俞 杰，秦 磊，許 可，馮旭東，李 春

(北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，北京100081)

氧化還原反應(yīng)(redox reaction)是一類氧化劑和還原劑之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移的反應(yīng)，貫穿細(xì)胞的整個(gè)生長代謝過程。氧化還原狀態(tài)是表征細(xì)胞生理狀態(tài)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)維持在一個(gè)平衡狀態(tài)，隨著外界條件的變化或細(xì)胞自身的代謝失衡，細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)大量累積，造成DNA、蛋白質(zhì)損傷以及脂質(zhì)過氧化等，影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，嚴(yán)重情況下會(huì)造成細(xì)胞凋亡[1]。

氧化還原平衡的維持關(guān)系著細(xì)胞的生長與代謝，氧化還原狀態(tài)的實(shí)時(shí)監(jiān)測以及調(diào)控對于研究細(xì)胞的生長和高效生物轉(zhuǎn)化具有重要意義。由于復(fù)雜的氧化還原系統(tǒng)與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的檢測以及調(diào)控面臨著巨大的挑戰(zhàn)。熒光探針信號(hào)穩(wěn)定、檢測設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)成為實(shí)時(shí)檢測細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的有力工具。本文中，筆者闡述氧化還原狀態(tài)與細(xì)胞代謝的關(guān)聯(lián)，以熒光探針為主，介紹了檢測細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的方法，并對調(diào)控細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的常用方法及其在細(xì)胞工廠高效生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)，展望了氧化還原狀態(tài)檢測及調(diào)控的發(fā)展趨勢。

1 細(xì)胞的氧化還原代謝物

細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)十分復(fù)雜，參與的反應(yīng)物質(zhì)種類繁多，氧化還原代謝物按照其反應(yīng)性質(zhì)可分為以下3種：以活性氧為代表的氧化劑類、以谷胱甘肽為代表的抗氧化劑類以及以NAD(P)H為代表的輔酶類。

1.1 活性氧

圖1 活性氧的產(chǎn)生及轉(zhuǎn)化過程Fig.1 Generation and conversion of reactive oxygen species

1.2 谷胱甘肽

谷胱甘肽是一種小分子三肽，由半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)和甘氨酸(Gly)組成，其中Cys的巰基(—SH)基團(tuán)是谷胱甘肽的活性基團(tuán)。谷胱甘肽的生物合成過程如圖2所示，先通過由gsh1編碼的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gsh1)催化在細(xì)胞質(zhì)中合成γ-谷氨酰半胱氨酸，再由gsh2編碼的谷胱甘肽合成酶(Gsh2)催化γ-谷氨酰半胱氨酸與Gly合成谷胱甘肽。雖然谷胱甘肽在細(xì)胞質(zhì)中合成，但是它可以游走于線粒體、細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等各種細(xì)胞器。谷胱甘肽在細(xì)胞內(nèi)以還原形式(GSH)和氧化形式(GSSG)兩種形式在，GSH被活性氧氧化形成GSSG，GSSG可以通過glr1編碼的谷胱甘肽還原酶，用NADPH作為還原力量供體被還原為GSH(圖2)[5]。細(xì)胞內(nèi)的GSH濃度較高(1～13 mmol/L)，通常是GSSG的30～100倍。GSH與GSSG之間的平衡，通?？梢宰鳛榧?xì)胞氧化還原狀態(tài)的表征方式。谷胱甘肽的氧化還原電位(GSH potential，EGSH/GSSG)是量化表征谷胱甘肽氧化還原狀態(tài)的方式，通常由GSH與GSSG的比例經(jīng)能斯特方程(EGSH/GSSG=-264+30lg[(c(GSSG)/c(GSH))2])計(jì)算得出，一定程度上反映細(xì)胞的抗氧化性能[6]。正常狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)的EGSH/GSSG較低，中點(diǎn)電位在-240 mV左右。由于GSH在不同細(xì)胞器之間的分布存在差異，因此各個(gè)細(xì)胞器之間的EGSH/GSSG也各有不同，線粒體中EGSH/GSSG的中點(diǎn)電位大約為-280～-250 mV，細(xì)胞質(zhì)的中點(diǎn)電位為-290 mV，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)由于要維持氧化狀態(tài)，中點(diǎn)電位約為-185 mV[7]。由于谷胱甘肽重要的抗氧化作用，常用作細(xì)胞工廠抗氧化改造的靶點(diǎn)。

