王 方,張澤財,袁 悅,張 勝,王 旭,林 倩,李子義?,王新平,3? (.吉林大學 第一醫(yī)院/轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究院,吉林 長春300；.吉林大學 動物醫(yī)學學院,吉林 長春3006；3.吉林大學 人獸共患病研究所 教育部人獸共患病研究重點實驗室,吉林 長春3006)

偽狂犬病(pseudorabies,PR)是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)法定通報的疫病之一,也是“國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012－2020)”中被列為優(yōu)先防制的豬病之一,其病原體為豬皰疹病毒Ⅰ型(Su HV1),也稱為奧耶斯基氏病毒(ADV)或偽狂犬病病毒(PRV)。PRV 在分類上屬于皰疹病毒科,α-皰疹病毒亞科,水痘病毒屬[1-2]。該病毒可感染多種哺乳動物,包括豬、食肉動物、嚙齒動物和反芻動物[3],其中豬感染PRV 臨床上以新生仔豬呈現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)紊亂和死亡、成年豬表現(xiàn)為呼吸困難、母豬繁殖障礙為特征,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[4-8]。

在我國,PR 最早是劉永純[9]于1947年在貓中發(fā)現(xiàn),隨后在牛和豬中也陸續(xù)有報道。至2000年以后,PR 已在中國所有區(qū)域呈地方流行或零星分布[10]。為控制PRV 感染豬,1979年我國從匈牙利進口了Bartha-K61疫苗并評估其安全性和免疫效果[11]。自20世紀80年代后期,國內(nèi)許多地區(qū)大規(guī)模接種PR 基因缺失活疫苗(Bartha-K61株或其衍生物),對防控PR 的發(fā)生與流行發(fā)揮了重要作用[12-13]。然而,自2011 年底開始,國內(nèi)許多接種Bartha-K61 疫苗的豬群出現(xiàn)了大量的PRV 變種[4,10,14],傳統(tǒng)的Bartha-K61疫苗對其不能提供完全保護,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失；因此,建立快速有效的診斷檢測方法對控制和根除PR 具有重要的意義[15-19]。

1980年以前,PR 的診斷方法包括病毒分離、病毒中和試驗(VNT)以及動物接種試驗。20世紀90年代以來,酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、聚合酶鏈式反應(PCR)以及實時熒光定量PCR 被廣泛運用于PR 的快速診斷。由于PRV 感染多是持續(xù)性感染或隱性感染,平時難以發(fā)現(xiàn),因此迫切需要建立更加特異、敏感和方便的方法,用于識別和淘汰PRV 潛伏感染的攜帶者。雙抗體夾心ELISA 方法是檢測抗原最常用的方法,且該方法特異性強、敏感、易于操作,并且經(jīng)濟、省時,尤其適合大規(guī)模的流行病學調(diào)查。gB糖蛋白是PRV 包膜的主要成分,由913個氨基酸(aa)組成,屬于高度保守的皰疹病毒糖蛋白,介導病毒的侵入過程和細胞至細胞的傳播,在誘導保護性免疫中起重要作用,被認為是制備亞單位疫苗最有希望的備選蛋白基因[20-21]。因此,本研究應用PCR 技術擴增出PRV gB基因,并將克隆的目的片段連接到表達載體,以表達純化的重組蛋白為抗原制備單克隆抗體,建立檢測PRV 抗原的雙抗體夾心ELISA 方法,并對吉林省某地區(qū)豬群感染PRV 的情況進行了流行病學調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 PRV 毒株、菌株及載體PRV 毒株分離于吉林省某發(fā)病豬場,分離毒株進一步鑒定后命名為PRV-JL15株,－80℃低溫冰箱保存；DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自天根生化科技(北京)有限公司；p GEX-4T-1原核表達載體,由本實驗室保存。

1.2 PRV gB基因的擴增以天根生化科技(北京)有限公司的基因組提取試劑盒,從PRV-JL15毒株感染的細胞中提取DNA 模板,利用上海生工生物工程有限公司合成的引物進行PCR 擴增gB 基因。引 物 序 列gB-UP：5′-CGCGGATCCCGTGCTCTTCAAGGAGAACATC-3′(Bam H Ⅰ)；gB-DN：5′-CCGGAATTCGAGTCCAGGTCGATGGGGTAG-3′(Eco RⅠ)。

