季 航 周明兵 蔣政勤 鄭 浩 徐芷馨

(1浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 311300;2 浙江農(nóng)林大學(xué),浙江省竹資源與高效利用協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江 杭州 311300)

植物L(fēng)TR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子主要由長末端重復(fù)序列(long terminal repeat,LTR)、引物結(jié)合位點(diǎn)(primer binding site,PBS)、種屬特異抗原(retrotransposon gag protein,GAG)基因、聚合酶(polymerase,POL)基因、多嘌呤序列(polypurinetrait,PPT)等構(gòu)成[1]。其中LTR為末端反向重復(fù)序列,包含了轉(zhuǎn)錄的起始和終止信號,通常含有較為豐富的順式調(diào)控元件,不編碼蛋白質(zhì),PBS位于5′端LTR 下游,當(dāng)轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座時(shí),與tRNA 結(jié)合引導(dǎo)cDNA 負(fù)鏈的生成,GAG、POL基因?qū)儆诰幋a區(qū)基因,編碼與轉(zhuǎn)座子復(fù)制和轉(zhuǎn)座有關(guān)的酶類,結(jié)構(gòu)與反轉(zhuǎn)錄的病毒結(jié)構(gòu)相似,PPT位于3′端LTR上游,作為引物引導(dǎo)第二條cDNA 鏈的合成[1-3]。POL基因中包含蛋白質(zhì)水解酶基因(pepsin-like aspartate proteases,PR)、反轉(zhuǎn)錄酶基因(reverse transcriptases,RT)、RNA 酶基因(ribonuclease H,RH)及整合酶基因(integrase,INT)[4]。依據(jù)POL基因中所編碼的蛋白質(zhì)順序,LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子又分為Ty1-copia和Ty3-gypsy 2個(gè)超家族[5]。這2 類轉(zhuǎn)座子的區(qū)別主要體現(xiàn)在INT基因的位置上[6]。

研究表明,轉(zhuǎn)座子長末端重復(fù)序列便于設(shè)計(jì)引物且易于跟蹤,插入位點(diǎn)的多態(tài)性提供了生物突變的可能,基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入的分子標(biāo)記技術(shù)不斷被開發(fā)應(yīng)用[7]。Woodrow 等[8]根據(jù)香桃木基因組數(shù)據(jù)與Ty1-copia 家族Tmc1 轉(zhuǎn)座子的特征設(shè)計(jì)SSAP 標(biāo)記引物,很好地區(qū)分了4個(gè)香桃木的供試品種。煙草中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ttn1 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化至大豆植物中,利用插入突變的特性,將Ttn1 作為基因標(biāo)簽,研究大豆植物中編碼重要農(nóng)藝性狀的基因[9]。但有研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)已知的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子均處于靜默的狀態(tài),一部分由于在漫長的植物基因進(jìn)化過程發(fā)生基因突變,喪失了轉(zhuǎn)座功能,因此被稱為“退化的轉(zhuǎn)座子”;另一部分則是由于生物為維持基因的穩(wěn)定性通過DNA 甲基化的修飾調(diào)控手段而導(dǎo)致了轉(zhuǎn)座子沉默[10]。然而,當(dāng)植物所處環(huán)境條件發(fā)生改變時(shí),一些具備轉(zhuǎn)座條件的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子會被激活,發(fā)生轉(zhuǎn)座并插入靶基因中,且會影響插入位點(diǎn)相鄰基因的表達(dá)[11]。如Butelli 等[12]發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Copia-like可在血橙處于低溫條件下提升轉(zhuǎn)錄活性,影響調(diào)控花青苷相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)花青苷的合成,使果實(shí)呈紅色;蔡華等[13]研究小麥遠(yuǎn)緣雜交不親和的主效基因Kr1時(shí)發(fā)現(xiàn),玉米轉(zhuǎn)座子的插入導(dǎo)致在小麥及其與玉米的雜交組合中Kr1基因失活。