圖2 谷胱甘肽的合成及氧化還原Fig.2 Synthesis and redox of glutathione

1.3 NAD(P)+和NAD(P)H的濃度和比例

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是參與細(xì)胞內(nèi)多種反應(yīng)的關(guān)鍵輔酶，主要作為一些氧化還原酶的電子載體發(fā)生作用，還能夠經(jīng)NADH激酶(NADH kinase)催化合成另一種重要的輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)[8]。NADPH參與許多氧化還原過程的調(diào)節(jié)，包括兩大抗氧化系統(tǒng)的反應(yīng)等。

GSSG轉(zhuǎn)化為GSH時(shí)需要NADPH提供還原力，硫氧還蛋白也需要NADPH作為還原劑維持其氧化還原平衡[9]。但NADPH氧化酶也可以催化NADPH氧化的同時(shí)產(chǎn)生ROS[10]。因此，NADP+/NADPH是重要的氧化還原信號(hào)。

NADH和NADPH對于ROS的產(chǎn)生和清除是至關(guān)重要的。NADH作為生物氫的載體和電子供體，除了在線粒體內(nèi)膜上通過氧化磷酸化過程，轉(zhuǎn)移能量供給ATP合成以外，有可能將電子轉(zhuǎn)移至O2產(chǎn)生ROS；NADPH在維持抗氧化防御方面起主要作用，但在某些組織中也可作為自由基生成反應(yīng)的輔助因子。兩種輔酶都充當(dāng)“電子載體”，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的氧化還原反應(yīng)之間傳遞還原力。它們都可以通過接收電子，產(chǎn)生還原形式的NADH或NADPH。兩者之間的作用錯(cuò)綜復(fù)雜(圖3)，都是重要的氧化還原狀態(tài)的表征信號(hào)。

圖3 NADH及NADPH的氧化還原代謝Fig.3 Redox metabolisms of NADH and NADPH

1.4 氧化還原狀態(tài)與細(xì)胞代謝

氧化還原狀態(tài)與細(xì)胞的能量代謝、生長代謝以及合成與轉(zhuǎn)化息息相關(guān)。其中，活性氧能參與細(xì)胞的免疫應(yīng)答，在病原體侵入細(xì)胞時(shí)，活性氧能夠作為第二信使調(diào)控免疫相關(guān)基因的表達(dá)，并啟動(dòng)某些基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而啟動(dòng)相應(yīng)的凋亡程序[3]。此外，活性氧還與細(xì)胞壁中糖蛋白交聯(lián)過程有關(guān)，有助于識(shí)別病原體，啟動(dòng)相應(yīng)的防御程序[11]。雖然活性氧是細(xì)胞免疫反應(yīng)的信號(hào)分子，但是活性氧的過度累積會(huì)危及生物體的結(jié)構(gòu)和功能。例如攻擊蛋白質(zhì)的氨基酸殘基形成分子內(nèi)或分子間非極性作用，進(jìn)而影響其構(gòu)象和功能[12]。H2O2能夠發(fā)生跨膜作用，與相應(yīng)的大分子反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、DNA雙鏈的斷裂和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的損傷等[13]。

谷胱甘肽除了作為抗氧化劑清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧外，其氧化形式與還原形式之間的比例決定了一些蛋白質(zhì)中半胱氨酸的狀態(tài)，進(jìn)而影響了這些蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，GSH的大量消耗和蛋白質(zhì)的谷胱甘肽化修飾是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞的衰老及凋亡中作為細(xì)胞標(biāo)志物[14]。

NAD+/NADH的變化影響著眾多的生理過程。例如，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中NAD+/NADH比例，能調(diào)節(jié)糖酵解反應(yīng)的速率。在線粒體中，作為還原力的主要供體，NADH可以經(jīng)呼吸鏈氧化為細(xì)胞提供能量。此外，NAD+/NADH還影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)和一些大分子生物合成等。NADP+/NADPH主要在磷酸戊糖途徑(PPP途徑)中起作用，還與一些信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)以及二氫葉酸、脂肪酸等生物大分子的合成有關(guān)[15]。

對細(xì)胞工廠的氧化還原狀態(tài)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控不僅要了解細(xì)胞的氧化還原代謝過程，而且對于氧化還原狀態(tài)的監(jiān)測方法也有著較高的要求。研究者嘗試使用電子自旋共振、拉曼光譜、免疫吸附及核磁共振等方法檢測細(xì)胞內(nèi)的活性氧[16-18]，使用酶聯(lián)免疫、液相色譜或電化學(xué)方法等測定細(xì)胞的谷胱甘肽氧化還原電位[19-21]；使用色譜法、電化學(xué)法、毛細(xì)管電泳法以及代謝物間接指示法來檢測NADP+/NADPH等[22-25]。

