劉 爽，高教琪，薛 闖，周雍進(jìn)

(1.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧大連116031；2.大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116024)

多形漢遜酵母(Ogataeapolymorpha)是目前一種應(yīng)用較為廣泛的甲基營養(yǎng)型酵母[1]，其生長繁殖速度快[2]、底物利用廣泛、耐受溫度高[3]、易于發(fā)酵培養(yǎng)，適于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)高附加值化學(xué)品[4]。早在1995年時，Weydemann等[5]在漢遜酵母菌株中表達(dá)水蛭素變異體HV1亞型，成功構(gòu)建了水蛭素生產(chǎn)菌株O.polymorphaRB11，產(chǎn)量達(dá)1 g/L。目前，漢遜酵母作為宿主細(xì)胞主要應(yīng)用于低級醇[6-7]、天然產(chǎn)物[5,8-9]以及蛋白質(zhì)[10-11]的發(fā)酵生產(chǎn)。同時，漢遜酵母近年來越來越受到人們的關(guān)注，主要是因其具有優(yōu)良的甲醇代謝能力[12]。

甲醇作為最簡單的化學(xué)品之一，是十分重要的C1有機(jī)化工原料和化工基礎(chǔ)產(chǎn)品[13]。甲醇最初來源于木材干餾[14]，但現(xiàn)在的工藝已經(jīng)可以利用煤炭經(jīng)過氣化或天然氣經(jīng)過蒸汽重整大規(guī)模合成，這就可避免與人爭糧、與動物爭糧的問題[15]。甲醇作為具有清潔特性的重要液體燃料，具有便于攜帶和運(yùn)輸?shù)奶攸c(diǎn)。因此被普遍應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、有機(jī)合成、染料、涂料和汽車等行業(yè)中[16]。同時，甲醇作為微生物發(fā)酵底物，可合成具有高附加值的產(chǎn)品，日益成為合成生物學(xué)和代謝工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[17]。

但目前多形漢遜酵母發(fā)酵培養(yǎng)基大多使用蛋白胨和酵母粉，這就使發(fā)酵成本一直高居不下，降低發(fā)酵培養(yǎng)基成本是實(shí)現(xiàn)多形漢遜酵母大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的一個重要前提。維生素，是維持生物機(jī)體生命活動所必需的一類有機(jī)化合物，同時也是保持機(jī)體健康生長必要的活性物質(zhì)[18]。氨基酸是維持生物機(jī)體生命活動所必需的基本物質(zhì)，是合成各種蛋白質(zhì)的必要成分，參與機(jī)體肌肉、皮膚、臟器、酶和免疫抗體等物質(zhì)的合成[19]。維生素和氨基酸雖然含量極少，卻在生長、新陳代謝以及發(fā)育等過程中發(fā)揮著不可替代的作用[20]。因此，如果利用維生素和氨基酸來代替蛋白胨和酵母粉等昂貴且復(fù)雜的營養(yǎng)成分，在保證良好細(xì)胞生長的同時，將能夠極大地降低培養(yǎng)基成本。

本文中，筆者從基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基出發(fā)，優(yōu)化葡萄糖和甲醇2種培養(yǎng)基中維生素和氨基酸的種類和濃度。同時，利用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)法，確定維生素和氨基酸成分的最少添加量，以期得到優(yōu)化后的培養(yǎng)基來促進(jìn)細(xì)胞生長，簡化培養(yǎng)基組成，降低發(fā)酵成本，對大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

OgataeapolymorphaNCYC495菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，編號CGMCC 2.2412。

1.2 試劑與儀器

丙酮酸脫氫酶可見分光光度法試劑盒、丙酮酸羧化酶微量法試劑盒，上海優(yōu)選生物科技有限公司；甲醇、葡萄糖、瓊脂粉、無水KH2PO4、各種氨基酸試劑以及各種維生素試劑，生工生物工程(上海)股份有限公司；(NH4)2SO4、MgSO4以及trace metal溶液中的各種試劑，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、酵母粉等，OXOID公司。其中trace metal溶液配方(pH 4.0,g/L)：FeSO4·7H2O 3.0、ZnSO4·7H2O 4.5、CaCl·2H2O 4.5、MnCl2·4H2O 1.0、CoCl2·6H2O 0.3、CuSO4·5H2O 0.3、H3BO31.0、Na2MoO4·2H2O 0.4、KI 0.1、Na2EDTA·2H2O 19.0。

