黃 敏，陳會敏，周艷艷，徐安莉，陳龍云，趙 敏

（湖北中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院 武漢 430065）

中醫(yī)認為，腎為先天之本，脾為后天之本，生化之源，以滋養(yǎng)育胎?；跈C體的免疫調(diào)控機制來探討腎虛型胎漏、胎動欲墜等癥具有重要的臨床意義，這也是目前中醫(yī)臨床上的研究熱點[1-3]。

本課題組前期的研究表明，腎虛會影響Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）的表達，進而干擾機體的免疫水平[4]。TLR4 是一種跨膜蛋白受體，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分。胞外區(qū)參與細菌脂多糖、類脂A 和熱休克蛋白60等多種病原相關分子模式（Pathogen associated molecular pattern，PAMP）的識別，激活先天性免疫反應，引起細胞因子釋放，進而活化獲得性免疫反應[5-6]。可見，TLR4 是連接天然免疫與特異性免疫的橋梁，是調(diào)控機體免疫的重要分子，具有重要的研究意義。

TLR 介導的免疫機制可分為MyD88 依賴性和MyD88 非依賴性兩種[7]。MyD88 是TLR 的接頭蛋白，有N 端死亡結(jié)構(gòu)域和C 端的TIR 結(jié)構(gòu)域（Toll/interleukin-1receptor（IL-1R）domain）。死亡結(jié)構(gòu)域作用于IL-1R相關激酶（IL-1R-associated kinase，IRAK），引起IRAK 的自磷酸化。磷酸化的IRAK 進而通過活化IκB (inhibitor-κB)來激活NF-κB[8-9]。NF-κB 由p50和p65 構(gòu)成，p50 負責結(jié)合DNA，p65 則結(jié)合抑制蛋白IκB。正常情況下，p65 與IκB 結(jié)合將NF-κB 限定于細胞漿中，阻止其入核。刺激條件下，IκB 磷酸化并降解，NF-κB被激活并入核結(jié)合特定DNA序列啟動大量免疫介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，引起免疫應激反應[10-11]。NF-κBp65在NF-κB 的激活和免疫因子的轉(zhuǎn)錄中起著重要的作用，國內(nèi)外都有很多相關的最新研究[10-13]。我們前期了解到腎虛與TLR4 相關，但是腎精虧虛能否進一步作用于下游的MyD88和NF-κB仍需進一步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠90 只（雌∶雄=2∶1），8 周齡，體重200±20 g，許可證編號SCXK（鄂）2017-0012，由三峽大學實驗動物中心提供。大鼠飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥實驗中心SPF 級動物房，大鼠自由飲水和采食，室溫22±2℃，光照明暗各12 h，適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 左歸丸混懸液的制備

左歸丸購自上海雷允上封浜制藥有限公司，國藥準字Z31020371，每粒重0.1 g。根據(jù)大鼠與人的體表面積換算公式，計算出大鼠劑量為0.58 g/100 g·d-1。據(jù)此，將左歸丸配制成濃度為0.58 g·mL-1的混懸液，4℃冰箱備用。

1.3 主要試劑

Trizol 由Aidlab 公 司 提 供，貨 號 為252250AX；SYBR Green Master Mix，由Vazyme 公司提供，貨號為Q111-02；大鼠甲狀腺素（T3 和T4）診斷試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供，貨號為F16839 和F16840；小鼠單抗β-Actin 由武漢博士德生物工程有限公司提供，貨號為BM0627；兔多抗NF-κBp65 由Abcam公司提供，貨號Ab16502；兔多抗MyD88由武漢三鷹生物技術有限公司提供，貨號為23230-1-AP；兔多抗TLR4，由武漢三鷹生物技術有限公司提供，貨號為19811-1-AP；HRP 標記羊抗小鼠二抗，由武漢博士德生物工程有限公司提供，貨號為BA1051；HRP 標記羊抗兔二抗，由武漢博士德生物工程有限公司提供，貨號為BA1054。

1.4 主要儀器

模擬地震振動臺（上海鼎盛機械制造廠），型號AB22001；組織攤烤片機（武漢俊杰電子有限公司），型號JK-6；顯微鏡（Olympus），型號BX53；病理切片機（德國Leica 公司），型號RM 2016；電鏡（FEI 公司），型號TecnaiG2 20TWIN；實時熒光定量PCR 儀（ABI 公司），型號QuantStudio 6。

1.5 動物分組、腎精虧虛孕鼠模型建立及給藥

大鼠適應性喂養(yǎng)后，按照比例（雌∶雄=2∶1）進行合籠配對。母鼠受孕后，按隨機取數(shù)法分為正常組、模型組和補腎組，每組20 只。自懷孕第1 天起（受孕第一天定義為顯微鏡下看到陰栓的當天），模型組和補腎組每日采用梅花針叩擊孕鼠頭部和仿地震平臺震動及包天桐的懸吊應激法三種因素復合造模，直至其分娩。

