陳玉霞， 鉏曉艷， 邱建輝， 谷 峰， 林 勇， 劉尚洪

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北武漢 430064)

黃瓜(CucumissativusL.)為葫蘆科1年生草本植物，是漢朝張騫出使西域時(shí)帶回來的，最初為野生，瓜色墨黑帶刺，味道非?？?，不能食用，后來經(jīng)過長(zhǎng)期的栽培、改良，才成為現(xiàn)在甜脆可口的黃瓜。黃瓜中含有蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、多種礦物質(zhì)、微量元素和維生素，其中維生素E含量較高。黃瓜具有清熱解毒、調(diào)理腸胃、清肺利尿的功效，是人們最常食用的瓜類蔬菜[1]。人們生活水平的提高，對(duì)蔬菜的無公害化、周年供應(yīng)等提出了更高要求，只有培育抗多種病害的黃瓜品種，才能使黃瓜生產(chǎn)無公害和高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)成為現(xiàn)實(shí)。要在現(xiàn)有基礎(chǔ)上育成有突破性的抗病新品種，必須通過創(chuàng)新材料，如發(fā)病較嚴(yán)重的枯萎病，現(xiàn)有抗源很少，通過輻射誘變，將可獲得高抗枯萎病的突變體，從而獲得創(chuàng)新材料。據(jù)國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)(International Atomic Energy Agency，IAEA)2000年統(tǒng)計(jì)，全世界利用輻射育種技術(shù)育成作物新品種2 252個(gè)，其中我國(guó)育成農(nóng)作物品種605個(gè)，占世界總和的26.9%，平均推廣種植面積達(dá)9×106hm2以上，育成的新品種為我國(guó)增加糧食 30億～40億kg，棉花1.5億～1.8億kg，油料 0.75億kg，創(chuàng)經(jīng)濟(jì)效益33億元[2]。但目前輻射技術(shù)在黃瓜上的應(yīng)用僅有少量報(bào)道，李加旺等利用60Co-γ射線輻射處理具有優(yōu)良特性的黃瓜自交系干種子，并在其變異后代群體中篩選出2個(gè)綜合性狀優(yōu)良的單株，經(jīng)3代系選，從中選出主要性狀能穩(wěn)定遺傳的株系M-8，并以其為親本育成適于日光溫室栽培的耐低溫弱光雜交一代新組合93-5黃瓜[3]。王玉懷利用60Co-γ射線輻射長(zhǎng)春密刺干種子，從中發(fā)現(xiàn)黃色子葉突變的幼苗，研究表明黃色子葉為核遺傳的隱形性狀，受核內(nèi)一對(duì)等位基因控制，該性狀可作為苗期標(biāo)記鑒別F1雜種[4]。本研究以60Co-γ射線輻照黃瓜品種新津春4號(hào)干種子，考察不同輻照劑量對(duì)黃瓜種子萌發(fā)、種子細(xì)胞膜透性、幼苗子葉葉綠素含量、幼苗生長(zhǎng)量、幼苗各部位鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的影響，并探明黃瓜輻射誘變的半致死劑量，旨在為黃瓜抗病新品種的選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品種 新津春4號(hào)干種子，牛皮紙袋包裝，每袋100粒，共8袋。

1.1.2 輻照設(shè)備 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所輻照中心60Co-γ射線源，設(shè)計(jì)裝源容量1.85×1016Bq，現(xiàn)有放射源活度1.26×1016Bq，單板3層排列。采用動(dòng)態(tài)步進(jìn)式輻照方式輻照黃瓜干種子。

1.1.3 儀器試劑 UV-vis8500紫外可見分光光度計(jì)、Sartorius電子分析天平、精密電導(dǎo)率儀、培養(yǎng)皿、濾紙、小刀、直尺、刻度試管、移液管、稱量瓶、丙酮。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn) 2017年6月在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所輻照黃瓜種子并進(jìn)行種子發(fā)芽試驗(yàn)和幼苗觀察檢測(cè)分析。

1.2.2 處理設(shè)計(jì) 共設(shè)8個(gè)處理：處理1輻照劑量為0 Gy(未輻照種子作為對(duì)照)、處理2輻照劑量為50 Gy、處理3輻照劑量為100 Gy、處理4輻照劑量為255 Gy、處理5輻照劑量為500 Gy、處理6輻照劑量為675 Gy、處理7輻照劑量為 880 Gy、處理8輻照劑量為1 000 Gy。

