路佳琦,張榮民,程 珂,何 冰,廖曉萍,孫 堅(jiān),劉雅紅,方亮星 (華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 國(guó)家獸醫(yī)

微生物耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室/廣東省獸藥研制與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州510642)

奇異變形桿菌屬于腸桿菌科,為革蘭陰性菌,菌體無芽孢和莢膜、有鞭毛和菌毛,其廣泛分布于人和動(dòng)物腸道、動(dòng)物糞便及臨床標(biāo)本,是導(dǎo)致人和動(dòng)物感染的重要條件致病菌[1-2]。臨床上針對(duì)奇異變形桿菌引起的感染性疾病多采用抗生素治療,但由于抗生素的大量使用,不斷有新的耐藥菌株出現(xiàn),給奇異變形桿菌感染的治療帶來了極大挑戰(zhàn)。

磷霉素于1969年首次發(fā)現(xiàn),是通過培養(yǎng)土壤鏈霉菌獲得的天然廣譜抗生素[3],用于治療非并發(fā)性尿路感染[4-6]和多種混合感染[3,7]。隨著耐藥性問題日益嚴(yán)重,由于磷霉素對(duì)多重耐藥革蘭陰性菌具有良好抗菌活性,且仍然具有較低的耐藥率,在許多國(guó)家重新引起人們的重視。磷霉素與磷酸烯醇式丙酮酸的分子結(jié)構(gòu)相似,因而可以競(jìng)爭(zhēng)細(xì)菌轉(zhuǎn)移酶干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成從而起到殺菌作用[8],而細(xì)菌對(duì)磷霉素的主要耐藥機(jī)制是通過染色體編碼而不是質(zhì)粒的水平傳播[9-11]。然而,隨著日本學(xué)者在產(chǎn)CTXM 大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的磷霉素耐藥基因fosA3[12],該基因已成為我國(guó)腸桿菌尤其是大腸桿菌中最為流行的質(zhì)粒介導(dǎo)的磷霉素耐藥基因[13]。

盡管磷霉素在我國(guó)沒有批準(zhǔn)用于動(dòng)物,然而在食品動(dòng)物源腸桿菌尤其是大腸桿菌出現(xiàn)磷霉素耐藥菌,fosA3是介導(dǎo)其耐藥的主要機(jī)制[14-15]。在中國(guó),腸桿菌科細(xì)菌中抗生素的高耐藥率在各種食源動(dòng)物中被頻繁報(bào)道,食源動(dòng)物被認(rèn)為是攜帶各種抗生素耐藥基因的載體[16-17]。在中國(guó)、西歐和東南亞的一些國(guó)家,鴿子通常被視為食源動(dòng)物,對(duì)抗菌藥物的使用有所限制[18],因而,鴿子也被認(rèn)為是耐藥革蘭陰性菌的潛在儲(chǔ)存庫(kù)。本研究旨在調(diào)查鴿源奇異變形桿菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的磷霉素耐藥基因流行情況及傳播特征,以期為控制禽源多重耐藥奇異變形桿菌的傳播提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源從廣東省佛山市某鴿場(chǎng)共采集72份樣品,采集對(duì)象為鴿子及周圍環(huán)境,包括健康鴿子糞便40份、病死鴿盲腸內(nèi)容物9份及心包液7份、鴿子舍周圍污水10份、灰塵4份及蒼蠅2份。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株沙門菌Braenderup血清型PFGE Marker H9812,E.coliC600,E.coliATCC25922,均為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 培養(yǎng)基、主要抗菌藥物及試劑MH 瓊脂(Luria-Bertani agar)、麥康凱瓊脂(MacConkey agar)、LB肉湯(Luria-Bertani broth)及MH 肉湯(Muller-Hinton broth)均購(gòu)于廣州環(huán)凱微生物有限公司；氨芐西林(ampicillin,AMP),頭孢噻肟(cefotaxime,CTX),阿米卡星(amikacin,AMK),硫酸慶大霉素(gentamicins,GEN),硫酸鏈霉素(streptomycin,STR),磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole,SMZ),甲氧芐啶(trimethoprim,TMP),鹽酸四環(huán)素(tetracycline,TET),鹽酸環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP),氯霉素(chloramphenicol,CHL),氟苯尼考(florfenicol,FFC),硫酸黏菌素(colistin sulphate,CS),替加環(huán)素(tigecycline,TIG),美羅培南(meropenem,MEM),磷霉素(fosfomvcin,FOS),購(gòu)于源葉生物公司；6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate)無水乙醇,70%甲酸,乙腈,1 mol/L Tris-HCl,0.5 mol/L EDTA,20%十二烷基磺酸鈉溶液,10×TE Buffer,1×TE Buffer,細(xì)胞裂解液,蛋白酶K,0.5×TBE,市購(gòu)。

