王志恒, 黃思麒, 鄒芳, 楊秀柳, 魏玉清

(北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院, 國(guó)家民委生態(tài)系統(tǒng)模型及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 銀川 750021)

甜高粱[Sorghumbicolor(L.)Moench]又稱(chēng)糖高粱、甜稈等，具有適應(yīng)性廣、生長(zhǎng)速度快、生物產(chǎn)量高等特點(diǎn)，可廣泛作為飼料、能源和糖料作物，現(xiàn)已成為鹽堿地地區(qū)最具有種植潛力的作物之一[1-2]。當(dāng)前，土壤鹽漬化是限制農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要環(huán)境因子，嚴(yán)重威脅作物產(chǎn)量和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展[3-4]。據(jù)全國(guó)第二次土壤普查，中國(guó)的鹽漬地分布廣泛，總面積約為3.6×109hm2，其中西北、華北、沿海地區(qū)的鹽堿地總面積超過(guò)3×108hm2，占全國(guó)耕地總面積的10%左右，發(fā)展耐鹽植物在鹽堿地的種植成為鹽堿地可持續(xù)利用技術(shù)研發(fā)研究重點(diǎn)之一，對(duì)于提升我國(guó)耕地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)能力、開(kāi)發(fā)耕地面積、保障國(guó)家糧食安全具有重要意義[5-6]。

種子萌發(fā)階段作為植物生長(zhǎng)周期中最重要的階段之一，是自身最脆弱、對(duì)外界環(huán)境最敏感的時(shí)期，極易受到環(huán)境因子的影響，而溫度和鹽分均是影響種子萌發(fā)的主要環(huán)境因素[7]。有研究表明，生長(zhǎng)在鹽堿地區(qū)的植物經(jīng)常遇到溫度和鹽分兩種脅迫[8]。目前，關(guān)于鹽脅迫對(duì)甜高粱種子萌發(fā)的影響研究較多，而不同溫度條件下鹽脅迫對(duì)甜高粱種子萌發(fā)影響的研究未見(jiàn)報(bào)道。那么溫度和鹽分及其交互作用對(duì)甜高粱種子的萌發(fā)有何影響，值得研究。本研究以‘遼甜1號(hào)’甜高粱為材料，設(shè)置5個(gè)溫度梯度下5個(gè)NaCl鹽分濃度，通過(guò)測(cè)定發(fā)芽率、種子殘留干重、幼芽幼根長(zhǎng)度及幼苗抗氧化物酶活性等多個(gè)指標(biāo)，擬探討不同溫度及NaCl濃度脅迫下甜高粱種子萌發(fā)和抗氧化酶活性的變化特征，旨在研究溫度和鹽分及其交互作用對(duì)甜高粱種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響，以期為鹽堿地甜高粱的種植提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)，從而促進(jìn)我國(guó)鹽堿地甜高粱的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試種子為甜高粱品種‘遼甜1號(hào)’，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新中心提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)置及方法

萌發(fā)溫度設(shè)置為15/5、20/10、25/15、30/20與35/25 ℃共5個(gè)梯度，光周期為12/12 h(光/暗)；將NaCl配制為0、50、100、200、300 mmol·L-1鹽溶液進(jìn)行梯度處理，共設(shè)置25個(gè)處理。

取飽滿(mǎn)、色澤大小基本一致的甜高粱種子適量，用10%的次氯酸鈉溶液浸泡20 min消毒，用無(wú)菌水沖洗7～8次，直至干凈無(wú)味，用濾紙吸干種子表面水分。將甜高粱種子30粒整齊置于墊有雙層濾紙的的培養(yǎng)皿(Φ120 mm)中，每個(gè)處理加入10 mL不同濃度的鹽溶液，均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)期間每天更換培養(yǎng)基質(zhì)，以保證培養(yǎng)環(huán)境的恒定。置于特定溫度的室內(nèi)人工智能氣候箱(BIC-800，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)黑暗條件下進(jìn)行甜高粱種子萌發(fā)試驗(yàn)。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

