張春艷，劉萬全，呂艷欣，陳 萍，董 靜，王 玉，李 濤

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 黑龍江 161006）

炎癥是由激活的巨噬細(xì)胞釋放一系列炎癥因子所產(chǎn)生的一種以防御為主的免疫反應(yīng)[1-2]，但是炎癥因子的持續(xù)刺激會對組織產(chǎn)生損害，使機體功能喪失、引發(fā)腫瘤，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致死亡[3]。因此，開發(fā)一種新型、高效、無副作用的天然抗炎藥物具有深遠(yuǎn)意義。

蹄 葉 橐 吾（Ligularia fischeri，LF）為 菊 科（compasitae）蹄葉橐吾屬（Ligularia）多年生草本植物，又名腎葉橐吾、馬蹄葉、葫蘆七等[4]。該植物性溫，味辛、苦。其根和根莖收入吉林省藥材標(biāo)準(zhǔn)，名山紫菀，具有溫肺下氣、理氣活血、止痛、止血、利尿、鎮(zhèn)咳祛痰等功效，用于治療慢性支氣管炎、咽喉炎癥、肺癰咳血、跌打損傷等疾病。全草用于治療丹毒性炎癥和關(guān)節(jié)膿腫，地上部分外敷用于捻挫傷，水煎服可治療痔疾[5-7]。，隨著LF 的藥理活性被逐漸闡明，發(fā)現(xiàn)除了其根和根莖具有鎮(zhèn)咳祛痰等藥理活性外，其葉片提取物中的倍半萜類及異蜂斗菜酮等化學(xué)成分[8-10]在抗炎免疫，抗腫瘤、抗氧化等方面顯示出潛在的藥用價值[11-13]。目前國內(nèi)外學(xué)者已發(fā)現(xiàn)LF 葉片提取物可通過多條信號通路發(fā)揮抗炎作用，例如：抑制LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮和前列腺素-2[11]、通過c-Jun 氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）和絲裂原活化蛋白激酶p38（Mitogen-activated protein kinases p38,p38MAPK通路下調(diào)炎性蛋白JNK、環(huán)氧酶（cyclooxygenase-2，COX-2）的表達(dá)，同時降低JNK 的磷酸化水平[12-13]。然而目前對于LF 葉片提取物的抗炎作用機制研究相對較少，深入的機制還有待于進(jìn)一步挖掘。

細(xì)胞核內(nèi)因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一種介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能夠與p38MAPK、JNK 和胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase,ERK）等通路共同作用，調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。NF-κB 主要由NF-κB 1（p105/p50）、NF-κB 2（p100/p52）、RelA（p65）、RelB 和c-Rel組成，其中p65在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用[14]。細(xì)胞在靜息狀態(tài)下，NF-κB 的核定位序列被其阻遏蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）封閉，以無活性的形式存在于細(xì)胞漿中[15]。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，當(dāng)細(xì)胞受到LPS 刺激時，IκB 發(fā)生磷酸化，與NF-κB 解離，進(jìn)而暴露NF-κB 的核定位序列，使NF-κB 被激活，從細(xì)胞漿易位至細(xì)胞核，介導(dǎo)各種炎性因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[16]。除此以外，大量的實驗數(shù)據(jù)表明，NF-κB的亞基p65可以被細(xì)胞內(nèi)的激酶磷酸化，這種磷酸化修飾可以反式激活NF-κB，從而增強NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性[15]。NF-κB抑制劑PDTC 能夠抑制NF-κB 的激活，從而阻止NFκB入核，達(dá)到抗炎作用[17]。雖然研究已表明EEOLF具有顯著的抗炎活性，但其能否通過NF-κB 信號通路達(dá)到抗炎作用尚不明確。本研究以LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 為炎癥模型，通過此模型，初步探討NF-κB通路介導(dǎo)的EEOLF抗炎作用機制，以期為開發(fā)EEOLF天然抗炎藥物提供有力依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院。

