李隱俠， 張 俊， 錢 勇， 孟春花， 王慧利， 鐘 聲， 曹少先

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所/江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇南京 210014)

MC1R(melanocortin-1 receptor，MC1R)基因，也稱促黑素細(xì)胞激素受體(MSHR)基因，在哺乳動(dòng)物中由毛色擴(kuò)展(extension)位點(diǎn)編碼，為G蛋白偶聯(lián)受體黑素皮質(zhì)素受體(melanocortin receptors，MCRs)超家族成員之一，只有1個(gè)編碼區(qū)，編碼蛋白有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域[1-2]。研究表明，MC1R基因是控制動(dòng)物黑色素合成的重要基因，其與編碼刺鼠信號(hào)蛋白(Agouti)的基因一起調(diào)控動(dòng)物色素合成的數(shù)量和分布，從而對(duì)動(dòng)物的毛色形成起到非常重要的作用[3-4]。

研究表明，MC1R基因位點(diǎn)的多態(tài)性與哺乳動(dòng)物包括大鼠[2]、牛[5]、馬[6]、豬[7]、綿羊[3]、山羊[8]毛色變異都有很大的相關(guān)性。在家畜中，沼澤水牛與白沼澤水牛在476、618、881、930、931 bp位點(diǎn)上分別發(fā)生了T/C、G/C、G/A、G/A、A/G突變，導(dǎo)致沼澤水牛和白沼澤水牛第159位氨基酸由絲氨酸變成苯丙氨酸，第310位氨基酸由谷氨酸變成丙氨酸，第294位氨基酸由天冬氨酸變成丙氨酸，發(fā)生了非同義突變[5]。在綿羊中MC1R位點(diǎn)鑒定出2個(gè)等位基因ED和E+[9-10]，Vage等研究表明，MC1R中 p.M73K 和p.D121N位點(diǎn)是控制黑色性狀顯著的等位基因位點(diǎn)(ED)，它們的突變導(dǎo)致綿羊黑色表型的形成[11]；在杜洛克豬中的研究表明，A240T突變與其紅色毛色相關(guān)[12]，F(xiàn)ontanesi等在6個(gè)不同毛色的山羊中共檢測到MC1R基因5個(gè)單核苷酸突變，并且發(fā)現(xiàn)MC1R基因可能決定了真黑色素和褐色素的表型[13]。

研究表明，MC1R基因表達(dá)量與動(dòng)物被毛顏色及膚色存在關(guān)聯(lián)。林宇紓等研究發(fā)現(xiàn)，MC1R基因在摩拉水牛、沼澤水牛和黃牛皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于白沼澤水平，且白沼澤水牛MC1R基因的編碼區(qū)發(fā)生氨基酸位點(diǎn)突變，推測白沼澤水牛體內(nèi)合成的黑色素缺失而導(dǎo)致毛色白化[5]；何蕊純等研究了MC1R基因在3種色型烏蘇里貉皮膚組織中表達(dá)發(fā)現(xiàn)，MC1R基因在野生型烏蘇里貉皮質(zhì)組織中蛋白表達(dá)量顯著高于紅褐色和白色型，說明MC1R在烏蘇里貉皮組織中的表達(dá)量與烏蘇里色型間存在一定的相關(guān)性[14]。在羊駝中，棕色皮膚中MC1R基因的表達(dá)量遠(yuǎn)高于白色被毛，且差異極顯著[15]。

蘇淮山羊是波爾山羊和徐淮山羊的雜交后代，采用傳統(tǒng)雜交育種技術(shù)和現(xiàn)代分子輔助育種技術(shù)相結(jié)合，培育出白色被毛、繁殖力高、生長速度快、適應(yīng)性強(qiáng)的肉用山羊新品種，目前已橫交第2個(gè)世代[16]。本研究以蘇淮山羊和波爾山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，分析MC1R基因在山羊中的序列特征，挖掘在2種不同毛色山羊中MC1R基因SNPs位點(diǎn)差異及表達(dá)量的差異，為白色蘇淮山羊的進(jìn)一步選育提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

130只白色蘇淮山羊和100只波爾山羊由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地統(tǒng)一飼養(yǎng)管理，營養(yǎng)及管理水平保持一致。每個(gè)個(gè)體采集耳組織樣，置液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃ 保存。組織樣DNA的提取采用酚/三氯甲烷抽提法，TE緩沖液溶解后-20 ℃保存?zhèn)溆?。RNA提取試劑盒提取RNA，TaKaRa一步法逆轉(zhuǎn)錄cDNA備用。