1.2.3 發(fā)芽率及生長(zhǎng)量測(cè)定 樣品輻照完畢后，每個(gè)處理各取種子30粒，分別放入8個(gè)100 mL燒杯中，加水浸種4 h。將濾紙置于培養(yǎng)皿中作發(fā)芽床，將種子置于濾紙上，保持濾紙濕潤(rùn)，30 ℃恒溫暗培養(yǎng)[5]。種子萌發(fā)后，以胚根長(zhǎng)達(dá)到或超過種子長(zhǎng)度為標(biāo)準(zhǔn)記錄發(fā)芽數(shù)。每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)，第3天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，第5天測(cè)量幼苗根長(zhǎng)和株高以及幼苗各部位鮮質(zhì)量、干質(zhì)量，第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

發(fā)芽勢(shì)=第3天發(fā)芽種子數(shù)/試驗(yàn)種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽率=第7天發(fā)芽總粒數(shù)/試驗(yàn)種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽指數(shù)=在第7天內(nèi)每天種子發(fā)芽數(shù)/相對(duì)應(yīng)的種子發(fā)芽天數(shù)的發(fā)芽總和；

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×幼苗鮮質(zhì)量；

出苗率=子葉完全展開的幼苗數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

1.2.3 細(xì)胞膜透性測(cè)定 取不同輻照處理的凈種子各20粒，用蒸餾水沖洗3次，再用四蒸水沖洗2次。將清洗過的種子放入潔凈的100 mL三角瓶中，加入四蒸水60 mL，于25 ℃下浸泡24 h，用精密電導(dǎo)率儀測(cè)定浸出液的電導(dǎo)率(C1)，再將種子及浸出液100 ℃水浴30 min，冷卻至25 ℃后測(cè)定總電導(dǎo)率(C2)[6-7]。

相對(duì)電導(dǎo)率=(C1-C0)/(C2-C0)×100%。

式中：C0為四蒸水的電導(dǎo)率。

1.2.4 用葉絲浸提法[8]測(cè)定子葉葉綠素含量 用小刀和直尺切取1 cm2子葉葉片，切成長(zhǎng)約5 mm、寬約1 mm的細(xì)絲，投入5 mL 80%丙酮的刻度試管中，封管口于暗中提取至細(xì)絲完全變白為止。分別在663、645 nm處讀取提取液的吸光度D，所用公式為：

葉綠素a(Chl a)含量=12.7D663 nm-2.69D645 nm；

葉綠素b(Chl b)含量=22.9D645 nm-4.86D663 nm；

葉綠素總含量(CV)=Chl a含量+Chl b含量；

CA=0.5CV/S。

式中：CA為單位面積的葉綠素含量；S為用于提取葉綠素的葉面積。

1.2.5 半致死劑量(LD50)計(jì)算 不同劑量輻照處理后的出苗率是確定輻射損傷效應(yīng)的重要指標(biāo)，是計(jì)算半致死劑量的依據(jù)，半致死劑量是輻射育種適宜誘變劑量的參考[9]。處理種子的出苗率為對(duì)照出苗率50%的輻射劑量即為半致死劑量。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照處理對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的影響

不同的輻照劑量對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的影響不同，具體結(jié)果如圖1所示。當(dāng)輻照劑量為50 Gy(處理2)時(shí)，其發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)這4項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)均高于對(duì)照和其他各輻照處理，分別比對(duì)照增加7.47%、4.96%、13.84%、27.04%，特別是發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)這2項(xiàng)指標(biāo)明顯大幅提高，種子發(fā)芽時(shí)間短，發(fā)芽速度快，發(fā)芽整齊度高。當(dāng)輻照劑量為100～880 Gy時(shí)，隨著輻照劑量的增加，黃瓜種子發(fā)芽進(jìn)程明顯延遲，其發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率，發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)明顯下降，而且劑量越高，下降越明顯；當(dāng)輻照劑量為1 000 Gy(處理8)時(shí)，其發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)只有對(duì)照的58.33%、48.86%、43.51%、12.81%，輻射損傷效應(yīng)明顯。