Macy UV-1100型紫外可見分光光度計(jì)，美析(中國)儀器有限公司；ZQZY-CF8型三層組合全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；Heraeus Multifuge X1R型離心機(jī)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；HPX-9052 MBE型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療儀器設(shè)備廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

從平板中挑取單菌落至5 mL 酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基中(15 mL離心管)，搖床活化24 h左右后，吸取200 μL菌液轉(zhuǎn)接至20 mL YPD培養(yǎng)基中(100 mL錐形瓶)搖床培養(yǎng)16～18 h為種子液。取適量種子液于15 mL離心管內(nèi)，1 000g、5 min離心，去上清，使用與種子液體積相同的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基洗2次后，使初始OD600為0.1時接入相應(yīng)培養(yǎng)基中，發(fā)酵體積為50 mL(250 mL錐形瓶)，每組3個平行。本研究中培養(yǎng)溫度為37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。

1.3.2 培養(yǎng)基中維生素成分的優(yōu)化

以分別添加單獨(dú)的7種維生素成分的7個培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)組，以添加混合維生素溶液的培養(yǎng)基作為陽性對照組，以不添加任何維生素成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基作為空白對照組。隨時間測定600 nm處的OD600作為生物量指標(biāo)，判斷培養(yǎng)基的優(yōu)劣。

1.3.3 培養(yǎng)基中氨基酸成分的優(yōu)化

以分別添加單獨(dú)的10種氨基酸成分的10個培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)組，以添加混合氨基酸溶液的培養(yǎng)基作為陽性對照組，以不添加任何氨基酸成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基作為空白對照組。隨時間測定600 nm處的OD600，判斷培養(yǎng)基的優(yōu)劣。

1.3.4 丙酮酸脫氫酶和丙酮酸羧化酶的酶活性測定

測定丙酮酸脫氫酶活性的原理：丙酮酸脫氫酶催化丙酮酸脫氫，同時將作為電子受體的2,6-二氯酚靛酚(2,6-DCPIP)還原，從而導(dǎo)致605 nm處光吸收A605的減少。

測定丙酮酸羧化酶活性的的原理：丙酮酸羧化酶催化丙酮酸、CO2和水在ATP的作用下生成草酰乙酸，并且將ATP分解成ADP和Pi，之后蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH發(fā)生反應(yīng)，生成蘋果酸和NAD+，產(chǎn)生的NAD+與特異的顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)生在450 nm處最大吸收峰的黃色物質(zhì)，通過檢測該黃色物質(zhì)在450 nm處的增加速率，即可反映丙酮酸羧化酶的活性。

1.3.5 Box-Behnken試驗(yàn)法優(yōu)化添加濃度

Box-Behnken試驗(yàn)法具有可以方便有效地測試多個過程變量并且可以識別和量化多個變量之間復(fù)雜的交互作用的特點(diǎn)[21]。因此研究中使用此方法對同時添加的多種維生素或氨基酸之間相互作用時的最優(yōu)濃度進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基

2.1.1 優(yōu)化添加的維生素的種類和濃度

首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，向以葡萄糖為碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中添加混合維生素溶液作為陽性對照組，以不添加任何其他成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基為空白對照組，以分別單獨(dú)添加7種維生素成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基為7個實(shí)驗(yàn)組。

