褚寧寧 陳雨豪 陳娟娟 馬 斌 陳海敏 駱其君

(寧波大學(xué),農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 寧波 315211)

鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)自上個(gè)世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn)以來,一直被視為有益健康的食品補(bǔ)充劑。螺旋藻富含蛋白質(zhì),其含量高達(dá)64.7%以上。此外,螺旋藻還含有大量的必需氨基酸、微量營養(yǎng)素和各種生物活性物質(zhì),如維生素B、葉黃素、海膽酮、玉米黃質(zhì),以及豐富的礦物質(zhì),如鉀、鈣、磷、銅、鐵等[1-2],具有抗氧化、抗過敏、抗菌、抗腫瘤等活性。因此,螺旋藻可為人體提供所需的營養(yǎng)物質(zhì),具有較高的營養(yǎng)價(jià)值,被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、美容、農(nóng)業(yè)等行業(yè),聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦其為“全球人類最理想的食品”和“人類21世紀(jì)最佳保健品”[3]?？梢娐菪寮捌浠钚猿煞值难芯亢烷_發(fā)具有深遠(yuǎn)的意義。

生物活性肽(biologically active peptide)是一類由氨基酸通過肽鍵連接而成的化合物,具有溶解性高、黏度低、易消化、易吸收等優(yōu)點(diǎn)。目前,食用型活性肽包括降壓肽、抗氧化肽、抗菌肽、抗腫瘤肽等[4],已成為食品界最熱門的話題之一。藻類多肽大部分為二肽到二十肽,分子量分布于300～3 000 Da 之間,如畢秋蕓[5]發(fā)現(xiàn)裙帶菜(Undaria pinnatifida)多肽主要由低分子量的肽段組成,其中低于3 000 Da 分子量肽段部分占總峰面積的95%以上。在橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)的堿性蛋白酶水解產(chǎn)物中分離獲得四肽VEGY,分子量為467 Da[6];在球等鞭金藻(Isochrysis galbana)中水解和純化獲得七肽YMGLDLK[7]。海帶(Laminaria japonica)中分離得到8個(gè)抗高血壓的小肽,分別為二肽到五肽(300～650 Da)[8];在紅毛菜(Bangia fusco-purpurea) 中提取出2個(gè)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽:十三肽 ALLAGDPSVLEDR (1 355 Da)和十 七 肽VVGGTGPVDEWGIAGAR(1 640 Da)[9]。早在1992年已有研究證明螺旋藻具有較強(qiáng)的抗氧化作用,其抗氧化作用高于合成氧化劑丁基羥基茴香醚(butyl hydroxy anisd,BHA)和生育酚,且十分穩(wěn)定[10],其中螺旋藻中的GMCCSR 肽已被證實(shí)具有抗氧化活性[11]。Lu 等[12]從螺旋藻的堿性蛋白酶消化物中分離得到ACE 抑制肽Ile-Gln-Pro,自發(fā)性高血壓大鼠服用劑量為10 mg·kg-1的Ile-Gln-Pro數(shù)小時(shí)后,收縮壓和舒張壓明顯降低,表明螺旋藻中的ACE 抑制肽可用于高血壓的防治。這些活性肽多數(shù)為蛋白酶解后的產(chǎn)物,其穩(wěn)定性受酶解工藝的影響較大。天然存在的活性肽除了可以蛋白質(zhì)部分水解產(chǎn)生之外,生物體內(nèi)還有許多的游離活性肽存在。而游離肽是小肽,一般含有2～20個(gè)氨基酸,可直接通過提取蛋白之后經(jīng)超濾離心的方法獲得,具有操作簡單、穩(wěn)定性強(qiáng)等特性,因此開發(fā)活性游離肽產(chǎn)品有著極大的發(fā)展前景。

