田永賢， 陳 敏， 王其剛， 張 顥， 邱顯欽

(1.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650091； 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所/國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南昆明 650205)

自然界中的植物與病原菌在長期的協(xié)同進(jìn)化過程中形成了一種動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系，植物產(chǎn)生了一套保護(hù)自身的防御體系[1]。目前，國內(nèi)外大量實(shí)驗(yàn)室專注于研究植物的抗病機(jī)制，篩選出抗病的突變體植株，分離并克隆相關(guān)的抗性基因[2]，以培育生產(chǎn)所需的抗病植株。植物存在2類基本抗性基因，一類是抗病基因(resistace gene，簡稱R)，R基因是植物體中能特異性識(shí)別病原并能激發(fā)抗病反應(yīng)的一類半顯性和顯性抗性基因，其特點(diǎn)是“基因?qū)颉笔健Ｒ缓透咝?，因其種族特異性強(qiáng)，幾年內(nèi)，病原菌便可克服R基因賦予植物的抵抗力而引起流行病大暴發(fā)[3-4]，原來的抗病品種因產(chǎn)生新的病原菌生理小種而喪失抗性。綜合評價(jià)其利用價(jià)值，用該基因培育抗病品種操作較容易且抗病性高，但其抗病性不能穩(wěn)定和持久。另外一類是感病基因(susceptibility gene，簡稱S)，其為植物易感性所需，與植物的感病性有關(guān)，負(fù)調(diào)控植物的抗病過程。S基因功能的喪失會(huì)使植物獲得隱性遺傳的抗性，其等位基因正好彌補(bǔ)了R抗性上的缺點(diǎn)[4-5]，因此S基因的抗病模式是不同于R抗病植株的，而本文所分析的MLO家族基因就是S基因的一種。

1942年，F(xiàn)reisleben等使用X-rays(X射線)誘變了德國大麥(Hordeumvulgare)品種Haisa，獲得的突變體產(chǎn)生了對大麥白粉菌(Blumeriagraminisf.sp.hordei，簡稱Bgh)的廣譜抗性，mlo抗性從此為人們所了解[6]。1992年J?rgensen獲得了目前被普遍利用的mlo基因突變體中僅有的自發(fā)突變植株mlo-11[7]。隨后人們又從谷子(Setariaitalica)[8]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)[3]、野薔薇(Rosamultiflora)[9]、豌豆(Pisumsativum)[10]和蘋果(Malusdomestica)[5]等植物中分離克隆了MLO同源基因，形成了MLO基因家族。目前僅發(fā)現(xiàn)其存在于植物和苔蘚類中，表明該家族基因是植物所特有的抗病基因[11-12]，MLO基因是一類單基因控制的隱性抗病基因，mlo突變體具有對白粉菌廣譜、高效且持久的抗性[7，11，13]。

傳統(tǒng)育種利用R基因來培育抗病品種，由于R基因高度的專化性，短短幾年，白粉菌便可克服這種抗性而產(chǎn)生新的生理小種，導(dǎo)致原來培育的品種失去對新小種的抗病能力，甚至可能引起新生理小種大暴發(fā)，極大影響作物的生產(chǎn)，因此R基因的利用不是一個(gè)長久之計(jì)。MLO基因是一種S感病基因，MLO基因?qū)χ参锏目共∵^程起負(fù)調(diào)控作用，野生型植株均能通過引起MLO基因功能喪失的突變獲得mlo基因抗性，由于mlo基因具有白粉菌持久而廣譜的抗性，因此這類基因在改善植物抗性方面具有廣泛的應(yīng)用前景和開發(fā)潛力，MLO家族基因的研究對植物抗病育種具有十分重要的意義。

1 MLO基因的生物信息學(xué)研究

1.1 亞細(xì)胞定位

1999年Devoto等推測大麥MLO蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，現(xiàn)在已有大量研究進(jìn)行了MLO蛋白的亞細(xì)胞定位，例如薔薇科(Rosaceae)植物的82個(gè)MLO蛋白中，大多數(shù)分布于質(zhì)膜中，其次分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和液泡中，還有少量分布于細(xì)胞核、線粒體和高爾基體中[9]；激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，葡萄(Vitispseudoreticulata)的5個(gè)MLO蛋白均定位在細(xì)胞膜上，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有少許的MLO蛋白[14]；谷子的12個(gè)MLO蛋白亞細(xì)胞定位分析表明，大部分MLO蛋白定位于細(xì)胞膜上，少數(shù)位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中[8]；石甜甜等研究證明，糜子(PanicummiliaceumL.)MLO蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜上[15]。Bhat等發(fā)現(xiàn)無白粉菌感染的mlo突變體中大多數(shù)MLO蛋白聚集在表皮細(xì)胞周圍，在內(nèi)膜及核膜上也檢測到了一些MLO蛋白，而在已接種白粉菌孢子的葉片上，真菌附著胞下呈現(xiàn)明顯的MLO蛋白聚集，這表明MLO蛋白在質(zhì)膜中重新分布，且這種聚集受脂筏的驅(qū)動(dòng)而不受肌動(dòng)蛋白的影響[16]。李凡在無白粉菌感染的野生型和突變體的表皮細(xì)胞中均沒有發(fā)現(xiàn)MLO蛋白的特異性標(biāo)記位點(diǎn)[17]，表明該蛋白在無白粉菌條件下的表達(dá)豐度較低，而在侵染后的表皮細(xì)胞內(nèi)的吸器外基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)特異性的蛋白標(biāo)記位點(diǎn)，說明MLO蛋白特異性地定位在吸器外基質(zhì)中，侵染后的現(xiàn)象與Bhat等的研究結(jié)果[16]相同，即在病原菌侵染后，MLO蛋白會(huì)重新分布并且聚集在附著胞下方的基質(zhì)中。另外在白粉病菌的吸器和菌絲等部位中均有膠體金的特異性標(biāo)記位點(diǎn)，推測MLO蛋白可能是病原菌成功侵染所必需的1種寄主因子或者是病原菌發(fā)育的1種必要組分[17-18]。