1.3 原核表達質(zhì)粒的構建以及重組蛋白的表達與純化將擴增的DNA 片段以Bam HⅠ和EcoRⅠ酶切后,連接到pGEX-4T-1載體的Bam HⅠ/EcoRⅠ酶切位點。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后,挑取單一菌落,培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒p GEX-4T-1-B。通過雙酶切鑒定和測序驗證后的重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中,獲得表達菌株。挑取單一菌落培養(yǎng)至對數(shù)生長期(D600＝0.6～0.8),加入IPTG 至終濃度1 mmol/L,于37℃誘導表達3 h,然后以SDSPAGE電泳檢測重組蛋白的表達及可溶性。

蛋白的純化按照本實驗室優(yōu)化的蛋白純化方法進行[22]。培養(yǎng)收集的細菌以PBS洗滌后,反復凍融3次,冰浴條件下超聲波裂解菌體,待溶液變透亮時,用1.5 mol/L尿素清洗沉淀3次,最后用8 mol/L尿素溶解沉淀。純化后的蛋白利用碧云天BCA蛋白濃度測定試劑盒測定濃度后分裝,－80℃凍存。

1.4 單克隆抗體的制備與特性鑒定純化的重組蛋白與等體積的弗氏佐劑混合充分乳化后,免疫BALB/c小鼠。將100μL(120μg)抗原分點注射到6～8周齡的BALB/c雌性小鼠的背部皮下,14 d和28 d后,以相同劑量加強免疫2次。免疫小鼠血清效價達到1∶100 000以上時,于融合前3 d,直接腹腔注射120μg 抗原,之后取其脾細胞與骨髓瘤SP2/0細胞以5∶1的比例進行融合。待雜交瘤細胞長至孔底1/3 以上時,取培養(yǎng)液上清用間接ELISA 方法進行檢測,免疫小鼠血清作為陽性對照,SP2/0細胞培養(yǎng)上清作為陰性對照,篩選出陽性雜交瘤細胞。多次亞克隆篩選后擴大培養(yǎng)注入小鼠腹腔,10 d 后小鼠明顯腹脹時,取其腹水并純化,－80℃保存。

單克隆抗體特異性的鑒定采用間接ELISA 方法進行。以100 ng/孔包被純化后的單抗,加入PRV、豬瘟病毒(CSFV)和豬戊型肝炎病毒(HEV)抗原作為待檢抗原,同時以純化后的gB 重組蛋白作為陽性對照,緩沖液PBS作為陰性對照,每種病毒選取3個樣品,每個樣品重復3次。

1.5 PRV多克隆抗體的制備與標記以同樣的免疫方法將1.8 mg的免疫原多點注射到新西蘭大白兔的背部皮下,經(jīng)過2次加強免疫,兔血清效價達標后,采用心臟采血法獲得高免血清,應用郭春祥等[23]過碘酸鈉氧化法對純化后的多克隆抗體進行HRP標記,－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 夾心ELISA方法的建立

1.6.1 最佳捕獲抗體及酶標抗體工作濃度的確定 以單克隆抗體作為捕獲抗體,辣根過氧化物酶標記的兔源多克隆抗體作為酶標抗體,建立檢測PRV抗原的雙抗體夾心ELISA 方法。最佳捕獲抗體及酶標抗體的濃度采用方陣滴定法確定。用包被液將單抗分別按2.00,1.50,1.25,1.00,0.75 mg/L 的質(zhì)量濃度進行稀釋,酶標反應板每孔加入100μL,4℃包被過夜。5%脫脂奶粉封閉37℃1 h,洗板后加入1∶5預處理糞便樣品100μL,洗滌3次后分別加入1∶200,1∶400,1∶800,1∶1 000,1∶1 600,1∶2 000 系列稀釋的HRP 標記的多抗。每種組合3個重復,比較各重復的平均值,取D490值在1.0 左右,P/N 值最大的孔所對應的單抗包被濃度和多抗稀釋度為捕獲抗體與酶標抗體的最佳工作濃度。

1.6.2 夾心ELISA 條件的優(yōu)化 采用已確定的單抗最佳包被濃度,將單抗分別按37℃1 h、37℃2 h、4℃過夜等3種不同條件包被酶標板,每種條件3個重復,其他反應條件不變,進行夾心ELISA 試驗,從而確定最佳包被條件。以同樣的方法確定最佳封閉液、最佳封閉時間、酶標二抗的最佳作用時間和最佳顯色時間。

1.6.3 夾心ELISA 判定標準的確定 根據(jù)以上優(yōu)化出的夾心ELISA 的試驗條件,檢測40份PRV 陰性的糞樣,計算陰性樣品D490值的平均值()和標準差(s),根據(jù)統(tǒng)計學原則,當樣本的D490值≥+3s時判定為陽性,否則為陰性,從而確定本方法檢測樣品陰陽性臨界值。