目前,常見多肽的鑒定方法有非質(zhì)譜法和質(zhì)譜法,非質(zhì)譜法包括DNA 順序分析法和Edman 化學(xué)降解測序法,由于在N 端封閉的蛋白質(zhì)上很難發(fā)生Edman 反應(yīng),且這種方法靈敏度低較難實(shí)現(xiàn)高通量分析[13],具有一定的局限性,而液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具備液相色譜的強(qiáng)分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度等特點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究。蛋白質(zhì)組學(xué)的概念最早由澳大利亞的科學(xué)家Wilkins和Williams 于1994年提出[14],即通過研究機(jī)體內(nèi)所有蛋白質(zhì)的組成、表達(dá)水平、翻譯后修飾及其功能揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)[15-16]。近年來,隨著各種高分辨、高靈敏度的質(zhì)譜儀的出現(xiàn),結(jié)合圖譜解析方法和生物信息學(xué)相關(guān)軟件MASCOT、PEAKS Studio、SEQUEST、SWISS-PROT、Tr EMBL和X! Tandem 等[17],使得質(zhì)譜技術(shù)成為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和序列鑒定中的一項(xiàng)核心技術(shù)[18]。此外,翻譯后修飾(posttranslational modification,PTM)分析和定量水平的發(fā)展,進(jìn)一步提高了基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)的實(shí)用性[19]。

本研究基于在線納噴離子源的超高效液相色譜和四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(nanoUPLC-Q ExactiveTM-MS)技術(shù),分別采用數(shù)據(jù)庫搜索法和從頭測序法,系統(tǒng)分析螺旋藻中游離肽的種類和相對含量,并鑒定相應(yīng)的蛋白質(zhì),試圖尋找具有活性的功能肽,以期為螺旋藻游離多肽產(chǎn)品的穩(wěn)定開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮的鈍頂螺旋藻藻泥,由云南麗江程海保爾生物開發(fā)有限公司提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備

VCX750 超聲波細(xì)胞破碎儀,美國SONICS公司;1-16K 低溫高速離心機(jī),美國Thermo Fisher 科技有限公司;XS-105DU 電子分析天平,梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司;FreeZone 冷凍干燥機(jī),美國Labconco公司;Cascada Ⅰ超純水系統(tǒng),美國Pall公司;3KD 超濾離心管,美國Millipore公司;超高效液相色譜Nano ACQUITY UPLC 系統(tǒng)(Waters Corporation,Milford,MA),配備在線納噴離子源的四極桿-靜電場軌道阱Q ExactiveTM質(zhì)譜儀美國Thermo Fisher 科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 游離肽的制備 將新鮮的螺旋藻泥與純凈水按料液比1 ∶30 攪拌均勻,冰浴超聲5 min(超聲功率為500 W、超聲6 s、間隔9 s),超聲后的溶液在4℃、10 000 r·min-1條件下離心20 min,取上清液,凍干。凍干粉用超純水復(fù)溶(濃度為3%),經(jīng)3 kDa 超濾管離心30 min,收集管底溶液,即為游離多肽溶液,冷凍干燥后于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 游離肽含量的測定 游離肽含量按照公式計(jì)算:

式中,螺旋藻蛋白質(zhì)總質(zhì)量為螺旋藻進(jìn)行蛋白提取得到蛋白溶液,凍干后稱重得到的蛋白質(zhì)總質(zhì)量。

1.3.3 nanoUPLC-Q ExactiveTM-MS 分析 采用nanoUPLC-Q ExactiveTM-MS 儀對提取的螺旋藻游離肽進(jìn)行分析。捕集柱為Thermo Fisher Scientific Acclaim PepMap C18(100 μm×2 cm,5 μm),分析柱為Acclaim PepMap C18(75 μm×25 cm,1.9 μm),流動(dòng)相:H2O(A)和0.1%甲酸-乙腈(B)。采用梯度洗脫模式:0～120 min,5%～42%B。進(jìn)樣體積6 μL,流速300 nL·min-1。

Q ExactiveTM質(zhì)譜儀在數(shù)據(jù)依賴采集模式下運(yùn)行,自動(dòng)在MS和MS/MS 采集間切換。一級質(zhì)譜在70 K質(zhì)量分辨率下獲得全掃描譜圖(m/z)= 300～1 800;AGC target=3e6;最大進(jìn)樣時(shí)間為60 ms;所帶電荷數(shù)為2～7;動(dòng)態(tài)排除時(shí)間20 s。二級質(zhì)譜MS/MS:采用高能碰撞解離(high-energy collision dissociation,HCD)模式,分辨率為17.5 K;電噴霧電壓2 kV,碰撞能量為27 eV,隔離寬度為2.2;AGC target=5e5;最大進(jìn)樣時(shí)間為50 ms;采用ESI(納米噴霧)離子源,碎片模式:高能(collision induced dissociation,CID)(y和b 離子)。電噴霧電壓2 kV。其中,高能誘導(dǎo)裂解技術(shù)(higher energy collision induced dissociation,HCD)是一項(xiàng)新型的質(zhì)譜裂解技術(shù),與離子阱質(zhì)譜常用的碰撞誘導(dǎo)解離技術(shù)CID相比,HCD 技術(shù)提供了穩(wěn)定的高能裂解方式,并可改善CID 裂解中產(chǎn)生的低質(zhì)量碎片丟失(cutoff)效應(yīng)。