Devoto等對MLO蛋白的亞細(xì)胞定位研究表明，MLO蛋白中心疏水區(qū)域具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(seven-transmembrane domain，簡稱7TM)，其N端在細(xì)胞外，通常是與配體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，C端在細(xì)胞內(nèi)，存在與G蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域[19]。MLO蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位及序列多樣性類似于動(dòng)物和真菌7TM的G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupied receptors，簡稱GPCRs)[20-21]。在動(dòng)物中G蛋白偶聯(lián)受體GPCRs可以結(jié)合并激活異源三聚體G蛋白的活性，目前有研究從異源三聚體G蛋白是否參與MLO蛋白與白粉菌的互作過程來證明植物MLO蛋白是否具有G蛋白偶聯(lián)受體的功能，G蛋白由3個(gè)不同亞基(Gα、Gβ、Gγ)組成，調(diào)節(jié)植物許多基本過程，在植物中G蛋白復(fù)合物具有組成型活性，但其在該過程中的確切作用尚不清楚[22]。Kim等發(fā)現(xiàn)異源三聚體G蛋白不涉及MLO感病性或者突變型mlo介導(dǎo)的抗性活動(dòng)，指出MLO蛋白似乎獨(dú)立于異源三聚體G蛋白起作用[23]；研究發(fā)現(xiàn)Gβ和Gγ亞基在擬南芥mlo-2突變體中參與調(diào)節(jié)抗真菌的防御反應(yīng)，Gγ1亞基在該突變體中影響胼胝質(zhì)的積累，但總體上與MLO蛋白作為典型GPCRs的作用不一致[22]。

1.2 跨膜結(jié)構(gòu)域

過去一直認(rèn)為MLO蛋白具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域[11，24-25]，如今研究發(fā)現(xiàn)MLO蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)量存在差異，例如，已公布薔薇科植物的81個(gè)MLO蛋白中，僅有1個(gè)MLO蛋白為4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其他的為5～8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域；閆沛喆等發(fā)現(xiàn)，蕓薹屬(Brassica)的123個(gè)MLO蛋白中有71個(gè)擁有超過7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域[26]；原子吸收光譜結(jié)果表明，糜子MLO蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域[15]；陳玲等研究的85條MLO蛋白中，低等植物的跨膜結(jié)構(gòu)域最多，為5個(gè)，高等植物有6～8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域[27]；Chen等研究認(rèn)為，MLO蛋白數(shù)量在低等植物與高等植物間有所變化，不足5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的MLO蛋白通常存在于低等植物中，跨膜結(jié)構(gòu)域?yàn)?～8個(gè)的MLO蛋白通常存在于高等植物中[28-29]。陳玲等推測這種差異可能是由種間進(jìn)化或不同物種自身特性促成的[27]，由此看出MLO蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)量不是一定的，且僅部分MLO蛋白保持了該結(jié)構(gòu)域數(shù)量上的保守性[29]。

1.3 鈣調(diào)素結(jié)合區(qū)

鈣調(diào)素(calmdouiln，簡稱CaM)是一類多功能的鈣受體蛋白，廣泛存在于真核細(xì)胞中，以受體的形式參與動(dòng)植物細(xì)胞中多種酶和生理過程的調(diào)節(jié)。鈣調(diào)素特定結(jié)合區(qū)域(CaM binding domain，簡稱CaMBD)位于第7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域后10～15個(gè)氨基酸的位置[14，24，30]，該結(jié)構(gòu)在已鑒定的MLO蛋白家族中非常保守[23，31]。向貴生等對HvMLO、TaMLO1、TaMLO2和TaMLO3的CaMBD結(jié)構(gòu)域位置進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果與上述位置一致，但對薔薇科植物MLO蛋白該結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測時(shí)，發(fā)現(xiàn)CaMBD位于TM3與TM4之間，更接近TM4，與之前的結(jié)論是不相符的，由此推測CaMBD在物種的進(jìn)化過程中可能出現(xiàn)了某些變化導(dǎo)致其位置發(fā)生了改變[9]。目前，大量研究支持MLO蛋白與鈣調(diào)素之間存在相互作用，并且MLO蛋白的活性受鈣調(diào)素調(diào)節(jié)，例如，Bhat等發(fā)現(xiàn)在入侵位點(diǎn)MLO蛋白與鈣調(diào)素的增加與病原菌成功入侵宿主細(xì)胞發(fā)生的時(shí)間一致，證明鈣調(diào)素參與了MLO與病原菌的互作[16]；王晏青通過酵母雙雜交方法驗(yàn)證了VpMLO7蛋白與鈣調(diào)素互作[14]；有證據(jù)表明，鈣調(diào)素直接與受體結(jié)合，參與GPCRs介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)過程，Kim等認(rèn)為，MLO蛋白是一類新型鈣調(diào)素結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)植物的防御反應(yīng)和細(xì)胞死亡，其活性受鈣調(diào)素的調(diào)節(jié)[23，32-33]。另外CaMBD結(jié)構(gòu)域并不是存在于所有的MLO蛋白中，也不是具有抗病功能的MLO蛋白所特有的[34]。