首先測定發(fā)酵至平臺期時各個培養(yǎng)基的OD600，結(jié)果見圖1(a)、(b)。由圖1(a)、(b)可知：分別單獨(dú)添加的7種維生素中對多形漢遜酵母在此培養(yǎng)基中的生長起促進(jìn)作用最明顯的是生物素成分；不添加任何維生素成分的葡萄糖基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中菌種生長緩慢，發(fā)酵至80 h的OD600只能達(dá)到2.0，而添加了混合維生素溶液的培養(yǎng)基中的菌種發(fā)酵至平臺期OD600可達(dá)到13.6，是空白對照組的近7倍；在分別單獨(dú)添加各種維生素溶液的7個實(shí)驗(yàn)組中，對生長促進(jìn)效果最明顯的是生物素成分，發(fā)酵的最大OD600同樣可以達(dá)到13.6，與添加混合維生素溶液的培養(yǎng)基相當(dāng)。由此可見，只需單一生物素成分即可以明顯促進(jìn)多形漢遜酵母在葡萄糖基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的生長。

其次，對單獨(dú)添加的生物素濃度進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)混合維生素溶液中生物素的濃度，選取0.005、0.025、0.050和0.100 mg/L這4個質(zhì)量濃度的生物素進(jìn)行單獨(dú)添加，測定其生長曲線，結(jié)果見圖1(c)。由圖1(c)可知，4組生長曲線均在27 h左右達(dá)到了發(fā)酵平臺期，最大OD600都在11～12。由此可見，添加不同濃度的生物素溶液對葡萄糖基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中多形漢遜酵母菌種生長的促進(jìn)作用幾乎沒有差異。因此，為了降低培養(yǎng)基的成本，只需選取最少量添加，即培養(yǎng)基中添加的生物素質(zhì)量濃度為0.005 mg/L。

2.1.2 優(yōu)化添加氨基酸種類和濃度

為了確定氨基酸混合溶液中10種不同氨基酸促進(jìn)作用，分別在葡萄糖基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中添加10種氨基酸成分，同時以添加氨基酸混合溶液的培養(yǎng)基為陽性對照組，以不添加任何氨基酸成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基為空白對照組，測定發(fā)酵至平臺期(115 h)時各個培養(yǎng)基的OD600，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，天冬氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸是對多形漢遜酵母在葡萄糖培養(yǎng)基中的生長起促進(jìn)作用的最主要的3種成分。發(fā)酵時間至115 h，不添加任何氨基酸成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中多形漢遜酵母菌株的OD600達(dá)到3左右，而添加氨基酸混合溶液的培養(yǎng)基的OD600能達(dá)到10。分別單獨(dú)添加天冬氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸這3種成分的培養(yǎng)基，發(fā)酵至115 h的OD600分別能達(dá)到7.6、7.4和5.5。雖然這3種氨基酸單獨(dú)添加對菌種的生長都有一定程度的促進(jìn)作用，但是并不及混合氨基酸溶液的促進(jìn)作用，因此決定以這3種成分的混合溶液進(jìn)行添加，以提高多形漢遜酵母在以葡萄糖為碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的OD600。

G—Delft+葡萄糖;G+Vit—Delft+葡萄糖+維生素混合溶液;G+生物素—Delft+葡萄糖+生物素圖1 優(yōu)化葡萄糖培養(yǎng)基中添加的維生素的種類和濃度Fig.1 Optimizing the types and concentrations of vitamins added to glucose medium

G+aa— Delft+葡萄糖+氨基酸混合溶液;G+Asp—Delft+葡萄糖+天冬氨酸;G+Glu—Delft+葡萄糖+谷氨酸;G+Met—Delft+葡萄糖+甲硫氨酸圖2 優(yōu)化葡萄糖培養(yǎng)基中添加的氨基酸種類Fig.2 Optimizing the types of amino acids added to the glucose medium

進(jìn)一步分別對天冬氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸這3種氨基酸的添加量進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)混合氨基酸溶液中的各成分濃度，甲硫氨酸選取5、10、20和40 mg/L這4個質(zhì)量濃度；天冬氨酸和谷氨酸均選取10、50、100和200 mg/L這4個質(zhì)量濃度，對分別添加上述濃度氨基酸的培養(yǎng)基的發(fā)酵過程測定其生長曲線，結(jié)果見圖3。

G+Optimized-aa—Delft+葡萄糖+優(yōu)化的氨基酸溶液圖3 優(yōu)化葡萄糖培養(yǎng)基中添加的氨基酸濃度Fig.3 Optimization of amino acid concentrations in glucose medium