1.3.4 數(shù)據(jù)庫搜索 串聯(lián)質(zhì)譜圖經(jīng)過PEAKS Studio version X (Bioinformatics Solutions Inc.,滑鐵盧,加拿大)分析。PEAKS DB 對數(shù)據(jù)庫(21494 entries)搜庫,設(shè)置非酶切。碎片離子質(zhì)量容許誤差:0.05 Da,母離子質(zhì)量容許誤差:7 ppm,可變修飾:氧化(M) 15.99、脫酰胺(NQ) 0.98、乙?；?2.01。蛋白卡值為-10lgP≥20,至少含1 特異性肽段;肽段卡值為-10lgP≥20。

1.3.5 從頭測序(de novosequencing) 軟件PEAKS先將得到的圖譜進(jìn)行預(yù)處理,將噪聲過濾,圖譜峰聚合,列出候選肽段。然后依據(jù)每個(gè)峰的碎片離子,計(jì)算y 離子和b 離子的匹配分值。最后通過計(jì)算該峰附近的氨基酸殘基使總分值最大,保留最好的候選肽段,同時(shí)加入亞胺離子、中性丟失離子和內(nèi)部解離離子的分值進(jìn)行評估[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 螺旋藻多肽鑒定與分析

游離肽含量占螺旋藻蛋白質(zhì)質(zhì)量的13.96%,占螺旋藻總量的10.24%,說明螺旋藻游離肽在螺旋藻粗蛋白中含量較高,可作為食品或藥品的有效成分進(jìn)行開發(fā)利用。

經(jīng)分析螺旋藻游離肽樣品,分別獲得游離肽的分子量、電荷和保留信息,再通過二級質(zhì)譜分析,獲得二級碎片離子。根據(jù)母離子分子量和碎片離子的打分值,在數(shù)據(jù)庫里篩選出一個(gè)與該二級譜圖匹配度最高的多肽序列,該方法為多肽數(shù)據(jù)庫比對法。對于數(shù)據(jù)庫中未匹配到的多肽,可利用多肽從頭測序技術(shù),即利用碎片離子的質(zhì)量差,得知對應(yīng)的氨基酸殘基。因此分別采用數(shù)據(jù)庫比對和從頭測序兩種多肽檢測技術(shù),可以對螺旋藻游離肽進(jìn)行全面篩選。經(jīng)過前期肽段質(zhì)控(false discovery rate,FDR)或得分,檢測到所有的肽段數(shù)量為4 485個(gè);利用從頭測序技術(shù)鑒定得到多肽序列有20 597個(gè)。

