秦子禹， 張向昆， 王 娜， 項(xiàng)殿芳

(河北科技師范學(xué)院園藝科技學(xué)院，河北昌黎 066600)

在植物基因表達(dá)研究中，通常需要引入內(nèi)參基因來(lái)矯正系統(tǒng)誤差。常用的內(nèi)參基因有肌動(dòng)蛋白基因(Actin)、微管蛋白基因(Tubulin)、泛素基因(Ubiquitin)、18SrRNA、組蛋白基因(Histone)等。肌動(dòng)蛋白(Actin)是普遍存在于真核生物中的一種蛋白質(zhì)，也是細(xì)胞骨架的重要組成成分，它主要參與細(xì)胞的變形運(yùn)動(dòng)、胞吞與胞吐、細(xì)胞分裂、花粉管生長(zhǎng)、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞形狀變化、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及基因表達(dá)與調(diào)控等過(guò)程[1-3]。此外，Actin基因在核苷酸和氨基酸水平上具有高度的保守性和同源性，據(jù)此可將其用于研究不同物種之間的親緣關(guān)系和分化時(shí)間[4-5]。目前，已經(jīng)成功克隆了鴨梨[6]、葡萄[7]、棗[8]、火龍果[9]、香蕉[10]等果樹(shù)的Actin基因。

蘋果是世界四大水果之一，也是我國(guó)栽培面積和產(chǎn)量最大的果樹(shù)[11]。近年來(lái)，探究蘋果矮化、抗逆性、果實(shí)品質(zhì)形成等方面的分子機(jī)制成為研究熱點(diǎn)，而尋找到穩(wěn)定的內(nèi)參基因是開(kāi)展相關(guān)研究的必備條件之一。鑒于Actin基因的保守性，且已被作為內(nèi)參基因成功應(yīng)用在不同作物的分子生物學(xué)研究中[12-14]，本研究以我國(guó)栽培面積最大的紅富士蘋果的葉片為材料，采用反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcriptase PCR，RT-PCR)方法，對(duì)蘋果Actin基因片段進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，旨在為深入研究Actin基因的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑和儀器

紅富士蘋果葉片采自河北科技師范學(xué)院園藝科技學(xué)院試驗(yàn)站(119.17°E，39.70°N)。

RNAiso Plus、RNAiso-mate、Recombinant DNase Ⅰ 試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒及pEASY-T3Cloning Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×ESTaqMasterMix購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

Bio-Rad S1000 PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)Universal Hood Ⅱ?yàn)槊绹?guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 通過(guò)比對(duì)GenBank中已發(fā)表的高等植物肌動(dòng)蛋白基因(Actin)的核苷酸序列，找到保守區(qū)域，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，將上游引物標(biāo)記為Act-sta-F：TGGTGAAGGCTGGATTTGCT；下游引物標(biāo)記為Act-sta-R：GACTCGTCATACTCACCCTTGG，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 048 bp，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 稱取0.1 g蘋果葉片，利用RNAiso Plus、RNAiso-mate試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。再利用Recombinant DNaseI試劑盒對(duì)得到的總RNA進(jìn)行純化，然后以O(shè)ligo(dT)18為引物采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.3Actin基因的PCR擴(kuò)增 以Act-sta-F、Act-sta-R 為引物，以蘋果葉片cDNA為模版進(jìn)行Actin基因的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為cDNA模板 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×ESTaqMasterMix 12.5 μL，RNase-free Water 9.5 μL，共計(jì)25 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 再延伸5 min。

1.2.4Actin基因的克隆與鑒定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察到符合預(yù)期大小(1 000 bp左右)的目標(biāo)片段，利用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)其進(jìn)行切膠回收并純化后連接到pEASY-T3載體上，轉(zhuǎn)化至EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，于37 ℃下在含有氨芐青霉素、X-gal、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)8～14后，挑取陽(yáng)性單克隆菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)，用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和酶切鑒定，同時(shí)送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