由圖3可知：甲硫氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的最佳添加量分別是40、200和200 mg/L，發(fā)酵100 h后最大OD600分別達(dá)到5.2、7.2和9.4。這些結(jié)果表明谷氨酸對多形漢遜酵母在葡萄糖培養(yǎng)基生長的促進(jìn)最明顯。將三者結(jié)合添加后，前期生長更快，菌種的生長曲線幾乎與添加氨基酸混合溶液的培養(yǎng)基一致，發(fā)酵至平臺期時，最大OD600能達(dá)9.3(圖3(d))。

2.1.3 培養(yǎng)基綜合優(yōu)化

上述系列試驗(yàn)確定了向以葡萄糖為碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中添加的維生素成分：0.005 mg/L的生物素，添加的氨基酸成分為40 mg/L的甲硫氨酸、200 mg/L的谷氨酸和200 mg/L的天冬氨酸。因此嘗試將優(yōu)化的生物素和氨基酸混合加入葡萄糖基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，測定其OD600，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，不添加任何維生素和氨基酸成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)發(fā)酵至70 h的OD600為3，這與之前結(jié)果一致。添加混合維生素溶液和11種氨基酸混合溶液的培養(yǎng)基發(fā)酵至平臺期菌種的最大OD600達(dá)到20，是空白對照組7倍。而添加優(yōu)化后的生物素和3種氨基酸的培養(yǎng)基菌種的最大OD600也達(dá)到了20，并且優(yōu)化后的培養(yǎng)基中多形漢遜酵母的生長曲線幾乎與添加全部混合溶液的培養(yǎng)基中菌株的生長曲線重合。該結(jié)果表明：優(yōu)化的葡萄糖培養(yǎng)基對多形漢遜酵母的生長促進(jìn)與添加全部混合溶液的培養(yǎng)基一致，這樣能大大簡化培養(yǎng)基中所需要添加的成分，降低了培養(yǎng)基成本。因此，最終確定向以葡萄糖為碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中添加的成分：生物素0.005 mg/L、甲硫氨酸40 mg/L、谷氨酸200 mg/L、天冬氨酸200 mg/L。

G+aa+Vit—Delft+葡萄糖+氨基酸混合溶液+維生素混合溶液;G+Optimized—Delft+葡萄糖+優(yōu)化后的氨基酸和維生素溶液圖4 驗(yàn)證優(yōu)化后的葡萄糖基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基Fig.4 Verification of optimized glucose base salt medium

2.2 優(yōu)化以甲醇為碳源的培養(yǎng)基

2.2.1 優(yōu)化添加的維生素種類

進(jìn)一步對以甲醇為碳源的培養(yǎng)基中維生素和氨基酸有效成分的優(yōu)化。同樣，首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，探索甲醇為碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的關(guān)鍵營養(yǎng)成分，添加混合的維生素溶液作為陽性對照組，以不添加任何其他成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基為空白對照組，以分別單獨(dú)添加7種維生素成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基為7個實(shí)驗(yàn)組，測定發(fā)酵至平臺期(培養(yǎng)90 h)時各個培養(yǎng)基對應(yīng)的OD600，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，生物素、泛酸鈣和維生素B1是對多形漢遜酵母在甲醇培養(yǎng)基中的生長起促進(jìn)作用最明顯的3種成分(圖5(a))。不添加任何維生素成分的空白對照組發(fā)酵至90 h平臺期時的OD600只能達(dá)到4，而添加了泛酸鈣、生物素和維生素B1的這3個實(shí)驗(yàn)組的OD600至平臺期分別達(dá)到5、6.6和6.7(圖5(b))。雖然這3種維生素成分對菌種的生長有明顯的促進(jìn)作用，但是分別單獨(dú)添加對菌種生長的促進(jìn)作用還是不及添加混合維生素溶液的效果顯著。因此有必要研究這3種營養(yǎng)成分的混合添加比例。