2.2 輻照處理對(duì)黃瓜種子細(xì)胞膜透性的影響

輻照處理不僅能引起細(xì)胞核中DNA產(chǎn)生變異，同時(shí)還會(huì)引起膜損傷，膜透性會(huì)明顯改變，表現(xiàn)出種子浸出液電導(dǎo)率改變，對(duì)輻照處理后黃瓜種子 24 h 浸出液電導(dǎo)率及相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定結(jié)果見圖2。當(dāng)輻照劑量為50 Gy(處理2)，2種電導(dǎo)率均低于未輻照處理，說明細(xì)胞膜透性小于對(duì)照，細(xì)胞膜未受到輻射損傷；當(dāng)輻照劑量為255～880 Gy時(shí)，細(xì)胞滲出液濃度隨著輻照劑量的加大而增加，電導(dǎo)率越大，膜透性越大，細(xì)胞受損傷程度越大；當(dāng)輻照劑量為1 000 Gy時(shí)，24 h電導(dǎo)率、相對(duì)電導(dǎo)率分別為23.92 μS/cm、29.78%，分別是對(duì)照的1.927、2.009倍。黃瓜種子的24 h電導(dǎo)率和相對(duì)電導(dǎo)率變化趨勢(shì)一致。

2.3 輻照處理對(duì)黃瓜幼苗子葉葉綠素含量的影響

對(duì)苗齡為5 d的黃瓜幼苗，于08：00取樣，測(cè)其子葉葉綠素含量，結(jié)果見圖3。從圖3可知，當(dāng)輻照劑量為50 Gy(處理2)時(shí)，其子葉葉綠素含量為0.232 mg/dm2，高于對(duì)照和其他各處理。處理3以后，隨著輻照劑量的增加，子葉葉綠素含量直線下降，到1 000 Gy(處理8)時(shí)，葉綠素含量?jī)H為 0.153 mg/dm2，比對(duì)照減少29.49%，幼苗葉綠素合成受到嚴(yán)重影響，植株葉面散生條狀黃斑。

2.4 輻照處理對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響

對(duì)第5天的幼苗，每處理取6株，考察幼苗的生長(zhǎng)情況，測(cè)定根長(zhǎng)和株高，其結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，不同的輻照劑量對(duì)黃瓜幼苗根系生長(zhǎng)影響不同。當(dāng)輻照劑量為50 Gy(處理2)時(shí)，幼苗平均根長(zhǎng)為 3.4 cm，較對(duì)照增加0.3 cm，側(cè)根發(fā)生多，根系生長(zhǎng)快。當(dāng)輻照劑量為100～880 Gy時(shí)，隨著輻照劑量的增加，受輻照種子的幼苗根系生長(zhǎng)明顯受到抑制，且劑量越大，抑制效果越明顯，側(cè)根發(fā)生也受到抑制。當(dāng)輻照劑量為1 000 Gy時(shí)，絕大多數(shù)幼苗只有1條主根，平均根長(zhǎng)只有0.8 cm，側(cè)根很少發(fā)生。

由圖4還可知輻照處理對(duì)黃瓜幼苗株高的影響與根系相似，當(dāng)輻照劑量為50 Gy時(shí)，幼苗株高為 4.6 cm，高于對(duì)照0.4 cm，也高于其他各輻照處理。當(dāng)輻照劑量為 880 Gy(處理7)、1 000 Gy(處理8)時(shí)，株高明顯較其他處理低，只有1.1、0.6 cm，分別比對(duì)照低3.1、3.6 cm，子葉生長(zhǎng)緩慢，且其上散生條狀黃斑。

2.5 輻照處理對(duì)黃瓜幼苗各部位鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和干質(zhì)量/鮮質(zhì)量值的影響

考察第5天的黃瓜幼苗植株各部位的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量以及干質(zhì)量/鮮質(zhì)量值，結(jié)果如表1所示。子葉的鮮質(zhì)量以處理2最高，平均每株為0.099 3 g，比對(duì)照增加0.014 7 g，處理3以后隨著輻照劑量的增加，子葉的鮮質(zhì)量逐漸下降，至處理8時(shí)每株子葉鮮質(zhì)量只有0.030 2 g，僅為對(duì)照的35.70%。下胚軸、根系的鮮質(zhì)量隨著輻照劑量的變化情況與子葉相似。