這些方法能夠較為準(zhǔn)確地反映相關(guān)信號(hào)，但是都存在固有的局限性，即破壞了細(xì)胞或生物體的完整性，無法在活細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)反映氧化還原狀態(tài)。熒光探針法由于其信號(hào)穩(wěn)定、設(shè)備簡單且能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)原位檢測等優(yōu)點(diǎn)受到了青睞。

2 檢測氧化還原狀態(tài)的熒光探針

氧化還原反應(yīng)代謝物中，NAD(P)H存在微弱的自發(fā)熒光，可以用于評估線粒體的狀態(tài)，但在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)濃度較低，無法相互區(qū)分且波長較短，極大可能干擾細(xì)胞的氧化還原代謝，利用熒光壽命成像技術(shù)(FLIM)可以區(qū)分結(jié)合形式的NADH和NADPH[26],但是該方式對精密儀器和復(fù)雜計(jì)算的要求較高,很難廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究。因此，化學(xué)熒光探針和遺傳編碼的熒光探針更適用于基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)室研究。

2.1 化學(xué)熒光探針

檢測氧化還原狀態(tài)的化學(xué)熒光探針大多具有能與信號(hào)分子結(jié)合的識(shí)別基團(tuán)以及發(fā)出熒光信號(hào)的基團(tuán)，發(fā)出熒光的強(qiáng)度反映氧化還原狀態(tài)。化學(xué)熒光探針種類較多，目前用于活細(xì)胞ROS檢測的最常用探針是二氯熒光素(DCFH-DA)、羅丹明123(DHR123)和氫化乙啶(HE)[27]，用于檢測谷胱甘肽的化學(xué)熒光探針則包括5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)探針、基于吖啶橙的熒光探針等[28]，有研究通過外源添加GSH還原酶與輔酶，同時(shí)定量GSSG和GSH以實(shí)現(xiàn)EGSH/GSSG的測定，但是該方法操作較復(fù)雜，不適合基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)使用[29]。檢測NAD(P)H的化學(xué)探針則大多需要先對細(xì)胞進(jìn)行破碎提取，因此不適合實(shí)時(shí)反映細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)變化。

化學(xué)熒光探針特異性較好、信號(hào)穩(wěn)定且熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，但不可避免地具有一定的細(xì)胞毒性，難以實(shí)現(xiàn)氧化還原狀態(tài)的區(qū)域化檢測以及實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)在線成像，遺傳編碼的熒光蛋白則是細(xì)胞氧化還原狀態(tài)實(shí)時(shí)檢測最有前景的工具。

2.2 遺傳編碼的熒光蛋白探針

遺傳編碼的熒光蛋白探針根據(jù)其作用機(jī)制可以分為基于循環(huán)置換熒光蛋白家族(cpFPs)的探針、氧化還原敏感的熒光蛋白探針(roFPs)以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移型熒光探針(FRET)這3種。

2.2.1 基于循環(huán)置換熒光蛋白的探針

循環(huán)置換型熒光蛋白是將普通熒光蛋白的N端和C端經(jīng)過互換并用一個(gè)短肽接頭重新連接形成的熒光蛋白，這些改造使得熒光發(fā)色團(tuán)的位置發(fā)生變化，容易感受外界條件的變化，從而發(fā)生相應(yīng)的構(gòu)象變化[30]。常見的循環(huán)置換型的熒光蛋白主要有循環(huán)置換的黃色熒光蛋白(cpYFP)和循環(huán)置換的紅色熒光蛋白(cpRFP)。利用循環(huán)置換熒光蛋白易于感知外界條件變化的特性，將其插入到氧化還原轉(zhuǎn)錄因子當(dāng)中可以實(shí)現(xiàn)一系列氧化還原代謝物的檢測。目前應(yīng)用較為廣泛的主要是特異性檢測H2O2的比率型探針熒光探針HyPer(H2O2)、檢測NADH水平的Frex探針和SoNar探針等。