試驗(yàn)過(guò)程中，每隔24 h觀察記錄種子萌發(fā)情況，以胚根伸出種皮2 mm為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)[8]，記錄種子萌發(fā)個(gè)數(shù)，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。7 d后結(jié)束萌發(fā)，從各個(gè)處理中隨機(jī)選出15株幼苗，用直尺測(cè)量胚芽、胚根長(zhǎng)度，用電子分析天平(上海精科天美科學(xué)儀器公司)測(cè)量幼苗干重、種子殘留干重。干重測(cè)量前105 ℃烘2 h殺青，80 ℃烘24 h至恒重。按以下公式計(jì)算各指標(biāo)[9-10]。

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑Gt/t

式中,Gt為t天內(nèi)發(fā)芽的種子數(shù)，t為相應(yīng)的萌發(fā)天數(shù)。

活力指數(shù)=GI×S

式中GI為發(fā)芽指數(shù)，S為胚根平均長(zhǎng)度。

干物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)率=

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑光還原法[11]；過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚顯色法[12]；過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)活性測(cè)定采用紫外吸收比色法[13]；抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)活性測(cè)定參考孫云[14]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，SPSS Satatistics 21.0進(jìn)行雙因素方差分析，GraphPad Prism 5.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)甜高粱種子發(fā)芽進(jìn)程的影響

不同溫度不同NaCl處理的甜高粱種子發(fā)芽結(jié)果見(jiàn)圖1，可知溫度和NaCl處理均影響甜高粱種子發(fā)芽進(jìn)程。隨著溫度的升高，甜高粱種子在不同濃度鹽脅迫下初始發(fā)芽時(shí)間均提前，由種子開(kāi)始處理后的第3 d提前至第1 d，發(fā)芽結(jié)束時(shí)間由第6 d提前至第3 d；隨著鹽濃度的增加，NaCl處理延后了種子萌發(fā)的起始時(shí)間，到達(dá)發(fā)芽高峰期的時(shí)間也推遲。在30/20和35/25 ℃條件下，300 mmol·L-1的NaCl處理種子萌發(fā)后會(huì)出現(xiàn)死苗的現(xiàn)象。由此表明，溫度升高可以加快甜高粱種子的發(fā)芽速率，使發(fā)芽歷時(shí)縮短，而鹽脅迫推遲種子萌發(fā)的進(jìn)程，在高溫和高濃度NaCl處理的交互作用下，會(huì)嚴(yán)重傷害甜高粱種子的萌發(fā)。

圖1 溫度與NaCl處理對(duì)甜高粱種子發(fā)芽進(jìn)程的影響

2.2 不同處理對(duì)甜高粱種子萌發(fā)指標(biāo)的影響

不同溫度和不同NaCl處理的甜高粱種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)結(jié)果見(jiàn)圖2，可見(jiàn)，當(dāng)NaCl濃度相同時(shí)，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)在25/15 ℃最高，其次為30/20 ℃，15/5 ℃時(shí)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)最低，雖然有的處理差異不顯著；當(dāng)溫度相同時(shí)，鹽濃度越高，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)越低，15/5 ℃下，當(dāng)NaCl濃度超過(guò)100 mmol·L-1時(shí)，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)顯著低于0 mmol·L-1處理，20/10、25/15、30/20、35/25 ℃條件下，鹽濃度超過(guò)200 mmol·L-1時(shí)，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)顯著低于0 mmol·L-1處理。由圖2可知，NaCl處理下，種子的發(fā)芽指數(shù)在35/25 ℃時(shí)最高，種子的活力指數(shù)在30/20 ℃時(shí)最高，二者均在15/5 ℃條件下最低，且顯著低于30/20、35/25 ℃處理；在溫度相同的條件下，隨著NaCl濃度的增加，種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)逐漸降低。

注:不同英文小寫(xiě)字母表示相同溫度條件下不同NaCl處理間差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不同希臘小寫(xiě)字母表示相同NaCl濃度處理下不同溫度間差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