2.1.1 數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果分析 采用數(shù)據(jù)庫比對法一般對肽段的序列長度有一定要求,如果肽段序列過短(如小于7個(gè)氨基酸長度),即使得到有效匹配也會(huì)被數(shù)據(jù)庫匹配法認(rèn)為隨機(jī)性過高而舍棄。結(jié)果顯示,通過數(shù)據(jù)庫匹配后得到的螺旋藻游離肽共有4 485個(gè),分別含有7～37個(gè)氨基酸,即最小的游離肽為七肽,最大的游離肽為三十七肽,分子量分布在500～3 000 Da之間,電荷數(shù)為1～7,游離肽中峰面積最大為3.02×109。將數(shù)據(jù)庫匹配得到的游離肽按照氨基酸序列分類,并利用面積歸一化法計(jì)算游離肽的百分含量。結(jié)果如圖1-A所示,十肽的百分含量最高,為15.95%,共有631個(gè);其次為十一肽,共有600個(gè),百分含量為14.51%;第三是九肽,共有616個(gè),百分含量為14.09%。此外,還檢測到七肽350個(gè)、八肽495個(gè)、十二肽565個(gè)、十三肽423個(gè)、十四肽270個(gè)、十五肽191個(gè)、十六肽126個(gè)、十七肽84個(gè)、十八肽38個(gè)、十九肽27個(gè)以及二十肽24個(gè),其百分含量依次為6.58%、14.48%、11.38%、9.62%、5.17%、4.35%、2.19%、0.72%、0.56%、0.41%、0.27%。其余二十肽以上的游離肽較少,僅有38個(gè),其百分含量為0.68%。指標(biāo)-10lgP 定義了對應(yīng)譜圖鑒定的可信度,數(shù)值越大表明匹配結(jié)果越好。因此,根據(jù)游離肽的百分含量和-10lgP值,表1列出了百分含量最多的20個(gè)游離肽相關(guān)信息。17個(gè)游離肽帶2個(gè)電荷,其余3個(gè)游離肽帶3個(gè)電荷,它們總的百分含量高達(dá)15.94%,分別為八肽到十五肽,分子量范圍為890～1 500 Da。此外,百分含量最高的游離肽為九肽AIESPQRPL,分子量為1 009 Da,占比高達(dá)1.98%。

2.1.2 從頭測序結(jié)果分析 利用從頭測序法共鑒定出20 597種游離肽,且結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對法得到的游離肽數(shù)據(jù)無重疊,但與數(shù)據(jù)庫比對法結(jié)果中不同的是,從頭測序中最短的游離肽是二肽,最長的是三十六肽。利用面積歸一化法計(jì)算游離肽的百分含量(圖1-B),98.35%的游離肽均小于十五肽,分別為二肽19個(gè)、三肽374個(gè)、四肽1 289個(gè)、五肽2 658個(gè)、六肽3 465個(gè)、七肽2 718個(gè)、八肽2 178個(gè)、九肽1 886個(gè)、十肽1 776個(gè)、十一肽1 373個(gè)、十二肽1 044個(gè)、十三肽712個(gè)、十四肽489個(gè)、十五肽349個(gè),而十六肽到三十六肽共有367個(gè)。含量排在前三位的分別為五肽、六肽和四肽,其中,五肽的百分含量最高,占多肽總含量的24.09%。

ALC(amino acid local confidence)為從頭測序數(shù)據(jù)結(jié)果的置信度,一般ALC＞80%較為可信,ALC＞95%表示非?？尚?。基于此,表2列舉了從頭測序結(jié)果中ALC＞95%、百分含量最高的20個(gè)游離肽信息(表2)。結(jié)果顯示,這20個(gè)游離肽分布于四肽到六肽,其中四肽有7個(gè),分子量在400～500 Da 范圍內(nèi);五肽有10個(gè),分子量大小介于469～570 Da 之間;六肽有3個(gè),分子量分別為717、719、672 Da。此外,有19個(gè)多肽均帶有1個(gè)電荷,僅VFADLR 帶有2個(gè)電荷。

2.2 蛋白質(zhì)分析

通過上述游離肽分析結(jié)果,結(jié)合PEAKS Studio 蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件,設(shè)置整體質(zhì)控參數(shù)。對于大規(guī)模蛋白質(zhì)鑒定,通過對用于蛋白質(zhì)搜索的原始數(shù)據(jù)庫的氨基酸序列進(jìn)行倒排或置亂,生成一個(gè)錯(cuò)誤數(shù)據(jù)庫,對數(shù)據(jù)進(jìn)行重新搜索建立錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discoveryrate,FDR),來自錯(cuò)誤數(shù)據(jù)庫的任何命中都將對FDR有影響,這個(gè)值通常在1%左右。在鳥槍蛋白質(zhì)組學(xué)試驗(yàn)中,通過去除僅由一個(gè)肽段識(shí)別的所有蛋白質(zhì),可以增加其置信度。本試驗(yàn)設(shè)置FDR＜1%,得到了高可信的鑒定圖譜。

表1 數(shù)據(jù)庫比對法中百分含量最高的20個(gè)游離肽Table1 The highest percentage of 20 kinds of using database search method