毛竹(Phyllostachys heterocyclacv.Pubescens)為禾本科剛竹屬單軸散生型常綠喬木狀竹類植物,是我國栽培歷史最悠久、面積最廣、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的竹種之一,因此探尋毛竹中的豐富基因資源具有重要意義[14]。目前已有關(guān)于毛竹基因表達(dá)調(diào)控方面的研究報(bào)道,王思雨等[15]在毛竹轉(zhuǎn)錄因子NF-Y 家族基因的鑒定和表達(dá)分析中發(fā)現(xiàn),該家族基因參與了毛竹根的生長、筍的發(fā)育、開花的調(diào)控、光合作用與葉綠體發(fā)育的調(diào)控。LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在毛竹基因組中含量豐富,在基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮了重要作用[16]。但關(guān)于毛竹LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座激活機(jī)制的研究尚鮮見報(bào)道。因此,獲得活性LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子,解析LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座激活機(jī)制,可作為竹子誘變育種的遺傳工具。通過對毛竹基因組上的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子篩選,克隆1條典型的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列,命名為PHRE8。本試驗(yàn)通過對PHRE8的結(jié)構(gòu)、分布進(jìn)化以及轉(zhuǎn)錄激活模式進(jìn)行系統(tǒng)研究,旨在探討PHRE8的活性激活機(jī)制,為挖掘出更多的毛竹活性轉(zhuǎn)座子資源奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用毛竹種子均取自廣西靈川縣同一株開花毛竹,從中選取大小一致、發(fā)育良好的種子并播種培育成實(shí)生苗。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 對照(CK)處理 將野生型毛竹種子先用蒸餾水沖洗1遍,再用70%酒精消毒30 s,無菌水沖洗3次。用無菌蒸餾水浸種24 h。隨后在黑暗條件(25℃)下置于無菌的雙層濾紙上萌發(fā),并保持充足的水分。種子萌發(fā)出胚芽后移栽至溫室的營養(yǎng)土中培養(yǎng),保持水分充足。營養(yǎng)土的配比為珍珠巖∶泥炭土∶蛭石=1 ∶1 ∶1。待長至5～6片葉子后取該處理實(shí)生苗的葉片迅速用液氮速凍,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA 甲基化抑制劑處理 將野生型毛竹種子先用蒸餾水沖洗1遍,再用70%酒精消毒30 s,無菌水沖洗3次。用濃度分別為50、150和250 μmol·L-1的5-氮雜胞苷浸種24 h。隨后在黑暗條件(25℃)下置于無菌的雙層濾紙上萌發(fā),期間持續(xù)使用5-氮雜胞苷處理。種子萌發(fā)出胚芽后移栽至溫室培養(yǎng),條件同對照處理。待長至5～6片葉子后取該處理實(shí)生苗的葉片迅速用液氮速凍,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 輻射、高鹽、高溫、低溫處理 選取長勢一致、發(fā)育良好的毛竹實(shí)生苗分別作以下處理:在輻射劑量率為1 Gy·min-1,輻射劑量分別為30、50和70 Gy的137Cs-γ射線下進(jìn)行輻射處理;用濃度分別為0.1、0.2和0.3 mol·L-1NaCl 溶液澆灌72 h;42℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h;4℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。分別取每處理實(shí)生苗的葉片迅速用液氮速凍,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PHRE8的生物信息學(xué)分析

1.3.1 結(jié)構(gòu)鑒定與元件分析 在http://www.bamboogdb.org/中下載毛竹基因組數(shù)據(jù),利用LTRharvest 軟件[17]鑒定毛竹基因組LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子;利用LTRdigestion 軟件[18]解析毛竹LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu),并剔除假陽性;利用cd-hit 軟件[19]分析毛竹LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)。根據(jù)毛竹LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)的完整性和拷貝數(shù),選取一個(gè)結(jié)構(gòu)完整的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子作為研究對象,將其命名為PHRE8。PHRE8 各個(gè)結(jié)構(gòu)域由LTRdigestion 軟件鑒定,并由此畫出PHRE8 及拷貝序列的結(jié)構(gòu)圖,由編碼區(qū)序列翻譯的氨基酸序列通過NCBI 上的BLAST 比對確認(rèn)。轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座誘導(dǎo)與啟動(dòng)子有關(guān),有活性的轉(zhuǎn)座子5′端LTR的U3 結(jié)構(gòu)域存在較多的順式調(diào)控元件,利用PlantCARE 在線軟件分析PHRE8的LTR 序列上的順式作用元件。