溫度(T)、NaCl處理(S)及T×S對(duì)甜高粱種子的發(fā)芽指標(biāo)貢獻(xiàn)度的雙因素方差分析結(jié)果(表1)表明，T、S及T×S對(duì)甜高粱種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的貢獻(xiàn)度不同，從T、S及T×S所占總平方和的百分比(PP)來(lái)看，S(53.53%)對(duì)發(fā)芽率的貢獻(xiàn)度較高，T×S(29.82%)次之，T(16.66%)最??；T(75.80%)對(duì)發(fā)芽勢(shì)的貢獻(xiàn)度較高，S(18.64%)次之，T×S(5.56%)最小；T(54.92%)對(duì)發(fā)芽指數(shù)的貢獻(xiàn)度較高，S(39.49%)次之，T×S(5.59%)最??；S(49.33%)對(duì)活力指數(shù)的貢獻(xiàn)度較高，T×S(33.39%)次之，T(16.68%)最小。因此，NaCl處理是影響發(fā)芽率和活力指數(shù)的主要因子，而溫度是影響發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)的主要因子。

表1 溫度與NaCl處理對(duì)甜高粱種子萌發(fā)指標(biāo)影響的雙因素方差分析

2.3 不同處理對(duì)甜高粱種子種苗轉(zhuǎn)化的影響

不同溫度和NaCl處理的甜高粱種子干物質(zhì)轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)結(jié)果見(jiàn)圖3，當(dāng)NaCl濃度相同時(shí)，芽干重+根干重在25/15 ℃最高，其次為30/20、35/25、20/10 ℃，15/5 ℃時(shí)最低；當(dāng)溫度相同時(shí)，隨著鹽濃度升高，芽干重+根干重逐漸減小，當(dāng)NaCl濃度超過(guò)100 mmol·L-1時(shí)，其顯著低于0 mmol·L-1處理。當(dāng)NaCl濃度相同時(shí)，種子殘留干重在30/20、35/25 ℃下最低，15/5 ℃時(shí)最高；當(dāng)溫度相同時(shí)，隨著NaCl濃度升高，種子殘留干重逐漸增大，當(dāng)NaCl濃度超過(guò)50 mmol·L-1時(shí)，種子殘留干重顯著高于0 mmol·L-1處理。當(dāng)NaCl濃度相同時(shí)，干物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)率在25/15 ℃、30/20 ℃、35/25 ℃下最高，其次為20/10 ℃，15/5 ℃時(shí)最低；當(dāng)溫度相同時(shí)，隨著NaCl濃度升高，干物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)率逐漸降低，且不同濃度的NaCl處理均顯著低于0 mmol·L-1處理。當(dāng)NaCl濃度相同時(shí)，總長(zhǎng)和芽長(zhǎng)在30/20 ℃達(dá)到最高，其次為25/15、35/25 ℃；鮮重、幼苗相對(duì)含水量和根長(zhǎng)在25/15 ℃最高，其次為30/20、35/25 ℃，15/5 ℃時(shí)甜高粱早期幼苗的生長(zhǎng)情況最差。可見(jiàn)，當(dāng)溫度相同時(shí)，隨著NaCl濃度升高，鮮重、幼苗相對(duì)含水量、總長(zhǎng)、芽長(zhǎng)及根長(zhǎng)逐漸減小，當(dāng)NaCl濃度超過(guò)100 mmol·L-1時(shí)，均顯著低于0 mmol·L-1處理。

注: 不同英文小寫(xiě)字母表示相同溫度條件下不同NaCl處理間差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不同希臘小寫(xiě)字母表示相同NaCl濃度處理下不同溫度間差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

雙因素方差分析(表2)表明，T、S及T×S對(duì)甜高粱種子的干物質(zhì)轉(zhuǎn)移貢獻(xiàn)度不同，從T、S及T×S所占總平方和的百分比(PP)來(lái)看，S(47.52%)對(duì)芽干重+根干重的貢獻(xiàn)度較高，T(44.80%)次之，T×S(7.69%)最小；T(48.04%)對(duì)種子殘留干重的貢獻(xiàn)度較高，S(41.79%)次之，T×S(10.17%)最?。籗(45.49%)對(duì)干物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)率的貢獻(xiàn)度較高，T(43.52%)次之，T×S(10.99%)最??；S(47.52%)對(duì)甜高粱早期幼苗生長(zhǎng)(鮮重、幼苗含水量、總長(zhǎng)、芽長(zhǎng)及根長(zhǎng))的貢獻(xiàn)度較高，T次之，T×S最小。因此，NaCl是影響芽干重+根干重、干物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)率、及早期幼苗生長(zhǎng)主要因素的主要因子，溫度是影響種子殘留干重的主要因子。