1.1.2 藥品

LF為李濤教授在延邊市安圖縣采摘，EEOLF在齊齊哈爾大學(xué)制備，制備過程為干燥的LF 葉片8.5 kg，粉碎后，室溫下，每次用95%無水乙醇15 L 浸泡3 天后加熱回流，重復(fù)3 次，合并醇提液，減壓濃縮至小體積（約1.0 L），真空干燥，加水1.5 L，得醇提取物用水混懸，用乙酸乙酯萃取3 次，每次用乙酸乙酯1.5 L，合并乙酸乙酯層濃縮至恒重，得率為0.61%[15]。每克相當(dāng)于10 g生藥，使用時DMSO 溶解后用PBS稀釋，濾過除菌，并分裝儲存。

1.1.3 試劑

FBS胎牛血清（美國Hyclone公司），乙二胺四乙酸（EDTA，美國Sigma 公司），四甲基二乙胺（TEMED，美國Sigma 公司），DMEM 培養(yǎng)基干粉（美國Gibco 公司），NF-κB抗體（美國Cell Signal Technology 公司）、NF-κB磷酸化抗體（美國Cell Signal Technology 公司）、β-actin（美國Cell Signal Technology 公司），山羊抗小鼠lgG/辣根酶標(biāo)記二抗（美國Cell Signal Technology 公司），LPS（美國Sigma 公司），NF-κB 抑制劑PDTC（上海譜振生物科技有限公司），L-1β及TNF-α ELISA試劑盒（博士德生物科技有限公司）。

1.2 儀器

DY5000X 倒置顯微鏡（重慶澳浦光電技術(shù)有限公司），BIO-RAD 680 全自動酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD 公司），超低溫冰箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司），3111 型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），VS-1300L-U 凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），Tanon 5200 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

取RAW264.7 巨噬細(xì)胞在DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)2 天、處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的RAW264.7 細(xì)胞，經(jīng)1 × PBS 清洗兩次，每次3 m L，用刮刀刮取細(xì)胞，并用細(xì)胞培養(yǎng)液吹打混勻，于細(xì)胞計數(shù)板上計數(shù)，加培養(yǎng)液稀釋至濃度為5×104個/mL，接種于96孔板中，每孔100μL，繼續(xù)培養(yǎng)，待巨噬細(xì)胞處于對數(shù)生長期且形成致密融合單層后分組處理。先前研究采用噻唑藍(lán)比色法（MTT 法）測得EEOLF 作用于密度為5×104個/mL的RAW264.7細(xì)胞24 h后，藥物對細(xì)胞的無毒濃度為5 μg·mL-1[12]。本研究取對數(shù)期細(xì)胞6 瓶，分別進(jìn)行6 種處理?？瞻讓φ战M，加入不含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；EEOLF 處理組，加入EEOLF（終濃度為5μg·mL-1）培養(yǎng)24 h；LPS 刺激組，加入LPS（終濃度為0.1 mg·L-1）培養(yǎng)24 h；LPS+PDTC 組，加入PDTC（終濃度為10 ng·μL-1）培養(yǎng)1 h 后，再加入LPS（終濃度為0.1 mg·L-1）培養(yǎng)24 h；LPS + EEOLF 組，加入EEOLF（終濃度為5 μg·mL-1）培養(yǎng)1 h 后，再加入LPS（終濃度為0.1 mg·L-1）培養(yǎng)24 h；LPS + PDTC +EEOLF 組，加入PDTC（終濃度為10 ng·μL-1）培養(yǎng)1 h后，再加入EEOLF（終濃度為5μg·mL-1）培養(yǎng)1 h，最后加入LPS（終濃度為0.1 mg·L-1）培養(yǎng)24 h。

1.3.2 免疫印跡法分析蛋白表達(dá)

