姚宗澤， 李 陽， 郭宗娟， 張思親， 胡 曉， 趙自仙

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201； 2.杭州中軟安人網(wǎng)絡(luò)通信股份有限公司，浙江杭州 310012；3.普洱市瀾滄縣東河鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，云南普洱 665628)

玉米作為世界三大糧食作物之一，集飼用、能源以及食用于一體。因此保障玉米生產(chǎn)穩(wěn)定發(fā)展、促進(jìn)玉米產(chǎn)量穩(wěn)步提升，對(duì)我國的社會(huì)穩(wěn)定和人民生活水平的維持在很大程度上都有著一定的促進(jìn)作用。

種子純度是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)[1]，種子純度一直以來都是世界各國關(guān)注的主要問題，種子純度的鑒定在種子生產(chǎn)、銷售以及大田種植過程中至關(guān)重要。種子純度鑒定技術(shù)涉及的知識(shí)面較廣、技術(shù)性強(qiáng)、新問題多。常用方法有種子形態(tài)鑒定、幼苗鑒定、物理鑒定、化學(xué)鑒定、田間小區(qū)種植鑒定等[2]。自1974年Grodzicker等發(fā)明了限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，簡(jiǎn)稱RFLP)技術(shù)[3]以來，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，人們對(duì)分子標(biāo)記的認(rèn)識(shí)也在不斷地深入，目前已有很多種分子標(biāo)記為人們所知，其中一部分已被運(yùn)用于種子純度鑒定中，如RFLP技術(shù)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphism DNA，簡(jiǎn)稱RAPD)標(biāo)記、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats，簡(jiǎn)稱SSR)標(biāo)記、插入缺失標(biāo)記(insertion-deletion，簡(jiǎn)稱InDel)、基于SNP(單核苷酸多態(tài)性)的分子標(biāo)記等[4]，傳統(tǒng)的農(nóng)作物純度鑒定方法正在受到快速發(fā)展中的分子標(biāo)記技術(shù)的挑戰(zhàn)。本研究介紹了田間小區(qū)種植鑒定和InDel標(biāo)記在品種純度鑒定中的應(yīng)用。田間小區(qū)種植鑒定是將種子樣品按照要求種植到田間(大田或溫室)，根據(jù)幼苗和植株的形態(tài)鑒定純度的方法[5]，它以某一品種典型性狀表現(xiàn)最為明顯的時(shí)期作為最佳判定時(shí)期，在這段時(shí)間內(nèi)以該品種的形態(tài)特點(diǎn)和農(nóng)藝性狀作為判定種子真?zhèn)蔚臉?biāo)準(zhǔn)。田間小區(qū)種植鑒定能夠觀測(cè)整個(gè)植株的生長(zhǎng)發(fā)育過程，觀測(cè)員可以隨時(shí)觀測(cè)小區(qū)內(nèi)所有植株的生長(zhǎng)情況，并將它們的農(nóng)藝性狀記錄下來，鑒定結(jié)果比較準(zhǔn)確、可靠，適用于對(duì)雜交種的判定，能成為種子貿(mào)易中仲裁鑒定和賠償損失的依據(jù)，是目前植物品種真實(shí)性檢驗(yàn)和純度鑒定中比較有效的手段。但其缺點(diǎn)也比較明顯，由于該方法主要根據(jù)品種的表型差異進(jìn)行判定，對(duì)工作人員的專業(yè)技術(shù)要求高，在不同環(huán)境下種植以及反季種植會(huì)造成品種特征特性發(fā)生變化，受環(huán)境影響較大，且鑒定周期長(zhǎng)、成本高、易受季節(jié)限制、用地多、工作量大，影響了種子質(zhì)量檢測(cè)、監(jiān)督的速度和質(zhì)量[6]。InDel是一種新型分子標(biāo)記，它指的是2個(gè)親本之間全基因組中所存在的差異，這種差異具體表現(xiàn)為一個(gè)親本相較于另一個(gè)親本而言，全基因組中因核苷酸的插入或缺失而存在一定的區(qū)別。在實(shí)際操作中，依據(jù)插入缺失位點(diǎn)兩端的保守序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增、電泳等操作，可以對(duì)基因組間存在這種差異的樣品進(jìn)行區(qū)分。與以往的分子標(biāo)記相比，在不同品種玉米基因組分型的應(yīng)用中，InDel標(biāo)記有著更多的優(yōu)勢(shì)，Vroh等研究發(fā)現(xiàn)，在玉米全基因組中平均每 309 bp 就會(huì)有1個(gè)InDel標(biāo)記的存在，數(shù)量遠(yuǎn)多于植物基因組中的SSR標(biāo)記[7-8]。胡俏強(qiáng)等利用篩選出來的5對(duì)InDel引物成功完成了對(duì)4個(gè)糯玉米雜交種純度的鑒定工作，且鑒定結(jié)果與田間小區(qū)種植鑒定結(jié)果呈極顯著正相關(guān)，故InDel標(biāo)記在作物品種純度鑒定中具有一定的可靠性[9]。張錄霞等利用2對(duì)InDel標(biāo)記也完成了對(duì)2個(gè)新疆主栽番茄雜交種純度的快速鑒定工作[10]。