梅花針叩擊孕鼠頭部造模法：頻率20 次/min，每次5 min，隔天一次，不定時。

仿地震平臺震動造模法：每天不定時振動1 次(頻率：垂直振動3 次，水平振動3 次)，每次持續(xù)5 min，每次單只放入仿地震平臺造模。

包天桐的懸吊應激造模法：用膠布將孕鼠尾部距肛門1.5 ～2 cm 處固定在長木條上，在其正下方放置一缸水，水面恰及孕鼠鼠鼻，模擬時刻處于將溺水的危險狀態(tài)，促使孕鼠有恐懼感。

哺乳期仔豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉癥狀，隨后排出黃白色粥樣稀便，臥地不起，強迫仔豬站立，仔豬行走時左右搖擺，行走不穩(wěn)，不能正常吃乳，仔細觀察發(fā)病豬四肢內(nèi)側(cè)存在紫色點狀出血，發(fā)病豬腹瀉物中夾雜不完全的白色凝乳塊。隨著病情進一步發(fā)展，腹瀉癥狀嚴重，患病豬身體逐漸消瘦，不能正常行走，行走時左右搖晃，共濟失調(diào)，四肢叉開，口吐白沫，叫聲嘶啞，耳部和腹部皮膚表面發(fā)紅，并出現(xiàn)綠豆大小的藍紫色出血點。多數(shù)患病豬在發(fā)病中后期，排出黃色或黃褐色粥樣稀便，病豬在臨死前表現(xiàn)角弓反張，全身肌肉震顫，出現(xiàn)間歇性痙攣，后期肢體麻痹，呈現(xiàn)犬坐姿勢，有時在圈舍中轉(zhuǎn)圈或者側(cè)臥時四肢劃動呈游泳狀，最后因機體衰竭而死。

補腎組自妊娠第一天起，予左歸丸混懸液灌胃，灌胃劑量為1 ml/100 g·d-1，直至孕鼠分娩。正常組和模型組孕鼠自妊娠第一天起每日予生理鹽水灌胃，灌胃劑量為1 ml/100 g·d-1，直至孕鼠分娩。

1.6 動物一般狀態(tài)觀測

實驗過程中，每日觀察各組孕鼠的神態(tài)、活動量、進食量、二便的排瀉、被毛的生長榮枯、是否有先兆流產(chǎn)以及孕鼠胎產(chǎn)數(shù)。

1.7 檢測孕鼠血清T3和T4含量

孕鼠產(chǎn)仔后，立刻取血。孕鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 ml·kg-1）麻醉，剪開腹壁，分離并剪斷腹主動脈，取血5 ml 左右，靜置30 分鐘，離心（4℃、3000 r·min-1、15 min），分離血清，用大鼠甲狀腺素（T3 和T4）診斷試劑盒進行檢測。

1.8 脾臟顯微結(jié)構(gòu)檢測

孕鼠分娩當天放血處死孕鼠，取脾臟組織，4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋，常規(guī)切片備用。HE 染色后用光學顯微鏡觀察脾臟顯微結(jié)構(gòu)改變。

1.9 脾臟超微結(jié)構(gòu)檢測

取孕鼠脾臟組織切碎至1 mm3大小，用0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，經(jīng)4%戊二醛固定2 h，1%鋨酸固定1 h，梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片至4μm，鈾鉛雙重染色后，電鏡觀察脾臟超微結(jié)構(gòu)改變。

1.10 RT-PCR檢測TLR4、MyD88和NF-κBp65 mRNA表達水平

取孕鼠脾臟組織，采用Trizol 法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，并用RT-PCR 法測定上述三種mRNA的表達水平，引物參見表1。逆轉(zhuǎn)錄體系：5μg RNA、2μl Oligo(dT)18(10 μM)、4 μl dNTP (2.5 mM)、4 μl 5× Hiscript Buffer、1μl Hiscript Reverse Transcriptase、0.5μl Ribonuclease Inhibitor，補ddH2O（Rnase free）至體積為20 μl。逆轉(zhuǎn)錄反應條件：25℃5min，50℃15min，85℃5min，4℃10min。RT-PCR 體系：4 μl cDNA（8×稀釋）、0.4 μl 上游引物、0.4 μl 下游引物、10 μl SYBR Green Master Mix、0.4μl 50×ROX Reference Dye 2、4.8μl H2O。RTPCR 條件：50°C 2 min，95°C 10 min；40 個循環(huán)條件：95°C 30 sec，60°C 30 sec。數(shù)據(jù)以2-ΔΔct法分析。