取RAW264.7 巨噬細(xì)胞在DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)2 d、處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的RAW264.7 細(xì)胞，經(jīng)1 × PBS 清洗兩次，每次3 m L，用刮刀刮取細(xì)胞，并用細(xì)胞培養(yǎng)液吹打混勻，于細(xì)胞計數(shù)板上計數(shù)，加培養(yǎng)液稀釋至濃度為5×104個/mL，接種于96孔板中，每孔100μL，繼續(xù)培養(yǎng)，待巨噬細(xì)胞處于對數(shù)生長期且形成致密融合單層后按照1.3.2 的方法分組處理。提取細(xì)胞核總蛋白，并測定各組的總蛋白濃度，95 ℃將蛋白變性，取30 μg 蛋白樣品進(jìn)行電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（0.45μm），用脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST 洗3 次。分別加入一抗NF-κB p65、p-p65 和β-actin 抗體，抗體稀釋度為1:1000，4 ℃孵育過夜；TBST 洗3 次，加入辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗，抗體稀釋度為1∶5000，室溫孵育1 h，TBS 洗滌2 次，再次TBST 洗滌后反應(yīng)信號經(jīng)ECL 底物化學(xué)發(fā)光檢測，結(jié)果掃描后，以β-actin 為內(nèi)參，用ImagePro 分析每個目的蛋白特異灰度值并計算相對灰度值。以上實驗重復(fù)3次。

1.3.3 細(xì)胞因子檢測

取RAW264.7 巨噬細(xì)胞在DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)2 d、處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的RAW264.7 細(xì)胞，經(jīng)1 × PBS 清洗兩次，每次3 m L，用刮刀刮取細(xì)胞，并用細(xì)胞培養(yǎng)液吹打混勻，于細(xì)胞計數(shù)板上計數(shù)，加培養(yǎng)液稀釋至濃度為5×104個/mL，接種于96孔板中，每孔100μL，繼續(xù)培養(yǎng)，待巨噬細(xì)胞處于對數(shù)生長期且形成致密融合單層后按照1.3.2 的方法分組處理。用ELISA 試劑盒檢測上清腫瘤壞死因子TNF-α 和白介素IL-1β 分泌情況。將8 pg·mL-1、400 pg·mL-1、200 pg·mL-1、100 pg·mL-1、50 pg·mL-1L、25 pg·mL-1L、12.5 pg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品各100 uL 依次加入孔中，另取1孔只加細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對照，每個濃度設(shè)置三個復(fù)孔；酶標(biāo)板加上封板膜，37 ℃反應(yīng)90分鐘；依次加入生物素抗小鼠IL-1β抗體100 uL；酶標(biāo)板加上封板膜，37 ℃反應(yīng)60 分鐘；洗滌緩沖液洗滌3 次，每次浸泡1 分鐘左右（每孔洗液至少300 uL）；將準(zhǔn)備好的ABC 工作液按每孔100 uL 依次加入；酶標(biāo)板加上封板膜，37 ℃反應(yīng)30分鐘；洗滌緩沖液洗滌5 次，每次浸泡1-2 min 左右（每孔洗液至少300 uL）。分別加入顯色劑A 和B，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min；加終止液，采用酶標(biāo)儀測量各孔的吸光度A450nm。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

炎癥因子釋放數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5 軟件分析，Western blot 數(shù)據(jù)采用ImagePro 軟件分析，數(shù)據(jù)以±SD表示，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAW264.7巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

RAW264.7 巨噬細(xì)胞在DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)2天，待巨噬細(xì)胞處于對數(shù)生長期且形成致密融合單層后分組處理，用以觀察比較EEOLF 及PDTC 作用后細(xì)胞的形態(tài)變化。各組RAW264.7 細(xì)胞如圖1 所示，正常RAW264.7 細(xì)胞形態(tài)以類圓形為主，邊緣明亮，含有1～2 個細(xì)胞核，偶有細(xì)長觸角，是一類胞體體積較小的細(xì)胞（圖1A）。單獨加入EEOLF 生長24 h 后，細(xì)胞無明顯變化，細(xì)胞核清楚，狀態(tài)良好（圖1B）。加入LPS 誘導(dǎo)24 h 后，細(xì)胞模糊不清，細(xì)胞內(nèi)有空泡（圖1C）。用PDTC 或者EEOLF 單獨作用于LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)空泡減少（圖1D 和1E），用PDTC 和EEOLF 同 時 作 用 于LPS 誘 導(dǎo) 的RAW264.7 細(xì)胞后，細(xì)胞核變得清晰，細(xì)胞內(nèi)空泡減少（圖1F），說明EEOLF 和NF-κB 抑制劑PDTC 效果相似。