HyPer探針是將cpYFP插入到大腸桿菌轉(zhuǎn)錄因子OxyR的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域中形成的[31]，該探針表面有2個(gè)Cys可以被氧化形成二硫鍵，構(gòu)象的改變使cpYFP在420 nm的激發(fā)光下熒光強(qiáng)度降低、500 nm激發(fā)時(shí)熒光強(qiáng)度升高，熒光強(qiáng)度的比值隨H2O2濃度的增加而增加。為了獲得更高的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍，Bilan等[32]通過突變HyPer的OxyR-RD 得到了HyPer-2和HyPer-3。HyPer-2是HyPer的Ala406Val突變體，動(dòng)態(tài)范圍擴(kuò)展，但反應(yīng)速率較低，有較大的缺陷；HyPer-3是HyPer的His34Tyr突變體，突變后動(dòng)態(tài)檢測范圍與HyPer-2相近，但反應(yīng)速率提升。在這3種探針中，HyPer-3的動(dòng)態(tài)檢測范圍廣，反應(yīng)速率適中，更可能獲得廣泛的應(yīng)用[32]。為了擴(kuò)展Hyper熒光探針的光譜范圍，用循環(huán)置換的紅色熒光蛋白cpRFP替換cpYFP產(chǎn)生了Hyper Red熒光探針，該探針的反應(yīng)速度更快、靈敏度更高，但作為一個(gè)強(qiáng)度型熒光探針，Hyper Red易受到環(huán)境干擾，較難實(shí)現(xiàn)H2O2的穩(wěn)定測量[33]。HyPer系列探針的光譜特征和特點(diǎn)見表1。

Frex探針是將cpYFP插入來自枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)錄因子B-Rex二聚體的亞基之間形成的，Rex上有與NADH特異性結(jié)合的區(qū)域，能夠響應(yīng)NADH變化[34]。Frex探針的缺點(diǎn)是對pH的變化敏感，使用時(shí)需要對pH進(jìn)行控制。SoNar是將cpYFP插入去除DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的T-Rex單個(gè)亞基中形成的，利用Rex單亞基與NAD+和NADH結(jié)合能力的強(qiáng)弱不同形成NAD+/NADH的比率探針[35]。SoNar的亮度和動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍是cpFP系列熒光探針中最大的(～15倍)，應(yīng)用最為廣泛，但是它無法表征細(xì)胞內(nèi)總NAD的量，因?yàn)槠鋵?xì)胞內(nèi)生理pH的變化敏感，在使用時(shí)需要控制體系pH或設(shè)置相應(yīng)對照。

除了通用的幾種探針以外，還有將cpYFP插入到T-Rex的單個(gè)亞基中形成的RexYFP探針。與Frex不同，RexYFP熒光信號(hào)的變化是由T-Rex蛋白的一個(gè)亞基內(nèi)的構(gòu)象重排引起的。RexYFP是一種強(qiáng)度測量探針，在490 nm處具有單個(gè)激發(fā)峰，在516 nm處具有發(fā)射峰。 NADH的結(jié)合誘導(dǎo)指示劑熒光降低2倍。因此，該指示適用于反映細(xì)胞中NAD+/NADH的動(dòng)態(tài)變化，不適合測定總NADH水平[36]。RexYFP的缺點(diǎn)在于熒光較弱且易受到pH的影響。Peredox探針則是將循環(huán)置換寶石藍(lán)熒光蛋白T-Sapphire插入到來自嗜熱桿菌轉(zhuǎn)錄因子NADH結(jié)合結(jié)構(gòu)域T-Rex兩個(gè)亞單位之間構(gòu)建而成，通過定點(diǎn)突變消除了探針的pH敏感性[37]。Peredox是一種強(qiáng)度計(jì)指示劑，在400 nm處具有單個(gè)激發(fā)峰，在510 nm處具有發(fā)射峰。為了開發(fā)具有比率讀數(shù)的探針，Peredox分別與紅色熒光蛋白(mCherry)和黃色熒光蛋白(mCitrine)融合，獲得新的比率型熒光探針[38]，Peredox的主要優(yōu)點(diǎn)是它不受pH影響，能夠抵抗生理范圍內(nèi)的pH變化，缺點(diǎn)是容易氧化飽和，因此只適合于細(xì)胞質(zhì)和線粒體的檢測。

綜上所述，基于循環(huán)置換蛋白的探針性質(zhì)和特點(diǎn)見表1。

表1 基于循環(huán)置換蛋白的探針性質(zhì)和特點(diǎn)