1.3.2 插入時(shí)間的估算 通過LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR 部分的相似性與宿主的核酸替換速率估算插入時(shí)間,在最初的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí),其兩端的L-LTR和LTR-R 由同一個(gè)模版合成,因此LTR 部分的同源性為100%,但是隨著植物基因組的變化,LTR 部分會發(fā)生不同程度的分化,導(dǎo)致同源性下降,根據(jù)宿主核酸的替換速率,計(jì)算插入時(shí)間[20]。利用MEGAX 軟件[21]比對PHRE8 兩端LTR 序列的同源性,求分化度K。插入時(shí)間計(jì)算公式如下:

式中,T為插入時(shí)間;K為分化度;r為LTR 序列的平均替換率,約1.3×10-8bp/年[22]。

1.3.3 進(jìn)化關(guān)系分析 在Gypsy Database(http://www.gydb.org/index.php/Main_Page)下載Ty3-gypsy 家族(Reina 亞家族的Gloin、Gimli和Reina,CRM 亞家族的Beetle1和Cereba,G-Rhodo 亞家族的G-Rhodo,Galadriel 亞家族的Tntom1和Galadriel,REM1 亞家族的REM1,Del 亞家族的Tma、Del和Retrosat-2)轉(zhuǎn)座子RT 氨基酸序列(表1),與PHRE8的RT 氨基酸序列比對,利用MEGA6 軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建進(jìn)化樹,分析其所屬轉(zhuǎn)座子家族。

表1 植物典型LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子信息Table1 The information of typical plant LTR retrotransposon

1.4 PHRE8的表達(dá)量檢測

1.4.1 毛竹基因RNA的提取 在低溫條件下,取各處理實(shí)生苗葉片,采用Trizol 法[23]提取RNA,利用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒[TaKaRa(日本)公司]反轉(zhuǎn)錄成cDNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析 對PHRE8的POL基因部分的RT、RH、INT保守區(qū)域段設(shè)計(jì)引物(表2)。以毛竹PheACT2-1[24]作為內(nèi)參基因,對在不同逆境脅迫下PHRE8的RT、RH和INT3個(gè)編碼域進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析。熒光定量PCR 反應(yīng)體系(10 μL):SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ5 μL,cDNA 0.8 μL,上下游引物各0.4 μL,無菌水3.4 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性7 min;95℃變性10 s,58℃退火10 s,72℃延伸15 s,30個(gè)循環(huán)。采用2-△△ct法[25]計(jì)算3個(gè)結(jié)構(gòu)域在不用處理下的基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PHRE8的序列分析

2.1.1PHRE8 及其拷貝的結(jié)構(gòu)PHRE8 全長5 297 bp,包括兩端的LTRs區(qū)域和1個(gè)較長的開放閱讀框(open reading frame,ORF)。右端LTR 長度為388 bp,左端LTR 長度為394 bp,結(jié)構(gòu)順序依次為5′-GAG-PR-RT-RH-INT-3′,屬于Ty3-copia 家族成員。編碼區(qū)含有4 244 bp的ORF,共編碼1 414個(gè)氨基酸。1 450～1 558 bp為GAG 核心區(qū),1 738～1 969 bp為PR核心區(qū),2 286～2 955 bp為RT 核心區(qū),3 099～3 444 bp為RH 核心區(qū),3 681～4 590 bp為INT 核心區(qū)。PBS 序列為5′-AATCTGGTATCAGAGCTAGATTCGG-3′,位于5′端LTR 下游。PPT的序列為5′-ACCGTACAGG TATCCTCAGTTGCAA-3′,位于3′端LTR上游。利用cd-hit 軟件鑒定出PHRE8的其他5個(gè)拷貝,將各個(gè)拷貝進(jìn)行命名(表3)。LTRdigestion 鑒定5個(gè)拷貝均具有完整的結(jié)構(gòu)(圖1)。

表2 引物序列Table2 The sequences of primers

表3 PHRE8 及其拷貝的命名Table3 Naming of PHRE8 and its copies

1.2.2PHRE8 及其拷貝的插入時(shí)間對比 比對PHRE8 兩端LTR 序列的同源性得到分化度K為0.032。利用相同方法得到PHRE8 其他5個(gè)拷貝的分化度K 依次為0.039(PHRE8-5)、0.038(PHRE8-4)、0.016(PHRE8 - 3)、0.047 (PHRE8 - 2)和0.051(PHRE8-1)。通過式(1)計(jì)算PHRE8的插入時(shí)間為123.07萬年前,PHRE8 其他5個(gè)拷貝插入時(shí)間依次為150.00萬年前(PHRE8-5)、146.15萬年前(PHRE8-4)、146.15萬年前(PHRE8 - 3)、180.77萬年前(PHRE8-2)和196.15萬年前(PHRE8-1)。比對其他拷貝PHRE8的插入時(shí)間較晚,因此PHRE8 理論上存在轉(zhuǎn)錄活性的可能性更高(圖2)。