表2 溫度與NaCl處理對(duì)甜高粱種子種苗轉(zhuǎn)化影響的雙因素方差分析

2.4 不同處理對(duì)甜高粱早期幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

SOD、POD、CAT、APX是植物在逆境脅迫下為抵御外界傷害產(chǎn)生的抗氧化酶類(lèi)。由圖4可知，在15/5和20/10 ℃下，SOD、POD、APX活性均隨著NaCl濃度的增加而逐漸減小，25/15、30/20、35/25 ℃時(shí)，3種酶活性在NaCl濃度增加的情況下呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)；APX活性在不同溫度條件下均隨著NaCl濃度的增加而逐漸減小。在NaCl濃度相同的情況下，溫度對(duì)于4種酶活性的影響各不相同，在0、200 mmol·L-1時(shí)，4種酶活性均隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，50、100 mmol·L-1時(shí)，4種酶活性均隨著溫度的升高而逐漸增大，300 mmol·L-1時(shí)，SOD、POD活性均隨著溫度的升高而逐漸增大，CAT、APX活性均隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。

雙因素方差分析(表3)表明，對(duì)甜高粱早期幼苗葉片的抗氧化酶活性貢獻(xiàn)度不同，從T、S及T×S所占總平方和的百分比(PP)來(lái)看，S對(duì)SOD、POD、CAT活性的貢獻(xiàn)度較高，T次之，T×S最小；T對(duì)APX活性的貢獻(xiàn)度較高，S次之，T×S最小。因此NaCl處理是影響SOD、POD、CAT活性的主要因子，溫度是影響APX活性的主要因子。

3 討論

種子萌發(fā)過(guò)程中，溫度是調(diào)控其萌發(fā)的重要生態(tài)因子之一，同時(shí)也是鹽脅迫下種子萌發(fā)的重要生態(tài)條件[15]。在本研究中，NaCl濃度不超過(guò)100 mmol·L-1時(shí)，除15/5 ℃外，不同溫度對(duì)甜高粱種子的發(fā)芽率無(wú)顯著影響，說(shuō)明甜高粱在低濃度的鹽脅迫下能夠適應(yīng)多種變溫范圍。隨著NaCl濃度的增加，甜高粱在高溫(25/15～35/25 ℃)條件下具有較高的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，15/5 ℃對(duì)甜高粱種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)抑制最強(qiáng)，這是因?yàn)樵诜N子萌發(fā)過(guò)程中，種子內(nèi)部進(jìn)行著活躍的物質(zhì)代謝反應(yīng)，在一定范圍內(nèi)，相對(duì)較高的溫度對(duì)種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用，超過(guò)某一特定溫度范圍的過(guò)高和過(guò)低溫度均不利于種子萌發(fā)[16]。在300 mmol·L-1濃度的NaCl脅迫下，30/20和35/25 ℃條件對(duì)甜高粱已萌發(fā)的早期幼苗有致死現(xiàn)象，說(shuō)明過(guò)高的溫度、NaCl脅迫及其交互作用會(huì)影響甜高粱種子萌發(fā)的一系列生理生化過(guò)程，進(jìn)而影響發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，當(dāng)環(huán)境溫度適宜時(shí)，則可以減輕一定程度鹽脅迫對(duì)甜高粱種子萌發(fā)的毒害作用，這與小麥[15]和野大麥[17]的研究結(jié)果一致。