1.4 信號(hào)肽的分析

信號(hào)肽是引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈，長度為5～30個(gè)氨基酸，位于分泌蛋白的N端，其可將進(jìn)行翻譯的核糖體附著于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，并引導(dǎo)蛋白質(zhì)輸送到細(xì)胞內(nèi)不同膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞內(nèi)[35-36]。至今關(guān)于MLO蛋白中信號(hào)肽的研究相對較少，且只有少部分MLO蛋白具有信號(hào)肽，目前對信號(hào)肽的報(bào)道有：覃碧等對木薯(ManihotesculentaCrantz)MLO蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，MeMLO8、MeMLO10和MeMLO18蛋白各有1個(gè)N端信號(hào)肽，擬南芥的3個(gè)蛋白AtMLO7、AtMLO8和AtMLO10也各有1個(gè)N端信號(hào)肽，這些信號(hào)肽均與第1次跨膜結(jié)構(gòu)存在重疊區(qū)[34，37]，巴西橡膠樹HbMLO9含有1個(gè)N端信號(hào)肽[38]，感病小麥(TriticumaestivumL.)品種豫麥13和抗病品種紅蚰麥的MLO蛋白中均有1個(gè)信號(hào)肽[39]，小麥TaMLO8蛋白具有1個(gè)信號(hào)肽[40]，糜子PmMLO蛋白也具有信號(hào)肽[15]等。不是所有的MLO蛋白都含有信號(hào)肽，大部分MLO蛋白不具有信號(hào)肽，例如谷子的12個(gè)SiMLO蛋白[8]，巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)HbMLO7[41]、HbMLO1-1[42]、HbMLO8[43]、HbMLO12蛋白[44]，蓖麻(RiciunscommunisL.)15個(gè)RcMLO蛋白[37]，小扁豆(LensculinarisMedik.)13個(gè)LcMLO蛋白[45]，玉米(ZeamaysL.)ZmMLO蛋白[21]，木薯19個(gè)MeMLO蛋白，擬南芥12個(gè)AtMLO蛋白及小麥3個(gè)TaMLO蛋白[34]等均沒有N端信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。

1.5 C末端的保守結(jié)構(gòu)域分析

雙子葉植物和單子葉植物的多重序列比對揭示出2個(gè)保守的肽結(jié)構(gòu)域(Ⅰ和Ⅱ)，第1個(gè)位于鈣調(diào)素結(jié)合結(jié)構(gòu)域下游15～20個(gè)殘基處，該保守結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)是存在保守的絲氨酸和蘇氨酸殘基，第2區(qū)域位于C末端的遠(yuǎn)端，是帶有共有序列D/E-F-S/T-F的肽結(jié)構(gòu)域，值得注意的是，該模式在C-末端的一級(jí)氨基酸序列內(nèi)的相對位置并未嚴(yán)格固定，該基序與上游(CaMBD和第一保守基序)和下游錨點(diǎn)(C-末端)的距離似乎是可變的[46]。目前，已從番茄(LycopersiconesculentumMill.)、擬南芥、大麥、水稻(Oryzasativa)、玉米、小麥、甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)、辣椒(CapsicumannuumL.)[28，46-48]及月季(RosachinensisJacq.)[49]等植物中克隆出MLO蛋白的2個(gè)保守基序。Feechan等提出MLO蛋白C端的這2個(gè)保守性結(jié)構(gòu)域可能與植株對白粉病的敏感性相關(guān)[30，46]，并提出第Ⅳ和第Ⅴ分支中的MLO蛋白C末端均存在這2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其他分支也可能存在這2個(gè)結(jié)構(gòu)域[46-47，49]，已公布的與白粉病互作的MLO基因均位于這2個(gè)分支中，但這2個(gè)分支上的MLO基因并不都是抗病基因[50]。向貴生等研究發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)分支上的基因并不都具有這2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，似乎這2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域只存在于這2個(gè)分支中具有抗病能力的基因中[9]。雖然大量研究發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域主要存在于有抗病能力的MLO基因中，但是這2個(gè)結(jié)構(gòu)域并不是抗病基因所特有的，其他分支也存在這2個(gè)結(jié)構(gòu)域，因此這2個(gè)結(jié)構(gòu)域在MLO基因與病原菌互作中的作用需要進(jìn)一步確定[47-48，51]。

1.6 MLO蛋白的保守性分析

Winterhagen等分析了17個(gè)葡萄和大麥MLO蛋白的氨基酸序列保守性，得出MLO蛋白中有30個(gè)保守的氨基酸殘基[52]。Elliott等分析了來自不同物種的38個(gè)MLO蛋白的氨基酸序列，指出MLO蛋白中同樣具有30個(gè)保守的氨基酸殘基[53]。劉寶玲等對谷子的12個(gè)MLO蛋白氨基酸保守位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，有1/2具有相同的30個(gè)氨基酸殘基，其余蛋白則突變或丟失了保守基序[8]。Zhou等對黃瓜14個(gè)MLO蛋白研究發(fā)現(xiàn)，只有6個(gè)保留了30個(gè)氨基酸，其他則為丟失和突變的氨基酸殘基[54]。Win等分析了南瓜的20個(gè)MLO蛋白，發(fā)現(xiàn)只有少部分保持了這30個(gè)氨基酸的完整性，其余都發(fā)生或多或少的氨基酸殘基的缺失或突變[55]。薔薇科的82條MLO蛋白中有15個(gè)保守基序，長度在15～50個(gè)氨基酸之間[9]；對黃瓜(CucumissativusL.)、甜瓜(CucumismeloL.)和西瓜(Citrulluslanatus)42個(gè)MLO蛋白的保守基序進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)42個(gè)MLO蛋白具有20個(gè)保守基序，長度在11～40個(gè)氨基酸之間[56]，這些保守基序可能與MLO蛋白的功能相關(guān)[57]。陳玲等在截選的MLO蛋白中發(fā)現(xiàn)，氨基酸變異位點(diǎn)占總氨基酸位點(diǎn)的84.14%，其中保守位點(diǎn)數(shù)僅占0.58%，體現(xiàn)出氨基酸序列具有較大的變異和較低的保守性[27]。變異區(qū)主要存在于N端、C端和胞外第1個(gè)環(huán)區(qū)域的序列[20，46]。