1.2.3PHRE8的順式作用元件分析 通過在線軟件PlantCARE 分析了LTR 部分所包含的順式作用元件(圖3)。LTR 部分富含順式作用元件,如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域中常見的順式作用元件CAAT-box,光響應(yīng)順式作用元件GA-motif,光響應(yīng)順式作用元件TCCC-motif 等。

圖1 PHRE8 及其拷貝的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of PHRE8 and its copies

圖2 PHRE8 及其拷貝的插入時(shí)間Fig.2 Insertion time of PHRE8 and its copies

圖3 PHRE8 LTR 序列的順式作用元件分析Fig.3 The analysis of cis-regulatory motifs in LTR sequences of PHRE8

1.2.4PHRE8 進(jìn)化關(guān)系分析為分析PHRE8 與其他轉(zhuǎn)座子之間的相似性及進(jìn)化關(guān)系,利用其他已知典型的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的RT 區(qū)域氨基酸序列(表1)與PHRE8的RT 區(qū)域氨基酸序列進(jìn)行比對,構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)座子PHRE8 屬于Reina分支,其與Gloin的同源性最高(圖4)。

圖4 PHRE8的進(jìn)化關(guān)系分析Fig.4 Analysis of the evolutionary relationship of PHRE8

2.2 PHRE8 在不同脅迫處理下3個(gè)結(jié)構(gòu)域的表達(dá)模式

2.2.1 DNA 甲基化抑制劑處理對結(jié)構(gòu)域表達(dá)量的影響 由圖5可知,INT、RH和RT3個(gè)結(jié)構(gòu)域的表達(dá)量相對于野生型實(shí)生苗均顯著提升。RH與INT結(jié)構(gòu)域相對表達(dá)量在各濃度梯度均低于RT結(jié)構(gòu)域,且隨著DNA 甲基化抑制劑濃度的增加,RH和INT處理組間相對表達(dá)量均差異不顯著。隨著DNA 甲基化抑制劑濃度的增加,RT結(jié)構(gòu)域相對表達(dá)量增幅較大,在250 μmol·L-1濃度下的相對表達(dá)量顯著高于其他兩個(gè)濃度。

圖5 DNA 甲基化抑制劑處理下PHRE8結(jié)構(gòu)域的表達(dá)水平Fig.5 Expression level of domains of PHRE8 under DNA methylation inhibitor treatments

2.2.2 不同輻射處理對結(jié)構(gòu)域表達(dá)量的影響 由圖6可知,與野生實(shí)生苗相比,不同輻射處理各個(gè)結(jié)構(gòu)域的相對表達(dá)量均有所提升。其中INT和RT結(jié)構(gòu)域的相對表達(dá)量均在30 Gy處理下達(dá)到最大值,繼續(xù)增加輻射劑量其相對表達(dá)量呈下降趨勢,尤其在70 Gy處理下,相對表達(dá)量與野生實(shí)生苗均無顯著差異。RH結(jié)構(gòu)域的相對表達(dá)量隨著輻射劑量的增加呈緩慢上升的趨勢,但各輻射劑量下無顯著差異。

圖6 輻射處理下PHRE8 結(jié)構(gòu)域的表達(dá)水平Fig.6 Expression levels of domains of PHRE8 under irradiation treatments

2.2.3 低溫和高溫脅迫處理對結(jié)構(gòu)域表達(dá)量的影響 由圖7可知,在4℃低溫與42℃高溫脅迫處理下,3個(gè)結(jié)構(gòu)域相對表達(dá)量均顯著高于野生實(shí)生苗。在INT與RT結(jié)構(gòu)域中,42℃高溫脅迫處理下的相對表達(dá)量顯著高于4℃低溫脅迫處理。INT結(jié)構(gòu)域相對表達(dá)量在4℃低溫與42℃高溫脅迫處理下均高于RH和RT結(jié)構(gòu)域。此外,4℃低溫和42℃高溫處理下RH結(jié)構(gòu)域的相對表達(dá)量均最低,且處理間無顯著差異。