將測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)網(wǎng)站上(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進(jìn)行BLAST同源性分析及保守域查找，然后利用DNAMAN8、MEGA5軟件對(duì)克隆序列進(jìn)行氨基酸保守性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Actin基因的克隆

以從蘋果葉片中提取的總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，利用引物Act-sta-F、Act-sta-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1條長(zhǎng)度為1 000 bp左右的基因片段(圖1)，與預(yù)期大小相符。將其回收純化后，連接到pEASY-T3載體上，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，按照“1.2.4”節(jié)中的方法培養(yǎng)后，挑取陽(yáng)性單克隆菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)，用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和酶切鑒定，均得到長(zhǎng)度為1 000 bp左右的特異片段(圖2、圖3)，表明該基因片段已被成功克隆，可以進(jìn)行測(cè)序。

2.2 Actin基因的測(cè)序結(jié)果及序列分析

測(cè)序結(jié)果(圖4)表明，本研究克隆的基因片段長(zhǎng)度為1 048 bp。通過(guò)BLAST軟件搜索比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列與其他植物的Actin基因具有高度同源性，其中與白梨(Pyrusxbretschneideri)的同源性高達(dá)99%(圖5)，與核果類果樹(shù)桃(Prunuspersica)、中國(guó)李(Prunussalicina)和歐洲甜櫻桃(Prunusavium)的同源性均為94%，與棗(Ziziphusjujube)的同源性為90%，表明克隆得到的基因片段為Actin基因的一部分，將其命名為MdActin1。

通過(guò)DNAMAN8軟件將該片段翻譯成氨基酸序列，并利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序?qū)ζ溥M(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果(圖4)顯示，該序列編碼348個(gè)氨基酸，包括338個(gè)保守氨基酸，而非保守氨基酸僅為10個(gè)，與其他植物肌動(dòng)蛋白的氨基酸同源性達(dá)97%以上，表明該序列在氨基酸水平上高度保守。對(duì)MdActin1蛋白進(jìn)行功能保守域分析， 結(jié)果(圖5)顯示，其同時(shí)含有NBDsugarkinase、HSP70、actin superfamily特異性標(biāo)簽，說(shuō)明MdActin1蛋白為Actin蛋白超家族成員之一。

選取經(jīng)BLAST分析得出的同源性高的氨基酸序列，利用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果(圖6)顯示，MdActin1蛋白與白梨Actin蛋白(登錄號(hào)：NP_001289215.1)親緣關(guān)系最近，其次為榴蓮Actin蛋白(XP_022774869.1)，與番茄Actin蛋白(登錄號(hào)：NP_001295376.1)親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 討論與結(jié)論

高等植物肌動(dòng)蛋白是由單一多肽鏈構(gòu)成的球狀蛋白，包含有375～377個(gè)氨基酸，廣泛分布于植物的各種組織器官中，且所有植物的肌動(dòng)蛋白均起源于一個(gè)共同祖先[15]。植物Actin基因在進(jìn)化上極為保守，其堿基替換率非常低，為每1億年替換1%，因此常將其用于分析物種進(jìn)化和鑒別物種間的親緣關(guān)系[16]。此外，也常被作為內(nèi)參基因用于基因表達(dá)研究[12-14]。

本研究中克隆的紅富士蘋果葉片Actin基因序列與白梨Actin基因的同源性高達(dá)99%，與核果類果樹(shù)桃、中國(guó)李和歐洲甜櫻桃Actin基因的同源性均為94%，與棗Actin基因的同源性為90%，充分證明蘋果Actin基因與其他植物Actin基因具有較高的同源性。此外，在其編碼的氨基酸序列中，保守氨基酸數(shù)量為338個(gè)，而非保守氨基酸僅為10個(gè)，與其他植物肌動(dòng)蛋白同源性達(dá)97%以上，表明該序列在氨基酸水平上也是高度保守的。該研究結(jié)果不僅可豐富高等植物Actin基因的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，還可為進(jìn)一步深入研究植物Actin基因的功能并將其作為內(nèi)參基因應(yīng)用于蘋果基因表達(dá)研究中提供依據(jù)。