表1 輻照處理對(duì)黃瓜幼苗各部位鮮質(zhì)量、干質(zhì)量及干/鮮比值的影響

注：測(cè)定的各部位數(shù)值指平均每株黃瓜幼苗鮮質(zhì)量和干質(zhì)量。

子葉、下胚軸、根系3個(gè)部位的干質(zhì)量表現(xiàn)一致，也是處理2最高，處理3以后隨著輻照劑量的增加，3個(gè)部位的干質(zhì)量明顯下降，劑量越大，下降越明顯。

值得注意的是子葉、下胚軸、根系3個(gè)部位的干質(zhì)量/鮮質(zhì)量值，當(dāng)輻照劑量為50 Gy時(shí)，3個(gè)部位的干質(zhì)量/鮮質(zhì)量值分別為 0.141 0、0.136 4、0.109 4，均高于對(duì)照，3個(gè)部位的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量也高于對(duì)照，可見黃瓜種子經(jīng)50 Gy輻照處理以后，幼苗各部位在增加鮮質(zhì)量的同時(shí)，還使干質(zhì)量有相應(yīng)的增加，說明不單是細(xì)胞含水量增加。當(dāng)輻照劑量為100～1 000 Gy時(shí)，隨著輻照劑量的增加，子葉、下胚軸、根系的干質(zhì)量/鮮質(zhì)量值明顯上升，有的處理還遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過對(duì)照，這是由于不同劑量的輻照處理使幼苗根系生長(zhǎng)受到抑制，根系吸收能力較弱，子葉、下胚軸的生長(zhǎng)受到抑制，有機(jī)物合成受到影響，各部位鮮質(zhì)量、干質(zhì)量低于對(duì)照。因此，這種較高的干質(zhì)量/鮮質(zhì)量值并不代表植株生長(zhǎng)加強(qiáng)，而只是生長(zhǎng)受抑制的表現(xiàn)。

2.6 黃瓜干種子輻射處理的半致死劑量

植物種子輻射當(dāng)代的出苗率是確定輻射損傷效應(yīng)的重要指標(biāo)，是計(jì)算半致死劑量的依據(jù)。黃瓜種子的出苗率是指子葉完全展開的幼苗數(shù)占供試種子數(shù)的百分比。半致死劑量是輻射育種的適宜劑量。以輻照劑量0、100、255、500、675、880、1 000 Gy 為自變量(x)，相對(duì)應(yīng)的出苗率36.80%、30.63%、26.32%、22.13%、19.27%、17.67%、16.22%為因變量(y，%)，進(jìn)行回歸計(jì)算，得a=36.21，b=-0.018 7，直線方程式為y=33.27-0.018 7x。將對(duì)照出苗率的50%代入方程式，得LD50=795 Gy。

3 討論

在一定的劑量范圍內(nèi)，輻射能促進(jìn)植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。王天龍等研究發(fā)現(xiàn)，輻射劑量為 20～60 Gy 時(shí)有利于蘿卜種子發(fā)芽，輻射劑量為 60～150 Gy 時(shí)有利于其幼苗根的生長(zhǎng)[10]。陳桂松等用低劑量γ射線輻照黃瓜風(fēng)干種子，發(fā)現(xiàn) 4.28 Gy 輻照劑量處理可明顯刺激黃瓜增產(chǎn)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)輻照劑量為50 Gy時(shí)，黃瓜種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)4項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)均高于對(duì)照，促進(jìn)了黃瓜種子的萌發(fā)；第5天的黃瓜幼苗單位面積葉綠素含量高于對(duì)照和其他各輻照處理，有利于黃瓜幼苗有機(jī)物的合成；50 Gy輻照處理能促進(jìn)幼苗根系生長(zhǎng)，根長(zhǎng)最長(zhǎng)，側(cè)根發(fā)生多，有利于幼苗對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收；50 Gy輻照處理能增加幼苗子葉、下胚軸、根系3個(gè)部位的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量及干質(zhì)量/鮮質(zhì)量值，從而提高幼苗素質(zhì)。