2 MLO基因功能分析

2.1 MLO家族基因的分類及其相關(guān)的功能

為了分析MLO蛋白成員間與其他物種MLO蛋白間的進(jìn)化關(guān)系，常常構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，覃碧等構(gòu)建了木薯和其他物種MLO蛋白間的系統(tǒng)進(jìn)化樹，將MLO蛋白家族成員分為6類(Ⅰ～Ⅵ)，并推測感病MLO基因似乎僅限于第Ⅳ和第Ⅴ類[34]；李明想構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹將單子葉和雙子葉植物MLO蛋白分為6個(gè)亞家族，發(fā)現(xiàn)第Ⅳ和第Ⅴ亞家族的成員參與白粉菌的感病過程[5]；大多數(shù)研究把MLO基因分為7個(gè)亞家族，發(fā)現(xiàn)能與白粉菌互作的MLO基因可能只存在于第Ⅴ和第Ⅳ分支上[58-59]，且雙子葉植物中抗白粉病基因位于第Ⅴ分支，單子葉植物的該類基因都位于第Ⅳ分支上[55，60]。值得注意的是這2個(gè)分支上的基因并不都是與抗性相關(guān)的基因[50]。

研究發(fā)現(xiàn)，第Ⅲ分支上的MLO蛋白可能是被子植物受精過程中配子體功能的1個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可調(diào)控花粉管的發(fā)育，影響植物的育性[61-62]，Davis等認(rèn)為，其他分支的MLO蛋白可能參與擬南芥的生殖生長[63]，EST(表達(dá)序列標(biāo)簽)表達(dá)分析表明，MLO蛋白廣泛地參與到黃瓜、甜瓜和西瓜器官的營養(yǎng)生長和生殖生長中[56]。研究發(fā)現(xiàn)，HbMLO9和HbMLO1-1蛋白參與橡膠樹的激素信號(hào)傳導(dǎo)以及逆境響應(yīng)過程[42，64]，蘋果MdMLO蛋白參與了機(jī)械損傷脅迫和外源水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)及1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)誘導(dǎo)脅迫過程[5]，水稻中4個(gè)和5個(gè)MLO蛋白分別與熱和冷脅迫的反應(yīng)相關(guān)[65]，TaMLO8蛋白參與了條銹菌和白粉菌的抗病反應(yīng)過程[40]，大麥MLO基因轉(zhuǎn)錄豐度隨著Bgh、稻瘟病菌、創(chuàng)傷、百草枯處理以及小麥白粉病產(chǎn)生的碳水化合物誘導(dǎo)物而增加。以上研究結(jié)果表明，MLO蛋白廣泛參與生物和非生物的脅迫反應(yīng)[66]，MLO家族成員之間存在功能互作的現(xiàn)象，導(dǎo)致不同的MLO蛋白共同響應(yīng)某種脅迫反應(yīng)[5]。目前，許多研究表明，MLO基因的表達(dá)模式在不同的組織中存在著差異，在不同的組織中表達(dá)量不同，由這些差異推測MLO基因還存在其他的功能[13，64]。至今，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的MLO家族基因，但是對其功能的研究尚且不足，研究得最多的是MLO家族成員使植物易感染白粉病，第Ⅳ和第Ⅴ分支的成員類群主要功能與白粉菌的防御有關(guān)，但對其他分支的成員主要功能尚且分析不足。

2.2 與白粉病相關(guān)的MLO基因

王晏青研究發(fā)現(xiàn)，MLO基因在白粉菌誘導(dǎo)的早期表達(dá)量急劇上升，證明了MLO基因是在侵染的早期協(xié)助病原菌入侵寄主植株的[14]。野生型MLO基因能調(diào)控表皮細(xì)胞內(nèi)乳突的形成，在表皮細(xì)胞壁真菌侵染位點(diǎn)抑制細(xì)胞壁過氧化氫暴發(fā)，并且抑制葉肉細(xì)胞次級(jí)氧化暴發(fā)和葉肉細(xì)胞死亡，利于病原菌的侵入，削弱了植物的防御能力，這類基因負(fù)調(diào)控植物防御能力以及細(xì)胞死亡[66-67]。MLO基因的缺失或移碼突變獲得等位基因mlo，導(dǎo)致MLO蛋白功能的喪失，解除了對白粉菌抗性和細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控，因此植物產(chǎn)生了對白粉病的持久、高效和廣譜抗性。有研究證明，MLO基因并不是完全抑制抗性，Peterh?nsel等發(fā)現(xiàn)野生型MLO植物可以阻止30%左右的真菌孢子穿透宿主表皮細(xì)胞壁，并能觀察到mlo抗性產(chǎn)生的系列防御反應(yīng)[68]；將額外的MLO基因?qū)胍吧蚆LO細(xì)胞后敏感性的增加表明，內(nèi)源純合野生型MLO基因抑制對白粉病的抗性反應(yīng)是不完整的[23]；Piffanelli等認(rèn)為，病原菌誘導(dǎo)MLO基因的組成型過表達(dá)與誘導(dǎo)之前的低表達(dá)相比可以解釋為野生型MLO對mlo抗性的不完全抑制[66]。