2.2 EEOLF降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞NFκB p65表達(dá)及其磷酸化

NF-κB p65 在正常情況下位于細(xì)胞漿中，當(dāng)發(fā)生炎癥反應(yīng)時，將會從細(xì)胞漿易位至細(xì)胞核內(nèi)[16]。本研究通過構(gòu)建LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥模型，Western 法檢測細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平及其磷酸化水平，間接檢測藥物是否可以通過NF-κB 信號通路達(dá)到抗炎作用。研究結(jié)果顯示，與空白對照組相比，LPS 組NF-κB p65 和p-p65 蛋白表達(dá)量顯著升高（###P<0.001），說明LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞發(fā)生了炎癥反應(yīng)。加入PDTC 或者EEOLF，分別作用于LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NF-κB p65 和p-p65蛋白表達(dá)量明顯低于LPS 組（***P < 0.001），表明EEOLF 與PDTC 一樣，可以降低LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞NF-κB p65 和p-p65 蛋白表達(dá)。當(dāng)PDTC 與EEOLF 共同作用于LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞后，NF-κB p65 和p-p65 蛋白表達(dá)量低于PDTC 或EEOLF單獨作用（△△△P < 0.001 或△P < 0.05），說明在NF-κB抑制劑PDTC 與EEOLF 的共同作用下，對細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65 和p-p65 蛋白表達(dá)的抑制作用進(jìn)一步加強（***P<0.001）（圖2）。

圖1 不同因素處理后的RAW264.7的細(xì)胞形態(tài)

圖2 EEOLF對RAW264.7細(xì)胞NF-κB p65和p-p65蛋白表達(dá)的影響

2.3 EEOLF 降低LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌

NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活后，會介導(dǎo)下游各種炎性因子的表達(dá)，如：TNF-α、IL-1 等，因此炎性因子分泌量的多少反應(yīng)了炎癥的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組相比，LPS 組TNF-α 和IL-1β 的分泌 量 顯 著 升 高（###P < 0.001），說 明LPS 誘 導(dǎo) 的RAW264.7 細(xì)胞發(fā)生了炎癥反應(yīng)。加入PDTC 或者EEOLF，分別作用于LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)TNF-α 和IL-1β 的分泌量明顯減少（***P < 0.001），表明EEOLF 與PDTC 均能降低炎癥細(xì)胞中TNF-α 和IL-1β 的釋放。當(dāng)PDTC 與EEOLF 共同作用于LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞后，TNF-α 和IL-1β 的分泌量更低（△△△P<0.001），表明PDTC與EEOLF共同作用后對炎癥因子TNF-α和IL-1β釋放的抑制作用進(jìn)一步加強（***P<0.001）（圖3）。

圖3 不同因素處理后的RAW264.7細(xì)胞炎性因子的表達(dá)

3 討論

炎癥是一類極其復(fù)雜的病理生理過程，是機體對損傷性刺激最原始的保護(hù)性反應(yīng)，在一定程度內(nèi)起到保護(hù)機體的作用，但長期劇烈的炎癥反應(yīng)會加速疾病進(jìn)程，使得機體出現(xiàn)中毒性休克，多器官功能衰竭等癥狀[18-19]。

LF 為我國傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，又稱山紫菀，李時珍說：“其根色紫而柔宛故名”。主要分布在東北長白山、內(nèi)蒙古、朝鮮、日本、前蘇聯(lián)等，因其藥理作用廣泛、廉價易采摘等優(yōu)勢而具有很大的開發(fā)價值[20]。近年來研究發(fā)現(xiàn)除了其根和根莖具有鎮(zhèn)咳祛痰等藥理活性外，LF地上部分乙醇提取物對降低炎癥組織中的PGE2 的含量、抑制小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能、抑制組胺、5-羥色胺、緩激膚等炎癥介質(zhì)的合成或釋放及增強體液免疫功能有關(guān)。但具體作用機制尚不十分清楚[21]。本研究以RAW264.7 細(xì)胞作為載體，采用LPS 建立體外細(xì)胞炎癥模型，探討EEOLF 對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞功能的調(diào)控作用，以豐富EEOLF 的抗炎作用機制，為LF 的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