表2 從頭測序法中百分含量最高的20個(gè)游離肽Table2 The highest percentage of 20 free peptides using de novo sequencing methods

圖1 利用數(shù)據(jù)庫比對(A)和從頭測序法(B)分析螺旋藻中游離肽分布Fig.1 Peptide profiling through database search(A) and de novo sequencing methods(B)

肽段覆蓋率是指檢測到的肽段氨基酸數(shù)量占該蛋白質(zhì)總氨基酸數(shù)量的比例。圖2顯示了螺旋藻中所鑒定的蛋白質(zhì)覆蓋率,結(jié)果表明,蛋白質(zhì)覆蓋率超過10%的占比為43.15%,具有較高的置信度。以百分含量最高的多肽序列AIESPQRPL為例,其與檢測到的其余141個(gè)多肽(藍(lán)線所示)共同組裝成磷酸甘油酸激酶蛋白質(zhì)(phosphoglycerate kinase),登錄號為BAI91139.1(圖3)。多肽AIESPQRPL 開始于蛋白序列的第185位氨基酸,結(jié)束于第193位氨基酸,為九肽。圖3中粗體灰色背景的序列即為可靠的鑒定序列,序列上方的修飾、突變即為符合區(qū)域右側(cè)可信度過濾閾值的位點(diǎn),下方藍(lán)色條標(biāo)注的是每一條可靠定性肽段的序列匹配情況。彩色底的方塊代表該蛋白檢測到的修飾類別,不同顏色加字母組合代表不同類型的修飾。磷酸甘油酸激酶蛋白質(zhì)中共發(fā)現(xiàn)2個(gè)乙?；揎?、2個(gè)胱氨酸化修飾、2個(gè)甲基化修飾、9個(gè)氧化修飾、2個(gè)丙酰胺化修飾以及11個(gè)鈉加合物修飾。乙?；揎椃植加?71位氨基酸;胱氨酸化分布于169位氨基酸;甲基化修飾主要分布于139位氨基酸;氧化修飾主要分布在109位、225位、264位、172位氨基酸;丙酰胺化修飾分布于260位氨基酸,鈉加合物修飾主要分布于160位、210位、274位、302位、397位氨基酸。磷酸甘油酸激酶是生物體生存的必需酶,是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶,由2個(gè)球形的結(jié)構(gòu)閾組成,其主要功能是將1,3-二磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油酸[21]。

圖2 蛋白質(zhì)覆蓋率的分布Fig.2 Distributin of protein sequence coverage

利用上述數(shù)據(jù)庫搜索法和從頭測序法獲得的螺旋藻多肽,通過前期質(zhì)控篩選共得到1 036種蛋白質(zhì)和667種蛋白質(zhì)組。蛋白質(zhì)質(zhì)量分布如圖4所示,大部分蛋白質(zhì)質(zhì)量大于10 kDa,有良好的覆蓋度。其中質(zhì)量為10～20 kDa的蛋白質(zhì)種類最多,有218種,約占蛋白質(zhì)總量的五分之一,其次是質(zhì)量為30～40 kDa和40～50 kDa的蛋白質(zhì),分別有179種和145種,質(zhì)量為80～90 kDa的蛋白質(zhì)種類最少,僅有26種。表3列舉了百分含量前20的蛋白質(zhì)種類,這些不同的蛋白質(zhì)在生物體中發(fā)揮著不同的作用,其中蛋白質(zhì)putative peroxiredoxin(假定的過氧化物酶)的相對含量最高,過氧化物酶(peroxiredoxin,PRX)是一種重要的蛋白質(zhì),在保護(hù)自身細(xì)胞抵抗活性氧(reactive oxygen species,ROS)方面發(fā)揮著重要作用。