植物從種子轉(zhuǎn)化到幼苗過(guò)程中所需的物質(zhì)及能量是由種子中貯藏的有機(jī)物提供，因此在種子萌發(fā)過(guò)程中總長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、鮮重、種子殘留干重、芽干重+根干重和干物質(zhì)轉(zhuǎn)移率能體現(xiàn)出植物種苗轉(zhuǎn)化狀況，當(dāng)植物早期幼苗胚芽和胚根生長(zhǎng)均衡時(shí)，可以表現(xiàn)出更好的生長(zhǎng)狀況[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，在同一NaCl濃度下，除種子殘留干重外，甜高粱種苗轉(zhuǎn)化過(guò)程的總長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、鮮重、芽干重+根干重、干物質(zhì)轉(zhuǎn)移率和幼苗含水量隨著溫度的升高呈先增大后減小趨勢(shì)，種子殘留干重則隨著溫度的升高呈減小趨勢(shì)；在同一溫度下，隨著NaCl濃度的增加，甜高粱種苗轉(zhuǎn)化過(guò)程除種子殘留干重外，其余指標(biāo)均逐漸減小，種子殘留干重則隨著NaCl濃度的升高而增大；同時(shí)根長(zhǎng)、鮮重、芽干重+根干重和幼苗含水量在25/15 ℃條件下最高，總長(zhǎng)和芽長(zhǎng)在30/20 ℃條件下最高，干物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)率在25/15和30/20 ℃條件下較高，種子殘留干重在30/20和35/25 ℃條件下較低，說(shuō)明溫度、NaCl脅迫及其交互作用對(duì)種苗轉(zhuǎn)化的各指標(biāo)影響不同，這可能是由于種子吸水后，較快地進(jìn)行代謝活動(dòng)，種子的水解作用增強(qiáng)，合成作用減弱，種子內(nèi)部的淀粉和蛋白質(zhì)水解為可溶性糖和可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，當(dāng)超過(guò)種子萌發(fā)適宜溫度時(shí)，高溫加劇種子的水解和呼吸作用，導(dǎo)致種子內(nèi)部的淀粉消耗增加，而溫度的升高對(duì)于早期幼苗的生長(zhǎng)又是一種傷害。因此，在溫度與鹽脅迫的交互作用下，種子萌發(fā)時(shí)期種苗轉(zhuǎn)化過(guò)程中各指標(biāo)對(duì)于脅迫的響應(yīng)各有不同[15]。

非生物脅迫下，植物會(huì)產(chǎn)生大量活性氧自由基，大量的活性氧會(huì)影響蛋白質(zhì)的合成、破壞膜系統(tǒng)，造成植物細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p壞甚至死亡，SOD、POD、CAT和APX是細(xì)胞內(nèi)清除活性氧的主要保護(hù)酶，整個(gè)保護(hù)酶系統(tǒng)防御能力的變化取決于這幾種酶的彼此協(xié)調(diào)的綜合結(jié)果[18]。本研究中，甜高粱早期幼苗葉片的抗氧化物酶活性整體上隨著溫度的升高逐漸增強(qiáng)，在適宜溫度下，酶活性隨著NaCl濃度的增加呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，在較低或較高溫度下，酶活性隨著NaCl濃度的增加呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。這可能是由于當(dāng)甜高粱種子轉(zhuǎn)化為早期幼苗后，低溫可以抑制幼苗的一系列生理生化活動(dòng)，而高溫引起水分蒸發(fā)加速，并通過(guò)毛細(xì)運(yùn)動(dòng)增加了鹽濃度，在鹽脅迫的基礎(chǔ)上加劇了對(duì)早期幼苗的傷害，而這些酶活性的增強(qiáng)有利于及時(shí)清除活性氧自由基，保持平衡，而隨著脅迫程度的進(jìn)一步增大,抗氧化物酶已不能完全清除存在的活性氧自由基，平衡被打破，因此酶活性降低[19]。因此，在溫度與鹽脅迫交互作用下，脅迫傷害效應(yīng)疊加，加重甜高粱早期幼苗受損程度，表現(xiàn)為低溫和高鹽脅迫傷害較大，抗氧化物酶活性降低，而高溫和低鹽脅迫提高了抗氧化物酶活性，這與類(lèi)延寶[20]在小麥上的研究結(jié)果一致。

綜上所述，溫度與NaCl處理及其互作均可顯著影響甜高粱種子的萌發(fā)及早期幼苗的生長(zhǎng)，低濃度NaCl處理下，低溫是抑制其萌發(fā)的主要原因，當(dāng)NaCl濃度較高時(shí)，高溫更是加劇了對(duì)種子萌發(fā)的傷害作用，在30/20 ℃下，大多數(shù)指標(biāo)達(dá)到最優(yōu)狀態(tài)，表明該溫度為鹽脅迫下甜高粱種子萌發(fā)及早期幼苗生長(zhǎng)的最適溫度。