本研究以優(yōu)良雜交玉米品種家佳榮2號(hào)為供試材料，先后利用田間小區(qū)種植鑒定和InDel分子標(biāo)記來完成對(duì)同一批家佳榮2號(hào)種子純度的鑒定工作，構(gòu)建家佳榮2號(hào)種子純度鑒定技術(shù)體系，為規(guī)?；N子純度鑒定奠定基礎(chǔ)，有利于種子質(zhì)量控制和該品種的大面積推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)材料包括雜交種家佳榮2號(hào)及其父母本、JR02雜交組合，共4份。JR02是玉米新組合，其母本與家佳榮2號(hào)的母本互為姊妹系，可用于人為摻假鑒定，以驗(yàn)證篩選出引物的可靠性。本試驗(yàn)用的種子均由隨機(jī)抽樣所得。本試驗(yàn)中的18對(duì)InDel引物[11](表1)是由前人從玉米模式生物B73全基因組中篩選出來的多態(tài)性較高的引物。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

表1 InDel引物序列和編號(hào)

1.2 田間小區(qū)種植鑒定

田間小區(qū)種植試驗(yàn)在尋甸縣大河橋云南農(nóng)業(yè)大學(xué)育種基地(地理位置25°31′07″E，103°16′41″N，海拔1 864 m)進(jìn)行。2015年5月21日，將家佳榮2號(hào)雜交種子播種到準(zhǔn)備好的肥力一致的田塊中，試驗(yàn)地塊肥力中等，前作無玉米種植。小區(qū)行長(zhǎng)3 m，行距0.75 m，穴播，穴距0.42 m。根據(jù)種子檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)程和國家種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[13]，玉米大田用種的種子純度要求達(dá)到96.0%以上，種植株數(shù)為400/(100-96)，即100株以上。試驗(yàn)播種方式為單粒點(diǎn)播，綜合考慮試驗(yàn)要求及實(shí)際成本，共播150粒家佳榮2號(hào)雜交種子。30 d后記錄出苗株數(shù)，逐株編號(hào)掛牌并剪取葉片，單獨(dú)保存，作為室內(nèi)DNA提取材料。每穴的栽培和管理措施均一致，管理同一般大田生產(chǎn)，玉米生長(zhǎng)前期不定苗、不間苗，但及時(shí)防蟲防病。在田間于玉米開花期和成熟期及時(shí)調(diào)查玉米生育特性及各個(gè)單株的農(nóng)藝性狀。

1.3 InDel分子標(biāo)記鑒定

1.3.1 材料DNA的提取 將4份材料在室內(nèi)進(jìn)行沙培，到 3～5葉期，剪取葉片，采用Saghai-Maroof等于1984年提出的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法[12]提取DNA，單獨(dú)提取田間采集的家佳榮2號(hào)樣品總DNA，用于室內(nèi)雜交種子純度鑒定，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的DNA。