2.2.2 氧化還原敏感的熒光蛋白家族

氧化還原敏感的熒光蛋白(roFP)是在通用的熒光蛋白基礎(chǔ)上經(jīng)突變引入2個(gè)半胱氨酸殘基形成的。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)發(fā)生變化時(shí)，2個(gè)Cys殘基經(jīng)氧化形成二硫鍵，使得蛋白質(zhì)的質(zhì)子化狀態(tài)發(fā)生變化，影響發(fā)光基團(tuán)。目前應(yīng)用最廣泛的氧化還原敏感型綠色熒光蛋白roGFP是將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)β鏈上的S147和Q204突變?yōu)镃ys后形成的[39]。roGFP經(jīng)氧化后，2個(gè)Cys殘基形成二硫鍵，構(gòu)象重排使得激發(fā)波長發(fā)生變化，在405 nm處激發(fā)的熒光強(qiáng)度下降，而488 nm處激發(fā)的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，二者比值的改變能夠反映氧化還原狀態(tài)的變化[39]。roGFP的檢測反應(yīng)時(shí)間較長、還原性較強(qiáng)、易于過氧化，因此檢測范圍有限，更適用于氧化強(qiáng)度較低的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞質(zhì)、線粒體等。研究者通過C48S和S65T兩處點(diǎn)突變，獲得了更高強(qiáng)度且具有更高動(dòng)態(tài)范圍的roGFP2，但仍未解決roGFP2檢測速度慢和特異性較差的問題[39-40]。

將roGFP2與氧化還原相關(guān)酶的融合這一策略為roGFP2選擇性和靈敏度的提升以及廣泛應(yīng)用提供了新的視野。將roGFP2酵母過氧化物酶Orp1實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)H2O2的特異性檢測[41]，為了提升靈敏度與反應(yīng)速度，Morgan等[42]將roGFP2分別與釀酒酵母的所有過氧化物酶融合，最終篩選獲得了較高靈敏度的過氧化物酶Tsa2，再經(jīng)過單個(gè)氨基酸突變提高了反應(yīng)速度。除了融合過氧化物酶檢測H2O2，融合谷胱甘肽氧化還原酶Grx1特異性檢測谷胱甘肽也是一個(gè)很好的研究方向，其反應(yīng)原理是通過GSSG與Grx1反應(yīng)，再經(jīng)過分子內(nèi)重排產(chǎn)生二硫鍵，改變蛋白的構(gòu)象，進(jìn)而影響激發(fā)波長[43]。Grx1與roGFP2的融合提升了檢測的靈敏度和反應(yīng)速度，但是沒有影響roGFP2的光譜特征，而且Grx1-roGFP2對谷胱甘肽氧化還原電位具有高度特異性，不與硫氧還蛋白系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)，是優(yōu)良的EGSH/GSSG檢測器。

除了roGFP以外，還有一系列基于相同原理開發(fā)的熒光蛋白探針。例如，roCherry是將紅色熒光蛋白mCherry的150Ala和203Lys突變?yōu)镃ys后形成的，再與Grx1融合可以實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽的特異性檢測；Grx1-rocherry的激發(fā)和發(fā)射波長分別為589和610 nm，中點(diǎn)氧化還原電位為-310 mV。該熒光探針的亮度較高且具有pH穩(wěn)定性[44]，是檢測活細(xì)胞EGSH/GSSG很有潛力的工具。

氧化還原敏感的黃色熒光蛋白(rxYFP)中相鄰的β鏈上有2個(gè)Cys殘基，可以與GSSG發(fā)生反應(yīng)，再經(jīng)過分子內(nèi)重排形成二硫鍵導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。rxYFP是一個(gè)強(qiáng)度指示性的熒光探針，最大激發(fā)波長在512 nm處，最大發(fā)射波長在523 nm處[45]。rxYFP的中點(diǎn)氧化還原電位為-261 mV。因?yàn)樯項(xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)EGSH/GSSG為-270～-120 mV，所以rxYFP能夠檢測細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)的EGSH/GSSG變化[45]。rxYFP已成功用于監(jiān)測酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不同亞細(xì)胞區(qū)室中谷胱甘肽的氧化還原狀態(tài)，如細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體基質(zhì)和線粒體膜間隙[46-48]。rxYFP的缺點(diǎn)是對細(xì)胞內(nèi)生理pH變化和Cl-具有敏感性。

綜上所述，氧化還原敏感的熒光蛋白的性質(zhì)和特點(diǎn)見表2。

表2 基于氧化還原敏感的熒光探針性質(zhì)和特點(diǎn)