同一個(gè)基因也可具有多種功能，即基因功能具有多效性，例如抗病功能的基因可以同時(shí)響應(yīng)傷處理[5]，在某些物種中，MLO基因的敲除會(huì)導(dǎo)致多種表型，例如，大麥葉片自發(fā)的細(xì)胞死亡形成的壞死斑點(diǎn)和大麥谷粒產(chǎn)量的降低[7，16，68]；擬南芥生長緩慢、早衰并且無感染的葉片出現(xiàn)自發(fā)的胼胝質(zhì)沉積[3]；辣椒植株大小減少[48]。侵染白粉菌的轉(zhuǎn)基因pFGC1008-CmMLO甜瓜，具有白粉病抗性，同時(shí)植株出現(xiàn)卷須早，長勢較對照野生型植株弱，葉片大小、色澤沒有明顯區(qū)別[69]。但家養(yǎng)蘋果的MLO基因敲除并未觀察到這種或其他意外的多效表型[70]。小麥mlo突變體植株的高度、穗數(shù)及種子數(shù)較野生型沒有明顯的差異，也未出現(xiàn)較早葉片黃化的現(xiàn)象[71]。Ge等突變了埃塞俄比亞的1個(gè)大麥地方品種Eth295，發(fā)現(xiàn)其MLO突變不表現(xiàn)出自發(fā)壞死和光合組織丟失的多效性[72]。有研究者分析了影響這些多效表型形成的因素，Peterh?nsel等認(rèn)為，自發(fā)的細(xì)胞死亡由MLO和ROR調(diào)控[68]，可能與突變體葉片的加速衰老有關(guān)[66]。Consonni等研究發(fā)現(xiàn)，胼胝質(zhì)的自發(fā)沉積和衰老樣表型僅在Atmlo2pen2中被抑制，而不是在Atmlo2pen1或Atmlo2pen3中被抑制，這說明PEN2的突變補(bǔ)償了突變體中失去的表型[3]，而在大麥中mloror2突變體植株限制了這種多效性[68]。因此mlo突變體是否引起多效表型需要進(jìn)一步的研究，如果能夠產(chǎn)生這種多效表型，那么之前研究發(fā)現(xiàn)的PEN2或ROR2是否影響這種多效表型以及是否其他因素影響這種多效表型都需要進(jìn)一步的研究。

研究證明MLO基因存在功能冗余現(xiàn)象，導(dǎo)致突變的mlo基因?qū)Π追鄄〉目剐圆煌?，因此在培育抗病品種時(shí)，當(dāng)存在多個(gè)MLO基因拷貝同時(shí)調(diào)控白粉病時(shí)，植物要獲得高抗或者完全免疫白粉菌，需突變植株中起主要作用的MLO基因或者突變?nèi)空{(diào)控白粉病的MLO基因。Consonni等突變擬南芥的3個(gè)同源基因(AtMLO2、AtMLO6和AtMLO12)，通過形成單突變體、雙突變體和三突變體，證明了3個(gè)同源基因存在功能冗余，而AtMLO2在對白粉菌的防御過程中起主導(dǎo)作用[3，47]。Pessina等研究蘋果的MdMLO基因，敲除MdMLO19基因使白粉病嚴(yán)重程度降低75%，MdMLO11基因或MdMLO19基因與MdMLO11基因組合的敲除與單獨(dú)敲除MdMLO19基因相比不會(huì)導(dǎo)致任何減少或額外的易感性降低，證實(shí)了MdMLO19在植株中起主要的抗病作用[70]。Piffanelli等發(fā)現(xiàn)，大麥17個(gè)mlo的等位基因中，mlo-12和mlo-28基因僅有部分抗性，其余具有完全抗性[66]；Zheng等發(fā)現(xiàn)，同時(shí)沉默番茄SlMLO1及其同源物SlMLO5和S1MLO8賦予比與SlMLO1突變相關(guān)的更高水平的白粉病抗性，這證明與白粉菌互作的番茄MLO同源基因存在功能冗余[73]。這些研究結(jié)果均說明MLO基因存在功能冗余的現(xiàn)象。

3 MLO基因的抗病機(jī)制

3.1 表皮細(xì)胞中MLO基因的抗病調(diào)控

Blume等認(rèn)為，細(xì)胞質(zhì)中Ca2+的持續(xù)增加是激活細(xì)胞防御所必需的[74]。韓德俊等指出，表皮細(xì)胞外Ca2+的流入不僅是MLO基因表達(dá)所必需的，并且促進(jìn)了胼胝合成酶(1，3-β-glucan synthase)活性提高從而有助于乳突的形成[33]。研究發(fā)現(xiàn)，表皮細(xì)胞中Ca2+的增加也能促成抗性的抑制，前期病原菌激發(fā)抗病反應(yīng)，并引起Ca2+內(nèi)流，但MLO的表達(dá)受到抑制；抗性抑制發(fā)生在后期MLO蛋白量的恢復(fù)時(shí)期，當(dāng)胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+迅速增加時(shí)，CaM的含量也顯著增加，而MLO蛋白的活性在CaM的調(diào)節(jié)下升高，抗性顯著被抑制，植物表現(xiàn)為感病性[23，75]。邵伯飛發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)素能夠使細(xì)胞維持一個(gè)低濃度的Ca2+水平，并且抗病或感病品種的表皮細(xì)胞是否成功被病原菌侵染依賴于胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+是否保持較低的濃度?？偟膩碚f，Ca2+的增加既可引發(fā)抗性，同時(shí)也可以抑制抗性。在侵染后期，吸器外膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，鈣調(diào)素大量流入吸器外基質(zhì)中[75]。野生型MLO植株接種白粉菌后，其表皮細(xì)胞的CaM蛋白主要積累于對著吸器部位的細(xì)胞壁內(nèi)層，并認(rèn)為CaM蛋白與代謝水平有關(guān)，因此推測這個(gè)部位的代謝更為活躍，可能有助于吸器的發(fā)育[18，76]。另外對MLO蛋白的亞細(xì)胞定位后發(fā)現(xiàn)，在病原菌的不同器官中以及吸器外基質(zhì)中都有密集的特異性標(biāo)記位點(diǎn)，推測MLO蛋白及其衍生物是病原菌成功入侵和發(fā)育所必需的植物因子和寄主因子[17-18]?；谶@2種物質(zhì)都主要定位于吸器外基質(zhì)中，推測也可能在這個(gè)位置2種物質(zhì)間互作調(diào)控了植株的抗病性。在表皮細(xì)胞中重要的一個(gè)防御方式是乳突反應(yīng)(papilla response)，這是寄主抵抗白粉菌入侵時(shí)形成的一種典型的非?；头烙磻?yīng)。乳突抗性體現(xiàn)為抗初侵染，而抗初浸染的關(guān)鍵在于高頻率快速產(chǎn)生乳突[77]。