1.4 細(xì)菌的分離、鑒定與磷霉素耐藥基因的檢測(cè)

樣品的采集方法是用無菌棉簽蘸取相應(yīng)部位表面,再將棉簽拭子放進(jìn)提前準(zhǔn)備好的90%生理鹽水中,編號(hào)保存。用無菌棉簽將生理鹽水稀釋液均勻涂布于麥康凱板并編號(hào),37℃恒溫培養(yǎng)12～16 h,挑取2～4個(gè)不同形態(tài)單菌落并保菌備用。通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)法對(duì)分離得到的細(xì)菌進(jìn)行菌種鑒定。對(duì)分離到的奇異變形桿菌進(jìn)行質(zhì)粒介導(dǎo)的磷霉素耐藥基因fosA3、fosC2以及fosA的檢測(cè),采用文獻(xiàn)[19]已報(bào)道的引物,由廣州擎科測(cè)序公司合成。

1.5 藥敏試驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法測(cè)定奇異變形桿菌最小抑菌質(zhì)量濃度,測(cè)定磷霉素時(shí)要中加入6-磷酸葡萄糖,濃度為25 mg/L,根據(jù)CLSI-2018和EUCAST-2018標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判斷。

1.6 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)參照美國(guó)CDC Pulse Net的標(biāo)準(zhǔn)PFGE操作規(guī)程,并根據(jù)實(shí)際優(yōu)化試驗(yàn)條件。奇異變形桿菌和標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812制備的膠塊分別用SfiⅠ和XbaⅠ進(jìn)行酶切后,置于CHEF-DR Ⅲ System (Bio-Rad Laboratories,USA),在14℃,6 V/cm,2.2～54.2 s,19 h的條件下進(jìn)行電泳,獲取圖像用Bio Numerics軟件分析。

1.7 全基因組測(cè)序與核心基因組進(jìn)化樹分析挑取不同PFGE 譜型攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)磷霉素耐藥基因的奇異變形桿菌,采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取其基因組DNA,送至北京諾禾致源生物科技股份有限公司測(cè)序；采用細(xì)菌全基因組PE150 策略,構(gòu)建Illumina PE(350 bp)文庫(kù)；利用Illumina平臺(tái)測(cè)序,de novo組裝后分析生物信息。從GenBank篩選不同地區(qū)、來源與采集時(shí)間的奇異變形桿菌與本研究中全基因組測(cè)序菌株構(gòu)建核心基因組進(jìn)化樹。使用SPAdes拼接二代數(shù)據(jù),Parsnp分析進(jìn)化樹,通過在線軟件(http：//www.evolgenius.info/evolview/)對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行標(biāo)注和美化。