1.2 PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中山羊MC1R基因序列(序列號(hào)為FM212940)，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物P1，擴(kuò)增蘇淮山羊MC1R基因編碼區(qū)全序列。以蘇淮山羊DNA池為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物退火溫度和片段長度見表1。PCR反應(yīng)總體系20 μL，含模板DNA 60 ng、Taq聚合酶(5 U/μL)0.2 μL、dNTP(10 mmol/L)0.5 μL、引物(100 μmol/L)各 0.5 μL、MgC12(25 mmol/L)1.4 μL、10×緩沖液2 μL，添加滅菌雙蒸水至 20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

表1 引物序列及PCR反應(yīng)參數(shù)

1.3 實(shí)時(shí)定量熒光PCR

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中山羊MC1R基因序列(序列號(hào)為FM212940)和綿羊GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶，序列號(hào)為AF030943)，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物P2和GAPDH，以看家基因GAPDH為內(nèi)參，實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法檢測MC1R基因在2種山羊耳組織中的表達(dá)水平。反應(yīng)總體系20 μL，含模板DNA 60 ng、SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL、引物(100 mol/L)各0.8 μL，添加滅菌雙蒸水至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。

1.4 SNP篩選

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠后用DNA膠回收試劑盒回收目的DNA片段，直接送往上海捷瑞生物公司測序。根據(jù)序列峰圖，篩選出SNPs。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 11.5軟件中的One-Way ANOVA統(tǒng)計(jì)不同組織中表達(dá)量的差異水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇淮山羊MC1R基因擴(kuò)增及序列分析

以蘇淮山羊DNA池為模板對(duì)MC1R基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增效果良好(圖1)，切膠回收后直接進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段長度與預(yù)期結(jié)果一致，全長1 127 bp。

將擴(kuò)增獲得序列與引物源序列進(jìn)行比對(duì)，通過DNA STAR軟件分析得到蘇淮山羊MC1R基因的編碼區(qū)全序列954 bp，編碼317個(gè)氨基酸殘基。通過DNA MAN序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，2個(gè)品種山羊MC1R基因編碼區(qū)核苷酸序列和氨基酸序列的一致性分別為99.79%和98.77%；核苷酸c.676 A>G突變和 c.701A>G 突變分別導(dǎo)致了氨基酸由谷氨酸到賴氨酸的變化和甘氨酸到天冬氨酸的改變(圖2)。蘇淮山羊MC1R基因與人類、小鼠、大鼠、牛、豬和綿羊的核苷酸一致性分別為 85.57%、79.65%、81.62%、96.05%、86.63%和98.55%，氨基酸的一致性分別為81.60%、75.15%、78.22%、95.09%、82.07%和98.16%，與家禽類核苷酸和氨基酸的一致性為73.52%和61.66%，說明MC1R基因序列在哺乳動(dòng)物中的保守性較好。2個(gè)不同山羊品種MC1R基因序列中A、T、C、G 4種堿基的平均含量分別為14.8%、22.3%、36.6%、26.3%，其中A+T為37.1%，G+C為62.9%，可見AT含量遠(yuǎn)低于GC含量。

2.2 哺乳動(dòng)物MC1R系統(tǒng)發(fā)育分析

以家禽為外類群，采用MEGA 4.1軟件中NJ法構(gòu)建了哺乳動(dòng)物MC1R基因編碼蛋白(表2)的系統(tǒng)發(fā)育樹， 結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)聚類結(jié)果與經(jīng)典分類學(xué)結(jié)果基本一致。2個(gè)山羊品種與7個(gè)哺乳動(dòng)物聚在一起，而外類群家禽自成一類；在哺乳動(dòng)物中，偶蹄目中的2個(gè)山羊品種、1個(gè)綿羊品種與牛聚在一起[自舉率(BP)=100%]，后再與豬聚為一類(BP=72%)；嚙齒目中的大鼠和小鼠聚為一類(BP=100%)，而靈長目中的人類和黑猩猩聚為一類(BP=100%)。在偶蹄目中，?？浦械?個(gè)山羊品種與綿羊先聚在一起(BP=90%)后與牛聚為一類(BP=100%)，豬科中的豬單獨(dú)聚為一類。在靈長目中，人科中的人和黑猩猩聚為一類(BP=99%)。

表2 部分哺乳動(dòng)物MC1R氨基酸序列信息

2.3 MC1R基因在山羊耳組織中表達(dá)水平

為進(jìn)一步研究MC1R基因在山羊毛色中的作用，用實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法檢測MC1R基因在白色蘇淮山羊和紅棕色波爾山羊耳組織中的表達(dá)水平。由圖4可知，紅棕色耳朵的波爾山羊的MC1R表達(dá)水平高于蘇淮山羊，但是差異并不顯著(P>0.05)。