3.1.1MLO基因調(diào)控乳突反應(yīng)所需的滲透抗性通路MLO基因負(fù)調(diào)控植物的抗病反應(yīng)，這種負(fù)調(diào)控與2個(gè)獨(dú)立滲透抗性通路相關(guān)，第1個(gè)通路由突觸融合蛋白PEN1/ROR2介導(dǎo)，該蛋白在調(diào)控囊泡運(yùn)輸過程中發(fā)揮作用，并且MLO和ROR2蛋白之間存在直接的互作關(guān)系。糖基水解酶PEN2和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體PEN3參與了第2個(gè)通路[78]。研究發(fā)現(xiàn)，大麥ROR(ROR1和ROR2)基因是mlo基因產(chǎn)生對白粉菌的完全抗性所必需的[79-80]，Collins等在擬南芥的突變體中分離出3個(gè)基因，分別是PEN1、PEN2和PEN3，這3種基因影響非宿主抗性，有趣的是，這3種基因也被發(fā)現(xiàn)是基于Atmlo2的白粉病抗性所必需的[80]。

第1個(gè)通路由突觸融合蛋白PEN1/ROR2介導(dǎo)，大麥ROR2和擬南芥PEN1互為直系同源基因，具有分泌的基礎(chǔ)功能和專門的防御相關(guān)功能，為乳突形成過程中的極化分泌事件所必需。PEN1/ROR2基因能夠編碼含有SNARE結(jié)構(gòu)域的質(zhì)膜駐留的突觸融合蛋白[78]。靶膜蛋白HvSNAP34(syntaxin-interacting N-ethylmaleimide sensitive factor adaptor protein receptor proteins)是SNAP-25(synaptosome-associated protein，molecular mass 25 ku)的一種同源物，是mlo基因完全抗性所必需的[80]，當(dāng)其與突觸融合蛋白R(shí)OR2結(jié)合成二元SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)復(fù)合物后，參與mlo抗性完全表達(dá)所需的生物囊泡運(yùn)輸，因?yàn)镾NARE蛋白具有介導(dǎo)胞外防御中的胞吐和/或囊泡融合事件，而MLO蛋白可調(diào)控細(xì)胞外周的SNARE蛋白介導(dǎo)的囊泡過程從而影響mlo抗性[16]。在mlo突變型的擬南芥中，生化研究表明PEN1在植物體內(nèi)能與囊泡相關(guān)膜蛋白(VAMP)72亞家族成員相互作用，PEN1依賴性抵抗主要通過2個(gè)功能冗余VAMP721和VAMP722在體內(nèi)起作用，遺傳分析表明，VAMP722優(yōu)先與PEN1和SNAP33蛋白形成三元SNARE復(fù)合物，從而調(diào)控囊泡運(yùn)輸[81]，依賴PEN1的抗病機(jī)制可能是限制入侵后病原菌的生長[3]。PEN1可直接調(diào)控mlo突變體的抗性，其突變直接抑制mlo的抗性[82]。

第2個(gè)通路由糖基水解酶PEN2和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體PEN3所介導(dǎo)。mlo抗性依賴于PEN2和PEN3，據(jù)推測，PEN2(atypical myrosinase)和PEN3[ATP Binding Cassette(ABC) transporter]分別參與從硫代吲哚葡萄糖酸鹽衍生的有毒次生代謝物的合成和跨膜外流，以限制病原體的侵襲[83-84]，PEN2和PEN3不同于PEN1直接影響mlo基因的抗性發(fā)揮作用，而是這2個(gè)基因可能調(diào)控白粉菌進(jìn)入宿主細(xì)胞的途徑間接調(diào)控mlo抗性[3]。PEN2和PEN3參與限制更廣泛的病原體的生長，包括適應(yīng)性生物營養(yǎng)性白粉病、死體營養(yǎng)真菌和半營養(yǎng)卵菌[78]。

3.1.2 乳突的形成 Bushnell等認(rèn)為，植物侵染白粉菌后的第一可見反應(yīng)是宿主細(xì)胞質(zhì)聚集在病原菌附著胞的下方，并把這種細(xì)胞質(zhì)聚集形成的凝塊稱為細(xì)胞聚集體，該聚集體包括快速移動(dòng)的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器，具有與高代謝和合成活性區(qū)域相關(guān)的特征：豐富的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和多核糖體[85-86]。經(jīng)生化分析和組織化學(xué)的研究表明，細(xì)胞聚集體內(nèi)含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和多酚類物質(zhì)，木質(zhì)素和纖維素表現(xiàn)為負(fù)染色，認(rèn)為這2種物質(zhì)不存在于該聚集體中[87]，Russo等證明有胼胝質(zhì)的存在[88]。