3 討論

圖3 磷酸甘油酸激酶蛋白質(zhì)序列覆蓋圖Fig.3 Phosphoglycerate kinase protein sequence map

圖4 蛋白質(zhì)質(zhì)量分布Fig.4 Protein mass distribution

曾巧輝[11]運(yùn)用基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization time-of-fight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS/MS)儀和PEAKS 軟件鑒定出螺旋藻蛋白酶解后純化的活性成分中6個(gè)具有抗氧化 活 性 多 肽 序 列,分 別為GMCCSR、FFEFF、EYFDALA、VTAPAASVAL、ANAAFRPR、WVAGLGYFTKNGGPK,但是純化過程耗時(shí)耗力,且大量未純化到的多肽則無法開展深入研究;王竹君[22]采用MALDITOF/TOF-MS 質(zhì)譜儀進(jìn)行螺旋藻多肽的鑒定,僅得到5條可信肽段。這是因?yàn)镸ALDI-TOF 質(zhì)譜測量多肽混合物時(shí),待測組分不能完全離子化,導(dǎo)致部分多肽組分未被檢測到,特別是對于成分復(fù)雜、含量分布范圍廣的樣品更難檢測[23];而蛋白匹配時(shí),如果得不到足夠的肽段信息,則無法搜索肽數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白的識(shí)別。為了解決檢測靈敏度和檢測范圍,本研究使用液相色譜進(jìn)行多肽組分分離,可降低多肽混合物間的離子抑制率,有利于復(fù)雜多肽成分的檢測,獲得足夠多的多肽片段信息進(jìn)行蛋白質(zhì)識(shí)別和組裝。此外,孫宜君[24]采用MALDI-TOF/TOF-MS和液質(zhì)聯(lián)用方法(liquid chromatography tandem massspectrometry,LC-MS/MS)分別測定了螺旋藻抗菌肽的分子量和一級結(jié)構(gòu),并采用數(shù)據(jù)庫搜索得到該肽所屬的蛋白質(zhì)種類,但是該結(jié)果僅針對目前已有的數(shù)據(jù)庫結(jié)果進(jìn)行匹配分析,而大量未被收錄于數(shù)據(jù)庫的多肽片段信息,則無法識(shí)別分析。因此,為了更廣泛地獲得螺旋藻中多肽和蛋白信息,本研究綜合利用數(shù)據(jù)庫比對法和從頭測序法,分別獲得了4 485個(gè)和20 597個(gè)肽段。其中,從頭測序法獲得的肽段信息高于數(shù)據(jù)庫匹配法3～4倍,使得螺旋藻中游離多肽的分析更加全面,彌補(bǔ)了高可信肽段在數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果中沒有理想的匹配情況,可以找到大量未知的、全新的多肽,且進(jìn)一步探究翻譯修飾、氨基酸突變等信息。

表3 峰面積排序前20的蛋白Table3 Top 20 proteins in peak area sorting

目前,已有文獻(xiàn)報(bào)道螺旋藻及其他藻類中的抗高血壓、抗氧化、抗腫瘤等相關(guān)的活性肽。Suetsuna等[25]報(bào)道了螺旋藻(S.platensis)和小球藻(Chlorella vulgaris)中的ACE 抑制肽,其中,螺旋藻中檢出5條ACE 抑制肽,分別為Ile-Ala-Glu(IAE,IC50為34.7 μmol · L-1)、Phe-Ala-Leu (FAL,IC50為26.3 μmol·L-1)、Ala-Glu-Leu (AEL,IC50為57.1 μmol·L-1)、Ile-Ala-Pro-Gly (IAPG,IC50為11.4 μmol·L-1)和Val-Ala-Phe (VAF,IC50為35.8 μmol·L-1);小球藻中檢出5種ACE 抑制肽,分別為Ile-Val-Val-Glu(IVVE,IC50為315.3 μmol·L-1)、Ala-Phe-Leu(AFL,IC50為63.8 μmol·L-1)、FAL、AEL和Val-Val-Pro-Pro-Ala(VVPPA,IC50為79.5 μmol·L-1)。本研究在螺旋藻游離肽的從頭測序的結(jié)果中也檢出了三肽FAL和AFL,分子量均為349 Da。裙帶菜(U.pinnatifida)中共得到15個(gè)活性肽段,其中有二肽11個(gè),分別為VY、IY、AW、FY、VW、IW、LW、YH、KY、FY 及IY[26-27];四肽有4個(gè),分別為AIYK、YKYY、KFYG、YNKL,它們的分子量范圍為400～700[28]。而本檢測到的25 082個(gè)肽段中,僅發(fā)現(xiàn)了一個(gè)二肽LW(IC50=23.6 μmol·L-1),分子量為359 Da。因此,推測螺旋藻游離肽中檢測到的LW、FAL和AFL 三種小肽可能含有抗高血壓的活性肽。