M—Delft+甲醇;M+Vit—Delft+甲醇+維生素混合溶液;M+生物素—Delft+甲醇+生物素;M+泛酸鈣—Delft+甲醇+泛酸鈣;M+VB1—Delft+甲醇+維生素B1圖5 優(yōu)化甲醇培養(yǎng)基中添加的維生素種類Fig.5 Optimizing the types of vitamins added to methanol medium

2.2.2 優(yōu)化添加的維生素成分種類

采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)法對添加的生物素、泛酸鈣和維生素B1這3種維生素成分的濃度進(jìn)行優(yōu)化。使用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)和分析，甲醇培養(yǎng)基添加3種維生素的響應(yīng)面相應(yīng)立體分析圖如圖6(a)～(c)所示。最終經(jīng)過軟件模擬優(yōu)化后得到最優(yōu)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：生物素 0.005 mg/L；泛酸鈣2.00 mg/L；維生素B1為1.04 mg/L，預(yù)計(jì)最終能達(dá)到的最大OD600為10.13。

對其結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，以添加優(yōu)化濃度后3種維生素溶液的培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，以不添加任何維生素成分的甲醇基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基作為空白對照組，以添加混合維生素溶液的培養(yǎng)基為陽性對照組，測定3種培養(yǎng)基的生長曲線，結(jié)果如圖6(d)所示。

由圖6(d)可知，不添加其他成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的最大OD600仍然在4左右。而優(yōu)化后的培養(yǎng)基的生長曲線幾乎與添加混合維生素溶液的培養(yǎng)基一致，發(fā)酵至平臺期時最大OD600為9.27。因此可以推定此響應(yīng)面優(yōu)化的結(jié)果是有效的。

2.2.3 進(jìn)一步減少甲醇培養(yǎng)基中添加的維生素種類

為了進(jìn)一步簡化甲醇培養(yǎng)基，嘗試將生物素、泛酸鈣和維生素B1這3種維生素成分適當(dāng)減少，考察其對生長的影響，結(jié)果見圖7。

由圖7可知：單獨(dú)添加一種維生素溶液時，多形漢遜酵母在其培養(yǎng)基中的OD600沒有得到明顯提高；單獨(dú)添加維生素B1的促進(jìn)作用是最顯著的但遠(yuǎn)不及添加3種維生素溶液的促進(jìn)效果；添加生物素和維生素B1兩種維生素溶液時，發(fā)酵至平臺期的OD600為9.3，這與添加生物素、泛酸鈣和維生素B1這三種維生素溶液時的OD600(9.6)十分接近，表明減少泛酸鈣對OD600沒有影響。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，僅添加生物素(0.005 mg/L)和維生素B1 (1.04 mg/L)能顯著提高多形漢遜酵母在甲醇為碳源的培養(yǎng)基中的生長，且與添加混合維生素溶液的培養(yǎng)基中生長情況相當(dāng)。因此，以甲醇為碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，僅僅添加生物素和維生素B1即可。

2.3 優(yōu)化后的培養(yǎng)基結(jié)果及成本核算

經(jīng)過上述一系列的研究，最終分別確定了以葡萄糖和甲醇為碳源的2種培養(yǎng)基，以工業(yè)級產(chǎn)品的每噸單價(jià)為標(biāo)準(zhǔn)對優(yōu)化后培養(yǎng)基進(jìn)行簡單的成本核算，并且與添加混合溶液的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基所需成本進(jìn)行對比，結(jié)果見表1和2。

添加優(yōu)化后的3種維生素的質(zhì)量濃度分別為(mg/L)：生物素0.005、泛酸鈣2.00、維生素B1 1.04；M+Optimized—Delft+甲醇+優(yōu)化的維生素圖6 利用響應(yīng)面法優(yōu)化甲醇培養(yǎng)基中添加的3種維生素的濃度Fig.6 Optimization of three vitamins addition to methanol medium by response surface method

1—生物素；2—泛酸鈣；3—維生素B1圖7 進(jìn)一步優(yōu)化甲醇培養(yǎng)基中添加的維生素種類Fig.7 Further optimization of vitamin types added to methanol medium