圖7 高溫和低溫處理下PHRE8 結(jié)構(gòu)域的表達(dá)水平Fig.7 Expression levels of domains of PHRE8 under high and low temperature treatments

1.2.4 高鹽脅迫處理對結(jié)構(gòu)域表達(dá)量的影響 由圖8可知,在高鹽處理下,3個(gè)結(jié)構(gòu)域的相對表達(dá)量與野生型實(shí)生苗相比都有顯著提升。INT結(jié)構(gòu)域相對表達(dá)量隨著NaCl 濃度的增加呈先增加后降低的趨勢,在0.2 mol·L-1NaCl處理下達(dá)到最大值。RH結(jié)構(gòu)域的相對表達(dá)量的變化趨勢與INT結(jié)構(gòu)域基本一致,在0.1 mol·L-1NaCl處理下,相對表達(dá)量達(dá)到最大值,之后隨著濃度增加,其相對表達(dá)量降低,但處理組間差異不顯著。RT結(jié)構(gòu)域相對表達(dá)量在0.1、0.2 mol·L-1NaCl處理下均顯著高于0.3 mol·L-1NaCl處理。

圖8 高鹽處理下PHRE8 結(jié)構(gòu)域的表達(dá)水平Fig.8 Expression levels of domains of PHRE8 under high salt treatment

3 討論

PHRE8是一個(gè)擁有完整結(jié)構(gòu)的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子,包括長末端重復(fù)序列、GAG 蛋白核心區(qū)、PR 蛋白酶核心區(qū)、RT 核心區(qū)、RH 核心區(qū)、INT 結(jié)構(gòu)域、PBS 多嘌呤序列與PPT 引物結(jié)合位點(diǎn)[1],根據(jù)POL基因中PR、RT、RH、INT核心區(qū)的位置順序,推測PHRE8 屬于Ty3-gypsy 家族成員。PHRE8的插入時(shí)間為123.07萬年,與插入時(shí)間為700萬年的活性Tos17 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子相比,PHRE8是一個(gè)相對年輕的轉(zhuǎn)座子,考慮到該轉(zhuǎn)座子及其拷貝的結(jié)構(gòu)均完整,PHRE8 很可能是一個(gè)具有潛在活性的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。

本研究發(fā)現(xiàn)PHRE8的3個(gè)結(jié)構(gòu)域(INT、RH和RT)在DNA 甲基化抑制劑、輻射、高鹽、低溫和高溫處理后,其核心結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)出不同情況的表達(dá)量變化,說明PHRE8是一個(gè)具有轉(zhuǎn)錄活性的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子,在受到脅迫時(shí)通過改變其轉(zhuǎn)錄水平適應(yīng)環(huán)境改變。

研究表明,在一些非生物脅迫下如高溫、低溫、高鹽、重金屬等,植物能夠通過復(fù)雜的基因調(diào)控機(jī)制適應(yīng)各種環(huán)境變化,如引起DNA 甲基化水平的變化[26]、激活轉(zhuǎn)座子[27]等。激光輻射、高壓誘導(dǎo)、遠(yuǎn)緣雜交等均可導(dǎo)致水稻中較常見轉(zhuǎn)座子mPing的激活[28-30]。在植物中,DNA 甲基化作為一種修飾調(diào)控手段,可直接干擾轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子識別序列結(jié)合,也可形成特異的轉(zhuǎn)錄抑制物調(diào)控基因表達(dá),還可通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)抑制基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要的作用[31]。毛竹基因組中非編碼基因存在著多個(gè)具備轉(zhuǎn)座能力的轉(zhuǎn)座子,DNA 甲基化會影響轉(zhuǎn)座子的活性表達(dá)。如莊婷婷[32]采用NO處理水稻基因組DNA,發(fā)現(xiàn)其能夠定向誘導(dǎo)水稻基因發(fā)生一定程度DNA 去甲基化變異,同時(shí)有一些轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性被激活,說明轉(zhuǎn)座子的激活與DNA 去甲基化有一定的聯(lián)系。本研究采用不同濃度的甲基化抑制劑對實(shí)生苗進(jìn)行處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物發(fā)生了不同程度的DNA 去甲基化變異,PHRE8的3個(gè)結(jié)構(gòu)域的相對表達(dá)量均增加,因此降低DNA 甲基化程度可能會激發(fā)PHRE8的潛在轉(zhuǎn)座活性。