輻射處理后種子的發(fā)芽情況是衡量輻射損傷的重要指標(biāo)之一。敖妍等發(fā)現(xiàn)，對(duì)扶芳藤種子輻射后，其發(fā)芽率受到的抑制與輻射劑量呈極顯著負(fù)相關(guān)[12]。葛維亞等研究表明60Co-γ輻射處理明顯不利于地被菊種子的萌發(fā)[13]。在本試驗(yàn)中，當(dāng)輻射劑量≥100 Gy時(shí)，輻射處理對(duì)黃瓜種子的萌發(fā)具有明顯的抑制作用，隨著輻照劑量的增加，種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)明顯下降，輻照抑制了種子的萌發(fā)，其原因可能是輻射對(duì)種胚結(jié)構(gòu)及萌發(fā)過程的生理活動(dòng)產(chǎn)生了不同程度的影響。

輻射處理對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，也是衡量輻射生物學(xué)效應(yīng)的一個(gè)重要指標(biāo)。從本研究對(duì)黃瓜種子輻射處理結(jié)果來看，100～1 000 Gy的輻射處理對(duì)幼苗生長(zhǎng)抑制明顯，隨輻照劑量的增加，第5天的黃瓜幼苗子葉葉綠素含量逐漸下降，幼苗株高逐漸變矮，根長(zhǎng)逐漸變短，子葉、根系及下胚軸生長(zhǎng)明顯受到抑制，輻照劑量為1 000 Gy時(shí)，幼苗生長(zhǎng)緩慢，株高最矮，大部分幼苗只有1條主根，側(cè)根很少發(fā)生，部分種子雖然能正常發(fā)芽，但不能出苗或出苗后逐漸死亡。本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)輻照劑量高于100 Gy時(shí)，幼苗的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量與輻照劑量呈負(fù)相關(guān)，其原因可能是輻射處理抑制了幼苗根系生長(zhǎng)，根系吸收能力較弱，下胚軸和子葉生長(zhǎng)受到抑制，有機(jī)物合成受到影響。但干質(zhì)量/鮮質(zhì)量值與輻照劑量呈正相關(guān)，但這并不代表幼苗生長(zhǎng)的加強(qiáng)，而只是生長(zhǎng)受到抑制的表現(xiàn)。

輻射誘變首先要確定適宜的輻射劑量，才可能獲得有益的突變，一般都以半致死劑量作為輻射育種的適宜輻射劑量。耿興敏等在研究60Co-γ射線輻射對(duì)桂花種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)影響時(shí)，以輻射處理后桂花品種的發(fā)芽率計(jì)算半致死劑量，且還發(fā)現(xiàn)高劑量輻射后種子雖能萌發(fā)，但出苗率受到明顯的抑制[14]。熊秋芳等研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的輻射不會(huì)影響蘿卜種子的最終發(fā)芽率，卻抑制了出苗率，且隨著輻射劑量的增大，其抑制作用變明顯，主要表現(xiàn)為抑制了根莖生長(zhǎng)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，≥100 Gy輻射劑量處理的黃瓜種子的發(fā)芽率與出苗率存在較大差異，部分種子雖然能發(fā)芽，但最終未能出苗，以發(fā)芽率計(jì)算的半致死劑量高于以出苗率計(jì)算的半致死劑量，較高的輻射劑量會(huì)增加畸變率，從而降低有益突變體的產(chǎn)生。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，60Co-γ射線對(duì)黃瓜種子的輻射效應(yīng)明顯。當(dāng)輻照劑量為50 Gy時(shí)，輻射能明顯促進(jìn)黃瓜種子萌發(fā)，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)和提高幼苗素質(zhì)。當(dāng)輻照劑量為100～1 000 Gy 時(shí)，種子發(fā)芽率等4項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)、幼苗子葉葉綠素含量、幼苗生長(zhǎng)量、幼苗各部位的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量隨輻照劑量的增加而明顯下降，而種子細(xì)胞膜透性和幼苗各部位干質(zhì)量/鮮質(zhì)量值隨著輻照劑量的增加而加大，說明輻射能明顯抑制黃瓜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。經(jīng)計(jì)算，黃瓜種子輻射誘變的半致死劑量為795 Gy。