2.2.3 基于FRET的熒光對

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是2個(gè)相鄰生色團(tuán)之間的非輻射能量傳遞過程。當(dāng)供體生色團(tuán)和受體生色團(tuán)之間的距離發(fā)生改變時(shí)，熒光的情況也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。檢測氧化還原的熒光對通常是由一段含有2個(gè)Cys殘基的多肽鏈連接形成的，在氧化條件下，2個(gè)Cys形成分子內(nèi)二硫鍵，F(xiàn)RET供體和受體之間的距離發(fā)生改變，從而使得熒光發(fā)生變化。最經(jīng)典的FRET熒光對是ECFP和EYFP，通過改變熒光對之間的接頭，開發(fā)出了一系列靈敏度各不相同的探針。最初，Lam等[49]利用釀酒酵母轉(zhuǎn)錄因子能夠感知氧化還原狀態(tài)的特點(diǎn)，選擇其感知區(qū)域作為多肽接頭，開發(fā)了感知谷胱甘肽氧化還原電位的熒光探針。為了提升反應(yīng)速度，將半胱氨酸殘基隨機(jī)插入EAAAK重復(fù)序列的多肽中，篩選出一種名為RL5的多肽作接頭，可以迅速響應(yīng)氧化還原狀態(tài)變化[50]。而為了擴(kuò)展熒光對的動(dòng)態(tài)范圍，人們開發(fā)了clover和mRuby2，它們是迄今為止最亮的綠色和紅色熒光蛋白對，用帶有Cys的多肽將它們連接，并通過分子模擬選擇最合適的反應(yīng)距離，開發(fā)的clover-mRuby2探針具有響應(yīng)EGSH/GSSG的能力[51]?；贔RET還開發(fā)了一系列檢測輔酶含量和比例的探針，如NADP+/NADPH探針Apollo-NADP[52]、NADP+熒光探針NADPsor[53]及NAD+熒光探針ligA-cpVenus[54]等。但是這些探針由于動(dòng)態(tài)范圍較小、反應(yīng)條件苛刻等原因，目前應(yīng)用范圍較窄。

雖然基于FRET的熒光探針發(fā)展迅速，但是該類熒光探針的穩(wěn)定性和敏感性都不夠高，而對檢測條件要求較高，目前在氧化還原狀態(tài)的測定上尚未獲得普遍應(yīng)用。

2.2.4 基于轉(zhuǎn)錄因子的熒光探針

基于轉(zhuǎn)錄因子的熒光探針是利用轉(zhuǎn)錄因子能與相應(yīng)代謝物結(jié)合的特性[55]，構(gòu)建基因線路，使得轉(zhuǎn)錄因子與代謝物結(jié)合后，啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的檢測。例如，Zhang等[56]和Liu等[57]分別利用釀酒酵母轉(zhuǎn)錄因子Yap1和大腸桿菌轉(zhuǎn)錄因子Rex設(shè)計(jì)基因線路實(shí)現(xiàn)NAD+/NADH的檢測。這一類熒光探針無需對熒光蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，但是在不同的細(xì)胞中需要選擇不同的轉(zhuǎn)錄因子重新進(jìn)行線路設(shè)計(jì)，不具有普適性。

3 氧化還原狀態(tài)調(diào)控在細(xì)胞工廠中的應(yīng)用

氧化還原的平衡能夠使得細(xì)胞處于良好的生理狀態(tài)，對細(xì)胞工廠穩(wěn)定生長以及生物燃料、生物醫(yī)藥、化學(xué)品的高效合成具有重要意義。因此，對氧化還原狀態(tài)的調(diào)控是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞工廠高效生產(chǎn)的有效途徑。早期由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，大多通過增加溶氧或改善發(fā)酵條件的方式來實(shí)現(xiàn)氧化還原狀態(tài)的調(diào)控。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，氧化還原狀態(tài)的檢測方法更加多元化，基因編碼的熒光探針也在研究氧化還原的機(jī)制和原理上發(fā)揮著重要作用。而氧化還原代謝機(jī)制的深入發(fā)展使得對細(xì)胞氧化還原狀態(tài)實(shí)現(xiàn)更精細(xì)有效的調(diào)控成為可能。目前常用的調(diào)控細(xì)胞工廠氧化還原狀態(tài)的策略主要包括對細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)、氧化還原相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、氧化還原關(guān)鍵的輔酶等的調(diào)控。

3.1 抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控

改造細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)是調(diào)節(jié)細(xì)胞工廠氧化還原狀態(tài)最直接也是最有效的方式。Xu等[58]通過在釀酒酵母中導(dǎo)入植物及極端微生物來源的抗氧化酶構(gòu)造了一種人工抗氧化防御系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了釀酒酵母的耐熱性以及乙醇產(chǎn)量的提升，乙醇產(chǎn)量與對照相比提升了66%，還通過DCFA-HA探針檢測了細(xì)胞內(nèi)的ROS，證明了氧化防御系統(tǒng)在維持線粒體和細(xì)胞膜完整性上具有明顯作用。另外，過表達(dá)谷胱甘肽合成途徑的關(guān)鍵基因gsh1、cys3和glr1也可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，增加GSH的含量和比例，進(jìn)而減輕木質(zhì)纖維素水解副產(chǎn)物在發(fā)酵中的抑制作用，使得菌株的魯棒性和發(fā)酵性能提升，而谷胱甘肽的含量以及EGSH/GSSG的測定則是由DTNB熒光探針來完成的[59]。Xu等[60]在產(chǎn)油酵母中的研究證明，谷胱甘肽還原酶以及相關(guān)脫氫酶的過量表達(dá)能夠改善酵母細(xì)胞的形態(tài)，促進(jìn)脂質(zhì)的高效合成，細(xì)胞含油量達(dá)到81.4%，產(chǎn)量接近工業(yè)生產(chǎn)需求。