1.8 接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)與I-CeuⅠPFGE 和Southern雜交接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)通過濾膜接合法,將fosA3陽性奇異變形桿菌作為供體菌,標(biāo)準(zhǔn)菌株E.coliC600作為受體菌,在含有256 mg/L 磷霉素和200 mg/L鏈霉素的麥康凱板上挑選接合子,再通過PCR 與ERIC-PCR 進(jìn)一步驗(yàn)證。I-CeuⅠPFGE 試驗(yàn)方法參考1.6方法,注意調(diào)整D值至1.8,待測(cè)菌小膠塊用I-CeuⅠ酶37℃酶切3 h。Southern雜交按High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ試劑盒使用說明書操作,制作23S r RNA 和fosA3探針并分別進(jìn)行雜交。

1.9 基因環(huán)境分析使用BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對(duì)分析序列,找到相應(yīng)參考序列,設(shè)計(jì)并合成引物,采用PCR-mapping方法研究質(zhì)粒介導(dǎo)的磷霉素耐藥基因的基因環(huán)境,使用DNAStar系列軟件和BLAST 進(jìn)一步比較分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離、鑒定與質(zhì)粒介導(dǎo)的磷霉素耐藥基因的檢出情況將鴿場(chǎng)采集的72份樣品涂板培養(yǎng),根據(jù)單菌落形態(tài)和革蘭染色,從每個(gè)樣本中挑選1～3個(gè)菌株,共獲得151 株革蘭陰性菌。通過MALDI-TOF-MS法進(jìn)行菌種鑒定,結(jié)果共得到108株大腸桿菌,4株肺炎克雷伯菌,22株奇異變形桿菌,17株其他菌種。其中,不同來源樣品奇異變形桿菌的檢出率為0.0%～53.3%,病死鴿心包液中檢出率最大(53.3%),總檢出率為14.6%。20株奇異變形桿菌中有16株檢出fos A3,fosC2以及fosA均無檢出(表1)。

表1 細(xì)菌的分離、鑒定與奇異變形桿菌檢出情況表 株

2.2 fosA 3陽性菌的藥敏試驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法對(duì)16株fos A3陽性奇異變形桿菌進(jìn)行13種抗生素的敏感性檢測(cè),結(jié)果(圖1)顯示,所有fosA3陽性菌株均對(duì)磷霉素耐藥(MIC＞256 mg/L)；此外還對(duì)氨芐西林、頭孢噻肟、四環(huán)素、替加環(huán)素、黏菌素、環(huán)丙沙星、氯霉素以及氟苯尼考等8種抗菌藥物耐藥。另外還有3株菌對(duì)慶大霉素耐藥。然而所有fos A3陽性菌株均對(duì)磺胺類藥物、阿米卡星及美羅培南3種藥物敏感。

2.3 PFGE分型為鑒定本研究fosA3陽性奇異變形桿菌之間的親緣關(guān)系,對(duì)16株fosA3陽性奇異變形桿菌進(jìn)行PFGE 分型,所得結(jié)果(圖1)應(yīng)用Bio Numerics軟件分析,將PFGE 譜型相似性大于80%的菌株視為同一克隆群,16株fosA3陽性奇異變形桿菌僅分為2個(gè)群,各包含8株菌。結(jié)果表明,鴿場(chǎng)內(nèi)fosA3陽性奇異變形桿菌存在克隆傳播現(xiàn)象。

圖1 16株fosA 3陽性奇異變形桿菌PFGE分型、菌株來源和耐藥表型

2.4 全基因組測(cè)序與核心基因組進(jìn)化樹截至目前,GenBank上已經(jīng)上傳了144株奇異變形桿菌的全基因組數(shù)據(jù),包括從醫(yī)院病人來源的菌株有85株,動(dòng)物源6株,環(huán)境源3株以及剩余未知來源50株。通過比對(duì)分析,僅發(fā)現(xiàn)3 株fosA3 陽性菌株

(ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenBank/bacteria/Proteus_mirabilis/)。為了分析本研究fos A3陽性奇異變形桿菌和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中奇異變形桿菌的親緣關(guān)系,從本研究16株fosA3 陽性奇異變形桿菌的2個(gè)PFGE譜型中各挑選1株菌進(jìn)行全基因組測(cè)序,再?gòu)?44株菌中隨機(jī)挑選出不同地區(qū)、來源以及采集時(shí)間的菌株共35株,包括3株fosA3陽性以及32株fosA3陰性菌株(表2)。本研究通過Parsnp軟件比對(duì)上述獲得37株菌的全基因組序列,刪除重排或插入序列,獲得這37株菌的核心基因組；經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)共包含76 182個(gè)SNPs,再根據(jù)核心基因組SNPs構(gòu)建這37株菌的進(jìn)化樹。結(jié)果可分為2個(gè)分支(圖2)：第1個(gè)分支包含9株菌,菌株來源于亞洲、歐洲和北美洲,包括人和動(dòng)物；第2個(gè)分支包含28株菌,菌株來源于五大洲,包括動(dòng)物、環(huán)境和人。值得注意的是GenBank下載的3株人源fosA3陽性奇異變形桿菌核心基因組僅有2 124 個(gè)SNPs,本研究發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物源奇異變形桿菌(X4-2)和其中1株人源菌株(SAMN03154481)共有5 283個(gè)SNPs。

2.5 接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)與I-CeuⅠPFGE 和Southern雜交

2.5.1 接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn) 16株fosA3陽性奇異變形桿菌作為供體菌,標(biāo)準(zhǔn)菌株E.coliC600 作為受體菌,通過濾膜接合方法進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移,多次嘗試,均未成功,表明fosA3基因可能位于不可接合型質(zhì)粒上或染色體上。

表2 核心基因組進(jìn)化樹菌株信息

圖2 37株奇異變形桿菌核心基因組分析

2.5.2 I-CeuⅠPFGE 和Southern雜交 為了進(jìn)一步對(duì)陽性菌株中fosA3 基因進(jìn)行定位,選取不同PFGE譜型的2株fosA3陽性奇異變形桿菌,對(duì)其染色體進(jìn)行I-CeuⅠ酶切,通過PFGE 電泳后分別與23S r RNA 和fosA3 探針雜交確定基因位置。Southern雜交結(jié)果顯示出雜交條帶,表明fosA3定位在奇異變形桿菌的染色體上(圖3)。

圖3 奇異變形桿菌中fosA 3基因定位 A.I-CeuⅠPFGE；B.23S r RNA 雜交；C.fosA 3雜交。M.H9812 Marker；1.菌株X4-2；2.菌株X1-3-1

2.6 fosA 3基因環(huán)境分析通過PCR-mapping的方法,分析2株不同PFGE 譜型菌株中fosA3基因環(huán)境,結(jié)果顯示,所有陽性菌株中均檢測(cè)到IS26-orf3-Δorf2-orf1-fosA3-IS26 的 遺 傳 結(jié) 構(gòu),fosA3基因上下游各有一個(gè)插入元件IS26,暗示其在fosA3的轉(zhuǎn)移中起著重要作用(圖4)。將獲得的fosA3基因環(huán)境序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì),發(fā)現(xiàn)17條序列(表3)與本研究fosA3基因環(huán)境完全相同,均含有IS26-orf3-Δorf2-orf1-fosA3-IS26的遺傳結(jié)構(gòu),這17條核酸序列來源于大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、弗氏檸檬酸桿菌及沙門菌中,菌株樣品來源廣泛,包括人、豬、雞、鴨、鳥及食物等。