本研究在顯微鏡下觀察到LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞24 h 后細(xì)胞邊緣模糊不清，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡（圖1C）。用PDTC 或者EEOLF 單獨作用于LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)空泡減少（圖1D 和1E）。用PDTC 和EEOLF 同時作用于LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞后，細(xì)胞核變得清晰，細(xì)胞內(nèi)空泡減少（圖1F），提示EEOLF 與NF-κB 抑制劑PDTC 功能相似，均可使LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞發(fā)生凋亡。

LPS 是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的成分，能夠作為炎癥誘導(dǎo)劑，與細(xì)胞膜表面受體（Toll-like receptor 4，TLR4）結(jié)合[22-24]，刺激巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活化，引起全身的炎癥反應(yīng)。LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)主要是通過激活NF-κB等信號通路實現(xiàn)的，NF-κB 被激活后進(jìn)入細(xì)胞核，與特異性的基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)結(jié)合，啟動炎癥基因的轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)TNF-α、IL-1 等炎癥因子的釋放[15]。炎癥因子的分泌量是檢測炎癥嚴(yán)重程度的量化指標(biāo)，炎癥標(biāo)志因子TNF-α 在炎癥網(wǎng)絡(luò)中具有關(guān)鍵作用，是全身炎性反應(yīng)的始動介質(zhì)，是炎癥反應(yīng)發(fā)生的經(jīng)典檢測指標(biāo)，TNF-α 釋放量的多少直接反應(yīng)炎癥的輕重[25-26]。而IL-1 一般產(chǎn)生于炎癥早期，具有介導(dǎo)炎癥產(chǎn)生的作用[3]。NF-κB 的活化對于TNF-α、IL-1 等炎癥因子的的表達(dá)是必需的[27]，因此抑制NF-κB 的活化很可能是治療炎癥的有效方法。

本研究結(jié)果顯示，EEOLF 作用于LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞后，可下調(diào)NF-κB p65 的蛋白表達(dá)及磷酸化水平，同時減少TNF-α、IL-1 等炎癥因子的產(chǎn)生。而使用陽性對照藥PDTC 后，NF-κB p65 的蛋白表達(dá)及磷酸化水平同樣受到抑制，相應(yīng)地，TNF-α、IL-1 等炎癥因子的分泌也受到抑制。進(jìn)一步揭示了EEOLF 可通過抑制NF-κB 的激活，抑制LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。因此，以NF-κB 信號通路為切入點，研究EEOLF 作用于LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞后該通路的活性，能夠為開發(fā)抗炎、抗免疫作用的藥物提供有力的理論基礎(chǔ)，為慢性免疫炎癥性疾病患者帶來福音。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)EEOLF 單獨作用于RAW264.7 細(xì)胞后，NF-κB 表達(dá)水平升高，這可能是因為藥物作用于細(xì)胞后，細(xì)胞發(fā)生了應(yīng)激反應(yīng)。因為當(dāng)細(xì)胞受到各種理化及生物性刺激時，將出現(xiàn)一系列適應(yīng)代償性反應(yīng)，這些反應(yīng)包括一系列非特異性反應(yīng)，統(tǒng)稱為細(xì)胞應(yīng)激。而研究報道稱NF-κB 是幾種細(xì)胞應(yīng)激信號核轉(zhuǎn)導(dǎo)因子之一，細(xì)胞在受到外界刺激后，可通過經(jīng)典途徑或旁路途徑激活NF-κB[28]。也就是說當(dāng)細(xì)胞受到藥物刺激后，發(fā)生了應(yīng)激反應(yīng)，激活了NF-κB，從而導(dǎo)致NF-κB 表達(dá)量有所升高，TNF-α 表達(dá)量有所升高可能也與NF-κB激活有關(guān)[29]。

綜上所述，EEOLF 能減弱LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥，其機制可能與EEOLF 能夠調(diào)控NF-κB 通路有關(guān)，進(jìn)而抑制TNF-α 和IL-1β 的釋放。但抗炎是一個綜合而復(fù)雜的過程，是多條信號通路共同作用的結(jié)果，具體作用機制還需進(jìn)一步研究。