1.6.4 夾心ELISA 特異性試驗 應用建立的雙抗體夾心ELISA 方法對豬瘟、豬圓環(huán)病毒病和豬戊型肝炎病陽性糞液進行特異性檢測,同時設立PRV 陽性、陰性對照。每種病毒選取4個樣品,每個樣品重復3次,確定方法的特異性。

1.6.5 夾心ELISA 敏感性試驗 應用夾心ELISA方法和擴增gB基因的PCR 方法,分別檢測30份待檢糞樣,比較2種方法檢測結(jié)果的符合率。

1.6.6 夾心ELISA 重復性試驗 取不同批次或同一批次不同種類的酶標板,分別檢測PCR 驗證的PRV 陽性糞便樣品和陰性糞便樣品,進而計算出不同批次酶標板的組間變異系數(shù),以及同一批次不同酶標板間的組內(nèi)變異系數(shù)。

1.7 吉林省PRV流行病學的調(diào)查應用建立的雙抗體夾心ELISA 方法,檢測采集吉林省不同地區(qū)的451份豬糞便樣品,其中育肥豬糞樣71份、妊娠母豬糞樣163份、產(chǎn)房母豬糞樣87份、保育仔豬糞樣130份,確定PRV 帶毒率。

2 結(jié)果

2.1 原核表達質(zhì)粒的構建以PRV 的DNA 為模板,利用合成的gB特異性引物進行PCR 擴增,得到一條555 bp的DNA 片段(圖1A),經(jīng)Bam HⅠ和EcoRⅠ酶切純化后,將其連接到p GEX-4T-1 載體的Bam HⅠ/EcoRⅠ酶切位點。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后,挑取菌落,提取重組質(zhì)粒p GEX-4T-1-B。雙酶切鑒定結(jié)果如圖1B 所示,出現(xiàn)了預期大小約5 000 bp的片段和略大于500 bp的片段。質(zhì)粒測序結(jié)果表明,目的片段沒有突變、移碼,表明原核表達質(zhì)粒構建正確,重組質(zhì)粒命名為p GEX-4T-1-B。

圖1 PRV-gB基因的擴增及重組質(zhì)粒p GEX-4T-1-B 的雙酶切鑒定 A.PRV-gB基因的擴增結(jié)果(1.陰性對照；2.PRV gB基因片段擴增產(chǎn)物；M.DL2000 DNA Marker)；B.構建重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-B的Bam HⅠ/EcoRⅠ酶切鑒定結(jié)果(1.Bam HⅠ和EcoRⅠ雙酶切產(chǎn)物；M.DL5000 DNA Marker)

2.2 重組蛋白的表達與純化將重組陽性菌培養(yǎng)至對數(shù)生長中期D600＝0.7,然后加入IPTG 繼續(xù)37℃誘導,3 h后收集菌液與等體積的上樣緩沖液混合,沸水中加熱10 min,室溫冷卻后進行SDSPAGE電泳。凝膠經(jīng)染色、脫色后顯示,誘導菌比未誘導菌明顯多一條約46 000的蛋白條帶(圖2),與預期結(jié)果一致。采取尿素純化包涵體的方法純化蛋白,用BCA 法測定蛋白質(zhì)量濃度為2.4 g/L。

圖2 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測 1.誘導菌；2.未誘導菌；M.蛋白相對分子質(zhì)量標準

2.3 單克隆抗體的制備與鑒定小鼠三免后,選取血清效價最高的1號小鼠脾細胞與SP2/0 細胞進行融合試驗(圖3),應用間接ELISA 方法篩選出19株分泌抗體的雜交瘤細胞株,再經(jīng)有限稀釋法進行亞克隆篩選、GST 標簽及穩(wěn)定性的檢測,最終獲得1株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細胞株8G3。應用佰奧通單抗Ig 類亞類鑒定試劑盒判斷出抗體亞型為IgG2a,BCA 法測其濃度為2 g/L。采用間接ELISA 方法對單克隆抗體的特異性進行鑒定,如圖4所示,8G3細胞株制備的單克隆抗體不與CSFV、HEV 抗原反應,僅與PRV 抗原發(fā)生特異性免疫反應,具有良好的特異性。

圖3 免疫小鼠血清抗體效價

圖4 單抗特異性檢測

2.4 多克隆抗體的制備與標記采用郭春祥等[23]的方法對純化的多克隆抗體進行HRP標記來制備酶標抗體,應用微觀吸光、熒光光度計分別測得280 nm 和403 nm 波長的D值,經(jīng)計算,IgG 含量為1.323 g/L,HRP含量為0.611 g/L,克分子比值為1.847,HRP標記率為58.95%,表明標記效果良好。