大量研究表明，真菌釋放的化學(xué)誘導(dǎo)劑參與了細(xì)胞質(zhì)聚集體的啟動(dòng)[89-90]，而乳突的形成依賴細(xì)胞質(zhì)聚集體的存在，在細(xì)胞聚集體形成不久便開始了乳突反應(yīng)，并且主要產(chǎn)生在細(xì)胞質(zhì)聚集的中心[86，91-92]。Zeyen等認(rèn)為經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)聚集體作用的乳突的沉積過程分為4個(gè)步驟[91]。在細(xì)胞聚集體中檢測到類似乳突成分的囊泡物質(zhì)和水解酶類物質(zhì)，在乳突及其周圍事物宿主細(xì)胞質(zhì)的定位表明，乳突的形成是通過原生質(zhì)體中分泌的囊泡內(nèi)含物的積累，這部分內(nèi)含物至少有一部分來自溶酶體系統(tǒng)[93]。在乳突的形成過程中，由于在細(xì)胞質(zhì)聚集體中的與質(zhì)膜結(jié)合的膜囊泡中發(fā)現(xiàn)具有類似的電子不透明性的無定形材料，甚至可以看到囊泡中存在胼胝質(zhì)，在質(zhì)膜附近經(jīng)常觀察到與膜結(jié)合的囊泡，注意到囊泡膜-質(zhì)膜連續(xù)性，能夠看到囊泡膜與質(zhì)膜融合，推測這一過程使得囊泡釋放其內(nèi)含物使這些物質(zhì)嵌入乳突的表面，但隨著乳突的完全形成，細(xì)胞質(zhì)聚集體就會(huì)分散，使乳突呈現(xiàn)一個(gè)完整的視圖[86，91]，乳突的形成有助于阻止白粉菌吸器的形成從而阻止病原菌的侵入，證明乳突的形成有抵抗白粉菌的作用[92]。

3.1.3 乳突的成分分析 植物的表皮細(xì)胞壁迅速加厚從而形成堅(jiān)硬的乳突結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生抑菌成分，防止白粉菌的進(jìn)入，抵制白粉菌的初侵染，乳突是在病原菌入侵位點(diǎn)的細(xì)胞壁和原生質(zhì)膜間積累的半球狀體，并有物理和化學(xué)2種抗性，研究得最多的是物理抗性，即機(jī)械抵抗性和不通透性[16]。乳突特定的組成成分在不同植物中存在差異，通常發(fā)現(xiàn)一些類型的化合物，包括酚類、水解酶類、活性氧、細(xì)胞壁蛋白和細(xì)胞壁聚合物。在這些聚合物中，1，3-β-葡聚糖胼胝質(zhì)是最豐富和普遍存在的組分之一，但胼胝質(zhì)的作用仍不清楚[93-94]。Hückelhoven等認(rèn)為，乳突滲透阻力與H2O2在這些沉積物中的高度局部積累有關(guān)[95]；Aist等認(rèn)為，在mlo基因型的乳突中存在光吸收成分，其富含苯丙素和堿性染色成分，可能是mlo基因抗性機(jī)制的分子組分，但迄今為止還沒有發(fā)現(xiàn)和確定哪種物質(zhì)是乳突抗性的決定因素[96]。直到最近，還沒有一種直接化學(xué)分析乳頭的方法可用，主要是因?yàn)樗鼈兎浅Ｐ〔⑶依喂痰毓潭ㄔ谥参锛?xì)胞壁上[97]。

乳突在易感或抗白粉病的植物中都存在，只是在具有抗性的植物體中的乳突更大[70]。Kunoh等研究證明，乳突中存在Ca、P、K和Si等無機(jī)元素，并含有大量的低分子量元素，例如C、H、O和N等，這些無機(jī)元素是被選擇性地沉積到乳突中，而且隨宿主細(xì)胞的處理不同而變化。正常大小且?guī)缀醪痪哂袑Π追劬剐缘娜橥恢?，其主要成分是Ca和K 2種元素，相反，過大且具有白粉病抗性的乳突中，主要含有Ca和P元素，證明磷酸鈣與白粉菌的抗性有關(guān)，因此高水平的Ca和P暗示磷酸鹽抑制水平的存在，可使得過大乳突具有抗性[97]。

3.2 葉肉細(xì)胞中MLO基因的抗病調(diào)控

葉綠體對植株抗病性的調(diào)控有著重要作用。葉綠體的存在能夠防止細(xì)胞衰老和為病原菌提供營養(yǎng)。超微結(jié)構(gòu)研究結(jié)果表明，病原菌通過誘導(dǎo)植物感病品種葉肉細(xì)胞中新葉綠體的不斷產(chǎn)生來減緩葉肉細(xì)胞衰老，同時(shí)發(fā)現(xiàn)野生型MLO植株的葉肉細(xì)胞葉綠體中的2種光合作用標(biāo)志酶的含量始終保持較高的水平，強(qiáng)的光合作用為病原菌的發(fā)育提供營養(yǎng)[18，98]。由此推測葉肉細(xì)胞可能是通過營養(yǎng)供給的方式調(diào)控表皮細(xì)胞的抗病性，葉肉細(xì)胞為表皮細(xì)胞提供了直接的養(yǎng)分來源，病原菌吸收葉肉細(xì)胞輸送到表皮細(xì)胞中的營養(yǎng)就可以完成其無性循環(huán)，植物從而表現(xiàn)為感病性，這種推測與Koga等的觀點(diǎn)相吻合，即在大、小麥中與葉肉細(xì)胞相接的短型細(xì)胞具有較強(qiáng)的感病性，而位于維管束上方，不與葉肉細(xì)胞相接的長型表皮細(xì)胞則具有較強(qiáng)的抗病性[99]。大麥mlo突變體植株，最先壞死的是葉肉細(xì)胞，添加外源單糖有助于延緩葉肉細(xì)胞的死亡，因此病原菌導(dǎo)致的mlo突變體植株葉肉細(xì)胞的死亡可能與其養(yǎng)分被病原菌大量吸收有關(guān)[17]。由此推測，因?yàn)橐吧腿~肉細(xì)胞中有持續(xù)的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)病原菌發(fā)育的同時(shí)也維持了葉肉細(xì)胞的存活。趙淑芳等認(rèn)為，葉綠體的死亡可能為鈣調(diào)素所調(diào)控[76]，由于MLO蛋白沒有定位于葉綠體中，說明MLO蛋白不直接作用于葉肉細(xì)胞，而是通過間接的方式來調(diào)控防御機(jī)制的[17]，關(guān)于MLO蛋白如何調(diào)控葉肉細(xì)胞代謝從而影響防御機(jī)制尚且沒有足夠的研究來證明。