王靜子等[33]利用γ射線在分子水平上輻射水稻基因組,結(jié)果表明其可誘導(dǎo)全基因組低DNA 甲基化,還能激活轉(zhuǎn)座子mPing及其轉(zhuǎn)座伙伴Pong[34]。本研究中,與野生實(shí)苗相比,毛竹經(jīng)30、50、70 Gy 輻射處理后PHRE8 相對表達(dá)量均增加,說明PHRE8的轉(zhuǎn)座活性被激發(fā)。其原因可能是由于輻射處理引起了PHRE8 DNA 甲基化變異,導(dǎo)致其相對表達(dá)量升高。隨著輻射劑量的增加,PHRE8 相對表達(dá)量有所下降,其原因可能是過強(qiáng)的輻射導(dǎo)致植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞或物化活性損傷,影響了植物的脅迫反應(yīng)機(jī)制[35]。

溫度是調(diào)控植物生長發(fā)育和分布最重要的因素之一[36-37]。本研究中,毛竹實(shí)生苗在高溫42℃與低溫4℃處理下,PHRE8 中3個(gè)結(jié)構(gòu)域的相對表達(dá)量均有所升高,且PHRE8 在高溫處理下相對表達(dá)量更高,說明毛竹實(shí)生苗對高溫更敏感。當(dāng)植物受到高溫、重金屬等刺激時(shí),可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng),保護(hù)機(jī)體防止細(xì)胞損傷的熱激蛋白質(zhì)的產(chǎn)生[38]。PHRE8 中含有與溫度有關(guān)的順式作用元件,且毛竹中也含有熱激蛋白HSP20、HSP70、HSP90基因[39],猜測在極端溫度下,PHRE8的激活會影響毛竹熱激蛋白的合成與運(yùn)輸,是植物極端溫度應(yīng)答的一部分。

王萌[40]在小麥鹽脅迫應(yīng)答機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn),參與鹽脅迫下的應(yīng)答基因,受到了DNA 甲基化的修飾調(diào)控。也有研究表明,在鹽脅迫條件下,轉(zhuǎn)座子會發(fā)生轉(zhuǎn)座插入,影響鄰近基因的表達(dá)[41]。本研究中,毛竹實(shí)生苗經(jīng)0.1、0.2、0.3 mol·L-1NaCl處理后,PHRE8 中3個(gè)結(jié)構(gòu)域的相對表達(dá)量均有所上升,說明該轉(zhuǎn)座子參與了鹽脅迫的應(yīng)答機(jī)制,猜測PHRE8是通過插入影響相鄰的鹽脅迫應(yīng)答基因,改變基因表達(dá)量以抵御高鹽環(huán)境脅迫。面對逆境脅迫時(shí),植物基因會發(fā)生一些復(fù)雜的變化來提高植物在脅迫下的耐受能力。大量研究表明,DNA 甲基化的修飾與調(diào)控作用在整個(gè)應(yīng)答機(jī)制中占據(jù)了主導(dǎo)地位[42-43]。但逆境脅迫下植物L(fēng)TR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄活性的變化與DNA 甲基化程度改變的關(guān)系和相關(guān)調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步更深入的研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,毛竹PHRE8是一個(gè)結(jié)構(gòu)域完整、插入時(shí)間較晚、富含順式作用元件的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子,屬于Ty3-gypsy 超家族;PHRE8 屬于Reina分支,其與Gloin的同源性最高;PHRE8 在DNA 甲基化抑制劑(5-氮雜胞苷)、輻射、高溫、低溫、高鹽脅迫處理下,其3個(gè)結(jié)構(gòu)域的相對表達(dá)量都有不用程度的增加,說明PHRE8 有可能參與了毛竹在逆境脅迫下的應(yīng)答機(jī)制。該試驗(yàn)結(jié)果為研究毛竹基因組中轉(zhuǎn)座子功能奠定了一定的理論基礎(chǔ)。