此外，引入外源的谷胱甘肽合成和還原路徑，也是調(diào)控細(xì)胞氧化還原狀態(tài)、實(shí)現(xiàn)細(xì)胞工廠抗脅迫性能和生產(chǎn)性能的有效方法[61-62]。除了調(diào)節(jié)細(xì)胞酶促抗氧化系統(tǒng)，也可以引入外源抗氧化劑合成途徑實(shí)現(xiàn)氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)以及細(xì)胞工廠的高效生物轉(zhuǎn)化。例如，番茄紅素作為抗氧化劑被廣泛用于食品藥品行業(yè)，在酵母中引入異源番茄紅素合成途徑不僅可以通過積累番茄紅素來增加細(xì)胞活力，還可以提高厭氧發(fā)酵過程中乙酸耐受性和乙醇生產(chǎn)水平[63]。這一系列的研究結(jié)果中，抗氧化系統(tǒng)的改造對于提升細(xì)胞的抗脅迫性能和產(chǎn)能有著重要的意義。

3.2 輔酶調(diào)控

NAD(P)+和NAD(P)H不僅與氧化還原代謝有關(guān)，還耦聯(lián)細(xì)胞的碳代謝和能量代謝，參與的代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜?；蚓幋a的熒光探針能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞內(nèi)輔酶水平的實(shí)時(shí)監(jiān)測，分析輔酶的代謝機(jī)制和影響輔酶的因素，進(jìn)而對參與氧化還原的輔酶進(jìn)行精準(zhǔn)的調(diào)控[64]。根據(jù)輔酶的代謝機(jī)制，調(diào)控輔酶的策略主要有以下幾種。

1)敲除輔酶競爭途徑是一種增加輔酶可用性以驅(qū)動(dòng)目標(biāo)代謝物形成的有效方法。在糖酵解中，NADH的消耗與多種產(chǎn)物的生物合成有關(guān)，包括乙醇、乳酸鹽和某些氨基酸等。Saini等[65]研究發(fā)現(xiàn)，通過敲除乳酸脫氫酶的基因ldh或激活丙氨酸脫氫酶的基因ald，可以讓更多的NADH驅(qū)動(dòng)大腸桿菌中丙二醇、丁醇和其他醇的產(chǎn)生。而敲除編碼乙酸激酶和乳酸脫氫酶的基因，并過表達(dá)編碼丁酸激酶的基因可以更多地生產(chǎn)丁酸鹽[66]。

2)調(diào)節(jié)輔酶合成或再生途徑的關(guān)鍵酶也可以調(diào)節(jié)輔酶的狀態(tài)，影響細(xì)胞狀態(tài)和產(chǎn)量。例如，將NAD再生途徑引入工程化生產(chǎn)異丁醇的大腸桿菌中，由于NADH水平的增加，提升了糠醛耐受性，從而提高了其發(fā)酵生產(chǎn)能力[67]。Wu等[68]研究表達(dá)了多種不同來源的NADH脫氫酶，提升了NADH的再生能力，實(shí)現(xiàn)了賴氨酸在谷氨酸棒桿菌中的高效生產(chǎn)。而在植物甾醇發(fā)酵系統(tǒng)中，通過添加NAD的前體以及表達(dá)來自短乳桿菌的NADH氧化酶，改善了NAD+和NADH在細(xì)胞內(nèi)的比例，使得工程菌株甾醇的轉(zhuǎn)化率最終提高了147%[69]。通過突變磷酸戊糖途徑中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡糖酸脫氫酶，降低它們對細(xì)胞內(nèi)代謝物抑制劑的敏感性，可以富集細(xì)胞內(nèi)的NADPH，得到的谷氨酸棒桿菌甲硫氨酸產(chǎn)率提高了53.2%[70]。