1.3.2 InDel的PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系見表2，反應(yīng)程序設(shè)置見表3。InDel分子標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系配置的整個(gè)操作過程均在冰上完成，體系配好后，加入25 μL礦物油，以防止PCR擴(kuò)增過程中反應(yīng)液受熱蒸發(fā)。

表2 PCR反應(yīng)體系

表3 PCR擴(kuò)增程序

1.3.3 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 制膠程序如下：先清洗玻璃板并組裝電泳槽，凝膠的配制按表4的配方進(jìn)行，然后用灌膠瓶將膠注入2片玻璃板之間，再把梳子緩慢插入。

表4 8%非變性聚丙烯酰胺膠配方

電泳：待凝膠完全凝固后，將1×TBE倒入膠槽中，中間倒入量需淹沒短玻璃板，兩邊倒入量為槽高度的1/3即可，緩慢平穩(wěn)地拔出梳子。將電泳槽接上電源，電壓設(shè)為220 V，電流為180 mA，功率為50 W，進(jìn)行預(yù)電泳10 min。預(yù)電泳結(jié)束后，將儀器暫停。點(diǎn)樣量按2 μL marker、4 μL樣品進(jìn)行設(shè)置。點(diǎn)樣完成后啟動(dòng)儀器，繼續(xù)電泳1.0～1.5 h。

銀染：電泳完成后，先將膠在銀染液中染色 10 min，再移至顯影液中顯影，待完全顯影，用去離子水對(duì)膠進(jìn)行數(shù)次清洗，再將膠放于光照儀上進(jìn)行拍照記錄。

1.4 指紋圖譜的構(gòu)建及數(shù)字化處理

從膠圖中挑選出雙親間具有多態(tài)性的引物進(jìn)行指紋圖譜的構(gòu)建，然后根據(jù)同一引物與母本、父本、雜交種結(jié)合擴(kuò)增所得DNA片段在膠圖中同一位置的表型來進(jìn)行記錄。對(duì)于同一遷移位置，若有條帶則記為1，無條帶則記為0，按照此規(guī)則來對(duì)所得指紋圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理。然后按照公式P=1/2n(n為用于構(gòu)建指紋圖譜的引物共檢測(cè)出等位基因的數(shù)目)來計(jì)算所構(gòu)建的指紋圖譜無法區(qū)分家佳榮2號(hào)與其他品種的概率[13]。

1.5 種子純度鑒定

根據(jù)雙親條帶互補(bǔ)且均不同于雜交種的規(guī)則，從構(gòu)建的指紋圖譜中篩出合適的引物來對(duì)供試樣品進(jìn)行純度鑒定。然后依據(jù)InDel分子標(biāo)記的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，按照樣品電泳條帶是否與雙親的電泳條帶互補(bǔ)來判定該樣品的類型。當(dāng)樣品電泳條帶與某一親本的電泳條帶位置一致時(shí)，判定該樣品為此親本的自交系；當(dāng)樣品的電泳條帶位置既不同于某一親本的位置，又不同于雙親互補(bǔ)的位置時(shí)，判定該樣品為異品種；當(dāng)雙親條帶所處位置均有樣品條帶與之對(duì)應(yīng)時(shí)，則判定該樣品為雙親的雜交種。

品種純度的百分率按下面公式進(jìn)行計(jì)算：

將計(jì)算所得結(jié)果與農(nóng)作物種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的玉米指標(biāo)進(jìn)行比對(duì)，本試驗(yàn)所用材料為玉米單交種家佳榮2號(hào)。容許差距按以下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：p表示標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定純度，%；q表示理論計(jì)算的最大允許的雜株數(shù)，q=100%-p，%；N表示種植株數(shù)或樣品數(shù)量。

