其含量，而羥脯氨酸是膠原蛋白含量最高的氨基酸，由于通過(guò)羥脯氨酸含量檢測(cè)可以大致計(jì)算出膠原蛋白含量，反映膠原蛋白沉積程度，所以將其用于心肌纖維化的衡量標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)用鹽酸異丙腎上腺素制備大鼠心肌纖維化模型時(shí)，羥脯胺酸含量增高，說(shuō)明膠原蛋白沉積加重，心肌纖維化形成。說(shuō)明卡托普利抑制了膠原蛋白的形成。本實(shí)驗(yàn)中卡托普利是ACEI類(lèi)藥物，可以抑制血管緊張素Ⅰ向血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)化，當(dāng)體內(nèi)血管緊張素Ⅱ濃度升高時(shí)，則可引起氧化應(yīng)激反應(yīng)〔18〕，過(guò)度的氧化應(yīng)激反應(yīng)可以導(dǎo)致炎癥發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，引起組織不同程度損傷，甚至壞死〔19〕。氧化應(yīng)激水平的升高可以產(chǎn)生膠原纖維、促纖維化細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等，進(jìn)而促進(jìn)纖維化的發(fā)生〔20〕。而用鹽酸異丙腎上腺素制備大鼠心肌纖維化模型時(shí)，同樣使大鼠發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，卡托普利在降低血管緊張素Ⅱ濃度、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的同時(shí)，LIMK及α-SMA、Vim蛋白含量下降，而LIMK、α-SMA是 TGF-β信號(hào)通路上的重要相關(guān)蛋白，說(shuō)明TGF-β/LIMK信號(hào)通路參與改善心肌纖維化作用，并且當(dāng)LIMK、α-SMA蛋白下調(diào)時(shí)，可以抑制或逆轉(zhuǎn)心肌纖維化，這為以后治療心肌纖維化找到新靶點(diǎn)，提供新思路。心肌纖維化發(fā)病機(jī)制有多種，TGF-β信號(hào)通路是心肌纖維化機(jī)制中的一個(gè)重要通路，在這條信號(hào)通路上游，還有絲氨酸/蘇氨酸激酶(ROCK)/小G蛋白超家族的亞家族成員之一(ROHA)等相關(guān)因子，在下游仍有膠原蛋白及Cofilin相關(guān)蛋白，可以進(jìn)行進(jìn)一步相關(guān)研究。本研究可明確卡托普利抑制心肌纖維化的機(jī)制為下調(diào)LIMK及α-SMA、Vim因子，同時(shí)證實(shí)了TGF-β/LIMK信號(hào)通路參與了心肌纖維化的抑制作用。