3)改造天然輔酶的特異性也可以調(diào)節(jié)氧化還原平衡。用來自枯草芽孢桿菌的NADP+依賴性的甘油醛-3-磷酸脫氫酶取代谷氨酸棒桿菌內(nèi)源的NAD+依賴性甘油醛-3-磷酸脫氫酶，提高了細(xì)胞內(nèi)NADPH的水平，使得NADPH依賴性化合物的合成水平獲得了提高[71]。利用輔酶結(jié)合的特異性對輔酶進(jìn)行修飾也可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原平衡。通過對谷氨酸棒桿菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶的NADH結(jié)合區(qū)域的保守序列進(jìn)行突變[71]，或者引入非天然的異檸檬酸脫氫酶基因idh都實(shí)現(xiàn)了L-賴氨酸產(chǎn)量的提高[72]。在能夠生產(chǎn)L-乳酸的釀酒酵母工程菌株中敲除細(xì)胞質(zhì)的NADH脫氫酶，提高了細(xì)胞內(nèi)NADH的水平，工程菌株在酸性條件下L-乳酸產(chǎn)量實(shí)現(xiàn)了32.6%的提升[73]。

綜上可知，基因編碼的熒光探針檢測輔酶水平的變化與代謝工程方法調(diào)控輔酶結(jié)合在實(shí)現(xiàn)細(xì)胞工廠的高效生物轉(zhuǎn)化過程中有著重要意義。

3.3 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控

細(xì)胞內(nèi)氧化還原相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子除了用于開發(fā)相應(yīng)的生物傳感器以外，還可以作為智能精細(xì)調(diào)控細(xì)胞工廠生物轉(zhuǎn)化的有力工具。酵母中氧化還原相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Yap1的過表達(dá)能夠促進(jìn)氧化防御相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，提高細(xì)胞的抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激引起的蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，從而提高細(xì)胞分泌蛋白的能力[74]。而氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Ybp1的過表達(dá)能夠消除ROS，增強(qiáng)細(xì)胞活力最終在酵母細(xì)胞工廠中實(shí)現(xiàn)人參二醇的高效生產(chǎn)[73]。Zhang等[75]利用轉(zhuǎn)錄因子Rex上調(diào)idh的表達(dá)，idh可以調(diào)節(jié)NADH/NAD+的比例，最終實(shí)現(xiàn)丙酮和丁醇的高效生產(chǎn)。大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Hdfr可以顯著提高NADPH的利用率，加強(qiáng)NADPH依賴性谷氨酸合成[76]。這些研究表明，氧化還原相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子是一種調(diào)控氧化還原狀態(tài)的有效方法。

4 結(jié)論與展望

氧化還原狀態(tài)的調(diào)控在開發(fā)生產(chǎn)生物燃料、生物醫(yī)藥以及生物基化學(xué)品的細(xì)胞工廠中發(fā)揮了重要的作用，優(yōu)良的檢測方法是進(jìn)行精確調(diào)控的基礎(chǔ)?；蚓幋a的氧化還原探針飛速發(fā)展，其靈敏度與檢測限都在不斷提升，更是開發(fā)出了能夠定位于不同細(xì)胞器的氧化還原熒光探針。但是其檢測原理較為單一，大多基于半胱氨酸氧化形成二硫鍵，改變熒光蛋白的構(gòu)象，而且由于基因編碼的熒光探針需要對宿主細(xì)胞進(jìn)行基因操作，不可避免對細(xì)胞工廠的代謝產(chǎn)生影響。

隨著新一代測序和基因操作的發(fā)展，細(xì)胞工廠的代謝機(jī)制將會(huì)更加清晰。檢測氧化還原反應(yīng)的熒光探針不僅需要更快的反應(yīng)速度與靈敏度，還需要更加廣泛的監(jiān)測范圍，能夠監(jiān)測更多的氧化還原相關(guān)的代謝物和反應(yīng)，更需要擴(kuò)展現(xiàn)有熒光蛋白的光譜特征，不能僅局限于常見的紅色和綠色熒光，紅外領(lǐng)域也可以作為開發(fā)的目標(biāo)。同時(shí)，熒光探針方法還可以與電子自旋共振、電化學(xué)等方法相結(jié)合，綜合表征細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)。氧化還原狀態(tài)作為重要的生理指標(biāo)，其監(jiān)測與調(diào)控都需要更多的研究探索，進(jìn)而在工業(yè)微生物中進(jìn)行精準(zhǔn)有效的調(diào)節(jié)，減少冗余的基因線路帶來的負(fù)擔(dān)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞工廠中目標(biāo)產(chǎn)物的高效生產(chǎn)。