螺旋藻的藻藍(lán)蛋白的胃蛋白酶消化物中分離出具有抗氧化活性的氨基酸Cys-Leu(CL)[29]。Yu 等[30]通過超濾、凝膠色譜和反相高效液相色譜法獲得抗氧化肽Pro-Asn-Asn(PNN)(343.15 Da),并通過合成獲得PNN 多肽,確定其DPPH 清除活性(100 μg·mL-1)為81.44%。本研究基于此,以CL和PNN 作為螺旋藻中的抗氧化活性肽的多肽片段進(jìn)行搜索并未發(fā)現(xiàn)CL和PNN,然而,在從頭測序結(jié)果中得到含有PNN片段的游離肽有12個(gè),含有CL片段的游離肽有315個(gè);數(shù)據(jù)庫搜索得到的多肽結(jié)果中篩選到含有CL 序列的游離肽有10個(gè),含有PNN 序列的游離肽有4個(gè)。

Du 等[31]研究發(fā)現(xiàn)三肽Arg-Gly-Asp(RGD)具有改善肝纖維化的作用;Bartlett 等[33]研究發(fā)現(xiàn)含有Pro-Arg-Pro(PRP)序列的多肽可能具有抗微生物活性。本研究未發(fā)現(xiàn)RGD和PRP 兩種三肽,但發(fā)現(xiàn)含有RGD 序列的游離肽15個(gè),含有PRP 序列的游離肽20個(gè),這些含有活性序列的肽段具有潛在的生物活性。此外,本研究基于螺旋藻25 082個(gè)游離肽,可匹配到的蛋白質(zhì)主要分為幾大類:藻膽體內(nèi)的連接肽、藻體內(nèi)的各類蛋白(氣囊蛋白,結(jié)構(gòu)域蛋白等)、分子伴侶、各類酶等。它們主要參與藻體的基本組成、蛋白質(zhì)合成及轉(zhuǎn)運(yùn)、脂類糖類物質(zhì)的代謝。如30 S 核糖體蛋白S1,參與了蛋白質(zhì)的合成過程;翻譯延伸因子EF-Tu,是原核細(xì)胞進(jìn)行翻譯時(shí)需要的三種延伸因子之一,其介導(dǎo)氨基酰-tRNA 進(jìn)入核糖體空出的A位,進(jìn)位過程需消耗EF-Tu 水解其復(fù)合的GTP 產(chǎn)生的能量來完成;蛋白質(zhì)分子伴侶GroEL(chaperonin GroEL)屬于Hsp60 分子伴侶系統(tǒng),是一種由14個(gè)相對分子質(zhì)量58×103的亞基組成的同型寡聚復(fù)合物,在新生蛋白質(zhì)的折疊和組裝、變性蛋白的復(fù)性以及蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)輸中起著重要作用[33]。本研究中,螺旋藻提取物中上述蛋白質(zhì)的功能主要參與藻體的基本組成、蛋白質(zhì)合成及轉(zhuǎn)運(yùn)、脂類糖類物質(zhì)的代謝,所以當(dāng)上述蛋白質(zhì)完成其基本功能被降解,從而有可能在螺旋藻游離肽提取物中檢測到相應(yīng)的多肽成分。

4 結(jié)論

本研究基于Nano-UPLC-Q ExactiveTM-MS 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了螺旋藻中分子量小于3 kDa的游離肽,采用數(shù)據(jù)庫搜索法和從頭測序法分別檢測得到螺旋藻多肽4 485個(gè)和20 597個(gè),并匹配組裝成蛋白質(zhì)1 036種。在數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果中,游離肽主要為七肽到二十一肽,其中十肽含量最高,達(dá)到15.95%;從頭測序結(jié)果中,游離肽主要為二肽到十六肽,其中五肽含量最高,為24.09%。此外,依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的活性肽數(shù)據(jù),在螺旋藻游離肽中共檢索到3種ACE 抑制肽,分別為FAL、AFL、LW,說明螺旋藻中游離肽中可能含有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制的成分?；诙嚯慕M成的分析結(jié)果,本研究可為螺旋藻多肽產(chǎn)品的生產(chǎn)和開發(fā)提供理論依據(jù)。