圖4 奇異變形桿菌中fosA 3基因環(huán)境

表3 GenBank中與奇異變形桿菌fosA 3基因環(huán)境相同菌株

3 討論

自2010年WACHINO 等[12]首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的磷霉素耐藥基因fosA3后,國(guó)內(nèi)外不斷有fosA3基因檢出的報(bào)道,但關(guān)于奇異變形桿菌中fosA3基因檢出情況的報(bào)道很少。2017年HE等[20]在患病雞組織中分離得到7株fos A3陽性奇異變形桿菌,檢出率為16.3%,并首次報(bào)道了fosA3和CTX-M 基因一起整合到奇異變形桿菌染色體上；2018年LEI等[21]從中國(guó)四川省腹瀉豬糞便拭子中分離得到的1株fos A3陽性奇異變形桿；2018年MAEYAMA 等[22]從487株貓和狗的尿道臨床分離株中分離得到56株奇異變形桿菌,但未檢測(cè)到fosA3基因。本研究對(duì)廣東省佛山市某鴿場(chǎng)采集的72份樣品中分離到的151株革蘭陰性菌進(jìn)行了磷霉素耐藥基因的調(diào)查,檢測(cè)到16 株fosA3陽性奇異變形桿菌,檢出率為14.6%,與HE 等[20]研究中fosA3陽性奇異變形桿檢出率相近。本研究報(bào)道鴿子攜帶fosA3陽性奇異變形桿菌,鴿子具有較強(qiáng)的遷徙能力,可對(duì)公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重威脅。

質(zhì)粒介導(dǎo)的磷霉素耐藥基因fosA3 主要存在于腸桿菌科的大腸桿菌和肺炎克雷伯菌,且常與blaCTX-M、rmtB等耐藥基因在不同的質(zhì)粒上發(fā)生水平轉(zhuǎn)移[12]。目前,我國(guó)動(dòng)物源腸桿菌尤其是大腸桿菌中主要是通過FII型及HI2 型質(zhì)粒介導(dǎo)fosA3傳播,且插入元件IS26在介導(dǎo)該基因的傳播上起到重要作用[23]。然而,本研究中fosA3均位于奇異變形桿菌染色體上,主要通過菌株的克隆傳播介導(dǎo)fosA3在鴿場(chǎng)不同來源包括鴿子、污水和蒼蠅等之間傳播。通過進(jìn)一步對(duì)奇異變形桿菌染色體上的fos A3基因環(huán)境進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該基因位于插入序列IS26介導(dǎo)的復(fù)合轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)中。通過比較本研究獲得的fosA3基因環(huán)境與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),發(fā)現(xiàn)該復(fù)合轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)首次在2010年中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)的人源樣品的克雷伯菌屬中發(fā)現(xiàn)[24],并且在不同種屬細(xì)菌染色體(CP029242)和質(zhì)粒[25]上均有存在,表明IS26介導(dǎo)的復(fù)合轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)在介導(dǎo)fos A3的散播上起重要作用。

核心基因組進(jìn)化樹顯示,菌株在2個(gè)簇中地理和宿主來源大致相同,表明這這些菌株并未在某一地區(qū)形成單獨(dú)進(jìn)化族群,推測(cè)奇異變形桿菌在不同地區(qū)進(jìn)化進(jìn)程相似。在5株fosA3陽性奇異變形桿菌中,3 株人源的SNP 較另外2 株(1 株人源,1株鴿源)少,表明fosA3陽性奇異變形桿菌在相同宿主中親緣關(guān)系較近。在建樹的37株奇異變形桿菌中,本研究的1株fosA3陽性奇異變形桿菌(X4-2)僅與1株人源菌株親緣關(guān)系最近,推測(cè)這株菌可能在人和動(dòng)物中相互傳播。

本研究調(diào)查了鴿源奇異變形桿菌中磷霉素耐藥基因fosA3的流行與傳播特征,發(fā)現(xiàn)奇異變形桿菌中fosA3 存在較高的流行性,且主要位于染色體上。fosA3基因主要通過菌株的克隆傳播在多種來源樣品之間進(jìn)行傳播。此外,IS26-fosA3-IS26 組成的復(fù)合轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)很可能介導(dǎo)該基因在不同腸桿菌的質(zhì)粒和染色體之間轉(zhuǎn)移,從而加速fosA3 的散播。