由表1和2可知，優(yōu)化后的葡萄糖培養(yǎng)基每噸的成本比添加混合維生素和混合氨基酸溶液培養(yǎng)基的成本少93.14元；優(yōu)化后的甲醇培養(yǎng)基每噸的成本比添加混合維生素溶液培養(yǎng)基的成本少4.22元，這為以后的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用降低成本。

2.4 優(yōu)化后的培養(yǎng)基對細(xì)胞關(guān)鍵酶活力的促進(jìn)作用

綜上所述，在對多形漢遜酵母培養(yǎng)基的優(yōu)化過

表1 葡萄糖培養(yǎng)基成本核算

注：各種培養(yǎng)基成分價(jià)格來源于網(wǎng)絡(luò)調(diào)研(https://www.hc360.com/)。

表2 甲醇培養(yǎng)基成本核算

注：各種培養(yǎng)基成分價(jià)格來源于網(wǎng)絡(luò)調(diào)研(https://www.hc360.com/)。

程中，筆者發(fā)現(xiàn)對其生長起到明顯促進(jìn)作用的成分是某些氨基酸(Asp、Glu和Met)和維生素成分(生物素和維生素B1)。對這種促進(jìn)作用的機(jī)制進(jìn)行推測：可能是細(xì)胞內(nèi)某些關(guān)鍵酶的酶活發(fā)生了顯著變化，從而加快了細(xì)胞對糖等營養(yǎng)物質(zhì)的代謝過程，進(jìn)而加快細(xì)胞生長。因此，為了證明上述推測，選取受這些營養(yǎng)成分調(diào)控的關(guān)鍵酶：丙酮酸羧化酶(PC)和丙酮酸脫氫酶(PDH)，對其不同細(xì)胞生長時期的酶活性進(jìn)行測定，以證實(shí)細(xì)胞生長的加快與關(guān)鍵酶活性的提高存在正相關(guān)。

2.4.1 優(yōu)化后葡萄糖培養(yǎng)基中丙酮酸羧化酶活性

丙酮酸羧化酶廣泛存在于酵母的線粒體中，與生物機(jī)體內(nèi)補(bǔ)充供給草酰乙酸的反應(yīng)緊密相關(guān)，是糖異生途徑中第一個限速酶，與維持生命機(jī)體的血糖動態(tài)平衡密切相關(guān)。因此，丙酮酸羧化酶的活性可能加快了細(xì)胞的代謝生長，進(jìn)而提高了菌體的生物量。3種氨基酸能對多形漢遜酵母的生長起到明顯的促進(jìn)作用的原因，是它們均進(jìn)入了細(xì)胞的中心代謝，加快了細(xì)胞的代謝過程。同時推測生物素起到作用是因?yàn)樗鳛楸狒然傅妮o酶，提高了多形漢遜酵母細(xì)胞中丙酮酸羧化酶的活性。

對優(yōu)化后葡萄糖培養(yǎng)基中漢遜酵母對數(shù)中期和平臺期細(xì)胞的丙酮酸羧化酶的活性進(jìn)行測定，結(jié)果見圖8。由圖8可知：在細(xì)胞對數(shù)生長中期時，不添加任何維生素成分的葡萄糖基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中細(xì)胞的丙酮酸羧化酶的比酶活為19 U/mg，添加混合維生素和混合氨基酸溶液的葡萄糖培養(yǎng)基中的細(xì)胞丙酮酸羧化酶的比酶活最高，能夠達(dá)到195 U/mg，是葡萄糖基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的10倍，而優(yōu)化后的葡萄糖培養(yǎng)基中細(xì)胞的丙酮酸羧化酶的比酶活為37 U/mg，是葡萄糖基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的約2倍。