2.5 夾心ELISA方法的建立及判定標準方陣滴定法確定捕獲抗體最佳包被質(zhì)量濃度為1.25 mg/L,酶標抗體最佳稀釋倍數(shù)為1∶1 600(表1)。確定的最佳反應條件為4℃過夜包被單抗,5%脫脂奶粉37℃封閉1 h,酶標二抗37℃工作45 min,顯色液室溫避光反應10 min。

表1 捕獲抗體與酶標抗體不同條件下P/N 的比值

對40份PRV 陰性的糞樣進行夾心ELISA 檢測,確定陰性樣品D值的平均值()為0.185 6,標準差(s)為0.021 6。根據(jù)統(tǒng)計學原則,當樣本的D490值≥+3s時,可以在99.9%的水平上判定為陽性；所以,夾心ELISA 檢測樣品的陰陽性臨界值為0.250 4。

2.5.1 夾心ELISA 特異性試驗 如圖5所示,應用建立的雙抗體夾心ELISA 方法對豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環(huán)病毒2 型(PCV2)和豬戊型肝炎病毒(HEV)陽性糞液進行檢測,結(jié)果均不反應,表明所建立的夾心ELISA 方法具有良好的特異性。

圖5 夾心ELSIA 特異性檢測

2.5.2 夾心ELISA 敏感性試驗 應用PCR 方法檢30份糞樣,其中陽性3例,陰性27例,而應用夾心ELISA 方法檢測糞樣得到了相同的結(jié)果(表2)。2種方法檢測的結(jié)果一致,表明夾心ELISA 方法具有較高的敏感性。

表2 PCR 方法與夾心ELISA 方法試驗結(jié)果的比較

2.5.3 夾心ELISA 重復性試驗 利用同一批次不同種類的酶標板(表3)和不同批次的酶標板(表4)分別檢測PCR 驗證的PRV 陽性糞便樣品和陰性糞便樣品,結(jié)果顯示,各個樣品的變異系數(shù)均小于6%,說明建立的夾心ELISA 方法具有很好的組內(nèi)重復性和組間重復性。

表3 同一批次重復性的檢測 D 490值

表4 不同批次重復性的檢測 D 490值

2.6 吉林省某地區(qū)PRV流行病學的調(diào)查應用建立的雙抗體夾心ELISA 方法對吉林省某地區(qū)451份豬糞便樣品進行檢測,結(jié)果表明該地區(qū)的豬場存在不同程度的感染,且妊娠母豬感染PRV 野毒的陽性率較高(表5)。

表5 吉林省某地區(qū)豬群感染PRV 的檢測

3 討論

偽狂犬病(PR)是由PRV 引起的,具有傳播快、流行廣、致死率高等特點,對畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,嚴重阻礙了我國養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展?？刂坪透齈R 除了安全有效的疫苗,快速診斷和檢測出感染豬也是非常重要的措施。ELISA 是以免疫學反應為基礎,將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術。此項技術自20世紀70年代初問世以來,發(fā)展十分迅速,目前已被廣泛應用于生物學和醫(yī)學科學的許多領域。雙抗體夾心ELISA 法則是檢測抗原最常用的方法,但對抗體的特異性和親和性要求較高,因而本試驗中的包被抗體和酶標抗體分別取自不同種屬的動物。試驗將鼠源單抗作為捕獲抗體,僅能識別某一特定抗原位點,減少了非特異性結(jié)合造成的假陽性；將兔源多抗作為檢測抗體,與多種抗原表位結(jié)合,避免漏檢,放大信號；同時,優(yōu)化了雙抗體夾心ELISA 試驗條件,確定了檢測樣品陰陽性臨界值為0.250 4；建立了特異、敏感、可重復性的雙抗體夾心ELISA 方法。

為了解近年來吉林省某地區(qū)豬場中PRV 野毒的感染情況,應用建立的雙抗體夾心ELISA 方法對該地區(qū)的豬糞便樣品進行了檢測,結(jié)果表明,PRV平均感染率為9.3%,低于2000年吉林省獸醫(yī)科學研究所對PRV 血清學調(diào)查的臨床發(fā)病率(12%)[24],也低于初小輝[25]2011 年調(diào)查的吉林省各地區(qū)的抗體平均陽性率22.66%,說明該地區(qū)采取免疫、監(jiān)測以及淘汰等綜合防制措施對PRV 野毒感染的控制取得了顯著效果。此次對不同日齡、不同性別的豬糞便進行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)妊娠母豬PRV 陽性率11.7%,高于產(chǎn)房母豬、保育仔豬以及育肥豬,表明母豬的帶毒現(xiàn)象仍然存在,是導致母豬繁殖障礙的重要原因之一,應當引起高度重視。