所以應(yīng)將計(jì)算所得品種純度的數(shù)值與“96%-T=93.3%”進(jìn)行對(duì)比。

1.6 摻雜驗(yàn)證InDel方法的可靠性

提取雜交種JR02的DNA，然后隨機(jī)選用2對(duì)篩選出的適用于家佳榮2號(hào)純度鑒定的InDel引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，再進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，與雜交種家佳榮2號(hào)及其親本產(chǎn)物進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間小區(qū)種植鑒定結(jié)果

玉米家佳榮2號(hào)于2015年7月23日抽雄，7月25日抽絲，第1次鑒定時(shí)間為7月26日，共鑒定了137株，異形株數(shù)為0。第2次于2015年10月3日鑒定，根據(jù)穗形、籽粒顏色、粒刺的有無、長(zhǎng)短、粒型并結(jié)合果穗大小等農(nóng)藝性狀進(jìn)行鑒定，共鑒定137株，異形株有3株，純度為(137-3)/137×100%=97.8%，鑒定結(jié)果以成熟期鑒定結(jié)果即第2次鑒定結(jié)果為準(zhǔn)。

2.2 玉米雜交種家佳榮2號(hào)及其親本的DNA提取檢測(cè)結(jié)果

瓊脂糖電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，采用Saghai-Maroof等于1984年提出的CTAB法[12]所提取的DNA都完整，可繼續(xù)使用。

2.3 InDel引物分析

本試驗(yàn)利用18對(duì)InDel引物對(duì)雜交玉米品種家佳榮2號(hào)及其親本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，18對(duì)引物全部擴(kuò)增出了清晰、穩(wěn)定的條帶。在這18對(duì)InDel引物中，有11對(duì)引物檢測(cè)結(jié)果顯示親本之間有著較好的多態(tài)性，其余7對(duì)引物(P1、P6、P8、P10、P11、P12、P18)檢測(cè)的位點(diǎn)不存在多態(tài)性，多態(tài)性檢測(cè)率為61%。再將雜交種家佳榮2號(hào)的電泳圖譜與雙親進(jìn)行對(duì)比，得到偏父本型引物1對(duì)(P3)，沒有偏母本型引物(圖1)。

2.4 InDel引物指紋圖譜的構(gòu)建及數(shù)字化處理

選取雙親間具有多態(tài)性的11對(duì)InDel引物構(gòu)建家佳榮2號(hào)的指紋圖譜，11對(duì)引物共檢測(cè)出了40個(gè)等位基因，然后將11對(duì)InDel引物的擴(kuò)增片段進(jìn)行數(shù)字化處理，如表5所示，40個(gè)數(shù)字組成了家佳榮2號(hào)的指紋圖譜，即在理論上，若想培育出另一個(gè)玉米新品種，其在這40個(gè)等位基因的數(shù)字序號(hào)與家佳榮2號(hào)一致的概率為9.09×10-13。

2.5 家佳榮2號(hào)純度鑒定引物篩選

參照?qǐng)D1，按照能夠清晰穩(wěn)定區(qū)分家佳榮2號(hào)及其父母本的原則，從18對(duì)InDel引物中篩選出適用于家佳榮2號(hào)純度鑒定的引物(表6)。

2.6 InDel分子標(biāo)記鑒定結(jié)果

從10對(duì)InDel引物中隨機(jī)選取2對(duì)引物對(duì)同一批樣品的137個(gè)供試樣品進(jìn)行純度鑒定。如表7所示，引物P9檢測(cè)出了4株雜株，雜株樣品編號(hào)分別為64、85、131、138，檢測(cè)純度為97.1%；引物P13檢測(cè)出了6株雜株，雜株樣品編號(hào)分別為64、67、85、131、136、138，檢測(cè)純度為95.6%。綜合2對(duì)引物的檢測(cè)結(jié)果，137個(gè)供試樣品中不是家佳榮2號(hào)的共有6個(gè)，供試樣品純度為95.6%。2對(duì)InDel引物均成功把雜株鑒定出來，說明InDel分子標(biāo)記的鑒定結(jié)果可靠。