2.4.2 優(yōu)化后甲醇培養(yǎng)基中丙酮酸脫氫酶和丙酮酸羧化酶活性

在以甲醇為碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，對多形漢遜酵母在其中的生長起到最明顯促進(jìn)作用的是生物素和維生素B1兩種維生素成分。一方面生物素作為丙酮酸羧化酶的輔酶，與優(yōu)化后的葡萄糖培養(yǎng)基相似，其活力的提高可能極大地促進(jìn)了細(xì)胞生長過程。另一方面，維生素B1的輔酶形式硫胺素焦磷酸(TPP)，是丙酮酸脫氫酶的輔酶。丙酮酸脫氫酶是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體催化丙酮酸氧化脫羧過程中重要的限速酶。PDH催化丙酮酸脫羧生成羥乙基-TPP，進(jìn)而合成乙酰輔酶A，將糖酵解途徑與三羧酸循環(huán)途徑連接起來。因此，在甲醇培養(yǎng)基中添加維生素B1成分可提高細(xì)胞中丙酮酸脫氫酶的活性，促進(jìn)細(xì)胞中TCA循環(huán)的進(jìn)行，進(jìn)一步提高了菌體的生物量。

為了驗(yàn)證上面的推測，同樣對在以甲醇為碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中生長的多形漢遜酵母對數(shù)中期和平臺期細(xì)胞中的丙酮酸脫氫酶和丙酮酸羧化酶的活性進(jìn)行測定，結(jié)果見圖8。

由圖8可知：在細(xì)胞對數(shù)生長中期時，不添加任何維生素成分的甲醇基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中細(xì)胞的丙酮酸脫氫酶的比酶活為102 U/mg (以1 mg蛋白計(jì))，添加混合維生素溶液的甲醇培養(yǎng)基中的細(xì)胞丙酮酸脫氫酶的比酶活達(dá)到130 U/mg，而優(yōu)化后的甲醇培養(yǎng)基中細(xì)胞的丙酮酸脫氫酶的比酶活最高，能達(dá)到450 U/mg，超過甲醇基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的4倍。這些結(jié)果表明維生素B1的添加顯著提高了丙酮酸脫氫酶活性，從而促進(jìn)了細(xì)胞生長。

*表示差異顯著(0.01

在細(xì)胞對數(shù)生長中期時，不添加任何維生素成分的甲醇基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中細(xì)胞的丙酮酸羧化酶的比酶活為9 U/mg，添加混合維生素溶液的細(xì)胞丙酮酸羧化酶的比酶活達(dá)到26 U/mg，而優(yōu)化后的甲醇培養(yǎng)基中細(xì)胞的丙酮酸羧化酶的比酶活達(dá)到82 U/mg，是甲醇基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的9.1倍。這些結(jié)果表明生物素的添加確實(shí)提高了丙酮酸羧化酶活性。

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分別確定了以甲醇和葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基的最終成分。在促進(jìn)多形漢遜酵母細(xì)胞生長的同時，降低了發(fā)酵培養(yǎng)基組分及成本，為后續(xù)的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。

當(dāng)以甲醇為碳源時，培養(yǎng)基組成為(NH4)2SO42.5 g/L、KH2PO414.4 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、trace-metal 2 mL/L、亮氨酸60 mg/L(營養(yǎng)缺陷型添加)、甲醇10 g/L、生物素0.005 mg/L、維生素B1 1.04 mg/L，優(yōu)化后每噸培養(yǎng)基能節(jié)省4.22元。與未添加的基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，OD600提高了2.5倍。優(yōu)化后的甲醇培養(yǎng)基細(xì)胞中丙酮酸脫氫酶酶比酶活提高3倍以上，丙酮酸羧化酶比酶活也提高了8倍左右。

當(dāng)以葡萄糖為碳源時，培養(yǎng)基組成為(NH4)2SO42.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO414.4 g/L、trace-metal 2 mL/L、亮氨酸60 mg/L、葡萄糖 20 g/L、生物素 0.005 mg/L、甲硫氨酸 40 mg/L、谷氨酸 200 mg/L、天冬氨酸 200 mg/L，優(yōu)化后每噸培養(yǎng)基節(jié)省成本93.14元。與未添加的基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，細(xì)胞生長提高了7倍以上。優(yōu)化后的葡萄糖培養(yǎng)基細(xì)胞中丙酮酸羧化酶比酶活提高了1倍。