2.4 山羊MC1R基因編碼區(qū)SNPs篩選和分析

以2個(gè)山羊品種(波爾山羊和蘇淮山羊)DNA池為模板，利用引物P1對(duì)MC1R基因編碼區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測回收后直接進(jìn)行測序。根據(jù)測序峰圖，在2個(gè)山羊品種MC1R基因編碼區(qū)中共發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNP位點(diǎn)，蘇淮山羊群體中發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNPs位點(diǎn)，即183C/T和748T/G(圖5-A、B)，波爾山羊群體中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)SNPs位點(diǎn)，701G/A(圖5-C)，其中748T/G位點(diǎn)突變引起了苯丙氨酸到頡氨酸的突變，701G/A位點(diǎn)突變引起了甘氨酸到天冬氨酸的改變。

3 結(jié)論與討論

MC1R基因是1個(gè)編碼7次跨膜蛋白的G蛋白受體，被認(rèn)為是動(dòng)物毛色和皮膚顏色變化的重要候選基因，可與內(nèi)源配體促黑激素或者刺鼠信號(hào)蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)動(dòng)物的毛色和膚色[4，17]。

本研究以白色被毛的蘇淮山羊和紅棕色頭頸部的波爾山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，蘇淮山羊是利用波爾山羊和徐淮山羊雜交后代，采用傳統(tǒng)雜交育種技術(shù)和現(xiàn)代分子輔助育種技術(shù)相結(jié)合，培育出白色被毛、繁殖力高、生長速度快、適應(yīng)性強(qiáng)的肉用山羊新品種[16]。本研究得到蘇淮山羊和波爾山羊MC1R基因編碼區(qū)長度954 bp，編碼317個(gè)氨基酸殘基，同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)MC1R基因在哺乳動(dòng)物間相對(duì)保守，與綿羊的氨基酸序列一致性最高，為98.16%，牛的次之(95.09%)，與雞的同源性僅為61.66%。在蘇淮山羊和波爾山羊品種間核苷酸的一致性和氨基酸的一致性都很高，分別為99.79%和98.77%；核苷酸c.676的A>G突變和c.701A>G突變分別導(dǎo)致氨基酸由谷氨酸到賴氨酸的變化和甘氨酸到天冬氨酸的改變。波爾山羊的紅棕色耳朵和蘇淮山羊白色耳朵是1對(duì)不同的毛色性狀，而本研究發(fā)現(xiàn)蘇淮山羊和波爾山羊間MC1R基因編碼區(qū)有2個(gè)可以引起氨基酸改變的SNPs位點(diǎn)存在，這可能與二者之間毛色不同的性狀相關(guān)。

以前的研究表明，MC1R基因的表達(dá)量與動(dòng)物的被毛和膚色存在一定的關(guān)聯(lián)[18]。本研究在2種山羊不同被毛的耳組織中MC1R基因表達(dá)水平也存在差異，紅棕色波爾山羊的表達(dá)水平高于白色蘇淮山羊表達(dá)水平，雖然差異不顯著，但也可在一定水平上反映不同毛色間MC1R基因表達(dá)水平是不同的，這與林宇紓等的研究結(jié)果[5]一致。這些結(jié)果間接說明MC1R基因可能參與蘇淮山羊白色被毛形成的分子調(diào)控。

到目前為止，關(guān)于MC1R多態(tài)性與動(dòng)物毛色關(guān)聯(lián)性的研究很多，在哈薩克綿羊中發(fā)現(xiàn)MC1R基因T218A突變(p.M73K)的AB基因型與不同被毛顏色顯著相關(guān)[18]；Fontanesi等在對(duì)波爾山羊的研究中發(fā)現(xiàn)，MC1R基因第226個(gè)核苷酸位置由賴氨酸向谷氨酸的轉(zhuǎn)變與波爾山羊頭部和頸部的紅色毛有關(guān)[13]；本研究中在波爾山羊和蘇淮山羊群體MC1R基因編碼區(qū)篩選到3個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中183C/T和748T/G只存在于白色被毛的蘇淮山羊群體中，701G/A位點(diǎn)僅存在于棕色頭部的波爾山羊群體中，在白色被毛的蘇淮山羊群體中未見該突變位點(diǎn)，說明波爾山羊中701G/A位點(diǎn)可能與其棕色頭部被毛有關(guān)，這些位點(diǎn)是否與山羊毛色形成有關(guān)聯(lián)還需要更多毛色的山羊進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。