2.7 摻雜驗(yàn)證

由圖2可得，選用的2對(duì)InDel引物中，P9清晰穩(wěn)定地區(qū)分出了摻雜品種與家佳榮2號(hào)及其親本，而P13則并未能鑒定出JR02。

3 討論與結(jié)論

品種純度作為種子重要的質(zhì)量指標(biāo)，檢測(cè)方法有很多種。其中田間小區(qū)種植鑒定法一直是檢測(cè)品種是否保持特有農(nóng)藝性狀或符合種子指令標(biāo)準(zhǔn)要求的重要手段之一[14]，但田間小區(qū)種植鑒定對(duì)人力物力需求較多，周期較長(zhǎng)，對(duì)自然環(huán)境以及檢驗(yàn)員均有著較高要求[15]。室內(nèi)分子標(biāo)記技術(shù)因具備操作簡(jiǎn)便、周期短、環(huán)境因素要求低、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)而深受國內(nèi)外學(xué)者的重視[16]。近10年以來，隨著人們對(duì)分子標(biāo)記技術(shù)的認(rèn)知以及運(yùn)用不斷深入，國家也頒布了一些根據(jù)不同類型分子標(biāo)記的原理而進(jìn)行品種鑒定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[17]，本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)同一批供試樣品的鑒定結(jié)果進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證。本試驗(yàn)先通過田間小區(qū)種植鑒定對(duì)供試材料進(jìn)行品種純度的鑒定，然后在室內(nèi)進(jìn)行DNA提取，再用InDel分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)供試樣品的純度進(jìn)行反復(fù)的驗(yàn)證。其檢測(cè)結(jié)果與田間小區(qū)種植鑒定的檢測(cè)結(jié)果有一定的差異，田間小區(qū)種植鑒定的檢測(cè)結(jié)果高于InDel分子標(biāo)記技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果。有可能是由于個(gè)別雜株在形態(tài)特征和生育特性上的差異在田間不易被辨別，被錯(cuò)誤地判定為真實(shí)品種所所造成的。

表5 基于InDel分子標(biāo)記的家佳榮2號(hào)及其親本數(shù)字化指紋圖譜

表6 適用于家佳榮2號(hào)純度鑒定的引物

表7 InDel分子標(biāo)記鑒定家佳榮2號(hào)品種純度結(jié)果

本試驗(yàn)采用田間小區(qū)種植鑒定和InDel分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)玉米雜交種家佳榮2號(hào)的同一批供試樣品種子純度進(jìn)行反復(fù)檢驗(yàn)和驗(yàn)證， 同時(shí)構(gòu)建了家佳榮2號(hào)的指紋圖譜，并從中篩選出適合家佳榮2號(hào)純度鑒定的引物。主要研究結(jié)果：(1)利用田間小區(qū)種植鑒定法，家佳榮2號(hào)的種子純度為97.8%；InDel分子標(biāo)記技術(shù)方法鑒定結(jié)果為95.6%，InDel的結(jié)果略低于田間小區(qū)種植鑒定結(jié)果。(2)18對(duì)InDel引物中能與家佳榮2號(hào)雙親基因組穩(wěn)定結(jié)合且具有多態(tài)性的引物共有11對(duì)，多態(tài)性檢測(cè)率為61%。通過檢測(cè)，其中10對(duì)InDel引物都能與家佳榮2號(hào)穩(wěn)定結(jié)合，可用于鑒定家佳榮2號(hào)的種子純度。(3)在10對(duì)引物中隨機(jī)選取2對(duì)引物(P9、P13)，以JR02為摻雜品種，有1對(duì)引物(P9)能從家佳榮2號(hào)中區(qū)分出JR02，但P13無法區(qū)分家佳榮2號(hào)和JR02。(4)18對(duì)InDel引物從前人以玉米模式生物B73全基因組序列信息為背景開發(fā)出來的引物中篩選而來，表明利用B73全基因組序列信息進(jìn)行玉米分子標(biāo)記探索具有較高的可信度。