大量研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的死亡與細(xì)胞內(nèi)積累過量的H2O2有關(guān)[100-101]。Piffanelli等研究發(fā)現(xiàn)，mlo基因型葉肉細(xì)胞在H2O2激增后，葉肉細(xì)胞受到不可逆的損傷隨之發(fā)生細(xì)胞死亡，這2個(gè)反應(yīng)均受MLO和ROR的控制，但沒有證明這2種反應(yīng)是否有聯(lián)系，而野生型中MLO蛋白能夠抑制葉肉細(xì)胞的H2O2激增以及葉肉細(xì)胞的死亡[66]。Kumar等通過葉肉細(xì)胞H2O2大量存在與清除H2O2的對比試驗(yàn)推測，葉肉細(xì)胞的死亡是由于病原菌產(chǎn)生的毒素致使細(xì)胞對氧化過程控制的喪失結(jié)果，不是細(xì)胞程序性死亡，認(rèn)為H2O2的大量存在破壞了葉綠體從而引起葉斑病并導(dǎo)致壞死葉肉細(xì)胞的死亡，而MLO基因型植株能抑制H2O2的激增，也因此抑制了葉肉細(xì)胞的死亡[67]，閆亞杰等發(fā)現(xiàn)，活性氧積累得越多，細(xì)胞膜系統(tǒng)也損壞得更為嚴(yán)重[102]。

總的來說，葉肉細(xì)胞可能是通過營養(yǎng)供給的方式調(diào)控表皮細(xì)胞的抗病性，葉綠體能夠?yàn)榘追劬腿~肉細(xì)胞提供營養(yǎng)，從而維持白粉菌的發(fā)育和葉肉細(xì)胞的存活，MLO蛋白能夠抑制氧化暴發(fā)來抑制葉肉細(xì)胞的死亡，而氧化暴發(fā)又主要集中于葉綠體上[67]，那么MLO調(diào)控葉肉細(xì)胞的代謝和MLO調(diào)控氧化暴發(fā)是否存在關(guān)系？相關(guān)證據(jù)尚且不足，MLO蛋白是否還參與葉肉細(xì)胞中的其他反應(yīng)也無從論證。Piffanelli等認(rèn)為，自發(fā)的細(xì)胞死亡與突變體葉片的加速衰老有關(guān)，在衰老期間葉綠素含量下降[66]，可以猜想這種自發(fā)性葉肉細(xì)胞死亡是由葉肉細(xì)胞的營養(yǎng)轉(zhuǎn)移或葉綠素含量的下降從而導(dǎo)致葉肉細(xì)胞養(yǎng)分的丟失而造成的。

趙淑芳還提出了另一個(gè)類似于上述通過持續(xù)供給病原菌營養(yǎng)使得植物感病的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)野生型MLO植株伴胞中較高的CaM含量有利于病原菌的發(fā)育，而伴胞有助于植物組織中有機(jī)營養(yǎng)的運(yùn)輸，推測野生型MLO植株的有機(jī)物質(zhì)可以迅速進(jìn)行再分配，進(jìn)而有利于吸器吸收營養(yǎng)而發(fā)育，從而抑制了植物的抗性[18]。但其并沒有表明鈣調(diào)素與伴胞中這種代謝的再分配之間的相關(guān)性。

4 MLO基因的應(yīng)用和展望

白粉菌能夠寄生在大量單雙子葉植物中，危害植物的生長發(fā)育，傳統(tǒng)上人們主要通過噴灑農(nóng)藥防治白粉病，或培育具有R基因的抗病品種，但是長期以來白粉菌能夠產(chǎn)生對農(nóng)藥和R抗性的抵抗從而篩選出新的白粉菌生理小種，因此這2種抗病方式不適合應(yīng)用于植物長期的抗病中。野生型MLO植物能夠促進(jìn)白粉菌的入侵，但其突變體mlo植物具有對白粉菌持久而廣譜的抗性，利用MLO基因培育抗病品種具有重要的意義，大量研究表明，mlo基因具有多效性，因此在培育抗病品種的過程中，需注意克服MLO突變帶來的其他生理反應(yīng)，培育高抗或完全抗性的品種還需注意MLO基因存在功能冗余的現(xiàn)象，以培養(yǎng)出所需的表型。目前國內(nèi)外主要研究MLO基因及其所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征、功能和抗病機(jī)制，雖然發(fā)現(xiàn)MLO蛋白的抗病性與2個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域有關(guān)，但是還沒有發(fā)現(xiàn)或者確定MLO蛋白的抗病性為哪一區(qū)域所調(diào)控，不同分支的MLO基因存在不同的功能，至今第Ⅳ、Ⅴ分支上MLO基因研究得最多，其他分支的基因功能可做進(jìn)一步的研究，完善MLO基因的功能研究。目前，人們的主要研究方向?yàn)楸砥ぜ?xì)胞和葉肉細(xì)胞里的抗病性機(jī)制、MLO基因調(diào)控這2個(gè)細(xì)胞的抗病反應(yīng)，但是該基因如何調(diào)控這些抗病反應(yīng)過程還未知，還有乳突起抗病作用的物質(zhì)也有待確定，抗病機(jī)制的研究還不成熟。