1.11 Western blotting檢測TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白表達水平

取孕鼠脾臟組織，提取總蛋白質(zhì)，并測定濃度。每組取50 μg 總蛋白先后進行兩次SDS-PAGE 電泳：5%濃度，100 V，20 min；10%濃度，130 V，60 min。然后，60 V 3.5 h電轉(zhuǎn)印于PVDF膜上。用封閉液將PVDF膜（1×TBST，5%脫脂奶粉）室溫振搖封閉0.5 h。加入對應的一抗，4℃孵育過夜，1 × TBST 液洗膜3 次。加辣根過氧化物酶標記的二抗，并洗膜。加ECL 發(fā)光劑，顯影、定影，膠片洗滌，干燥后觀察并記錄。

1.12 統(tǒng)計學處理

利用SPSS 22.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較進行t 檢驗，多組均數(shù)間兩兩比較采用方差分析，P<0.05 為組間有差異，有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 孕鼠一般情況及血清T3、T4的比較

如表2所示，正常組孕鼠活動度好，采食量與飲水量正常，產(chǎn)仔正常。與正常組孕鼠比較，模型組孕鼠出現(xiàn)體毛脫落枯疏且無光澤、易驚恐、拱背蜷縮、喜聚集扎堆、采食量與飲水量減少和大便軟稀等癥狀，結(jié)合中醫(yī)辯證和恐傷腎的病因病機，說明模型組孕鼠存在腎精虧虛癥。同時，模型組胎產(chǎn)數(shù)量明顯降低，仔鼠活動度較差，且有2 只孕鼠出現(xiàn)流產(chǎn)，有2 只孕鼠出現(xiàn)早產(chǎn)，并娩出少量死胎，表明復合應激法所致的腎精虧虛會導致孕鼠的生殖能力下降。此外，模型組孕鼠血清甲狀腺激素（T3和T4）的水平明顯低于對照組，提示模型組孕鼠甲狀腺機能減退，基礎代謝降低，進一步證實模型組孕鼠存在腎精虧虛（表2）。與模型組孕鼠比較，補腎組孕鼠較平靜，無明顯驚恐和流產(chǎn)現(xiàn)象，其胎產(chǎn)數(shù)量和仔鼠活動度尚可，可見少量無尾畸胎。同時，補腎組血清甲狀腺激素（T3和T4）的水平明顯回升，這表明補腎填精方左歸丸可以改善腎精虧虛孕鼠的生存狀態(tài)、生殖功能和基礎代謝水平。

表1 引物序列表

表2 孕鼠一般情況及血清T3、T4的比較

2.2 孕鼠脾臟組織顯微結(jié)構(gòu)的比較

結(jié)果如圖1所示，正常組孕鼠脾臟結(jié)構(gòu)致密，淋巴小結(jié)邊界清晰，紅髓、白髓結(jié)構(gòu)完整，淋巴細胞排列致密整齊，細胞未見明顯的分裂分化現(xiàn)象（圖1A-1C）。與正常組孕鼠比較，模型組孕鼠脾臟結(jié)構(gòu)稀疏，脾小梁增寬，較多的淋巴小結(jié)面積縮小且界限模糊，白髓內(nèi)淋巴細胞數(shù)量大量減少且排列稀疏分散，并出現(xiàn)部分壞死的淋巴細胞（圖1D-1F），表明復合應激法所致的腎經(jīng)虧虛會導致孕鼠脾臟組織的顯微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常。與模型組孕鼠比較，補腎組孕鼠脾臟結(jié)構(gòu)稍稀疏、白髓結(jié)構(gòu)輕度改變，淋巴小結(jié)界限較清晰，淋巴細胞的數(shù)量有恢復（圖1G-1I），表明補腎填精方左歸丸可以使模型組孕鼠的脾臟顯微結(jié)構(gòu)部分恢復正常。

圖1 孕鼠脾臟組織顯微結(jié)構(gòu)的比較（HE染色×100，×200，×400）

2.3 孕鼠脾臟組織超微結(jié)構(gòu)的比較

結(jié)果如圖2 所示，正常組孕鼠脾臟內(nèi)未見明顯的細胞凋亡和壞死現(xiàn)象（圖2A）；細胞內(nèi)的細胞核核膜平滑，核內(nèi)染色質(zhì)較濃，且核膜附近的染色質(zhì)較多（圖2B）；同時，胞漿中各細胞器結(jié)構(gòu)正常，線粒體內(nèi)可見清晰的嵴狀結(jié)構(gòu)（圖2C）。與正常組孕鼠比較，模型組孕鼠脾臟內(nèi)有明顯的細胞凋亡和壞死現(xiàn)象（圖2D）；細胞內(nèi)的細胞核核膜不規(guī)則，部分核膜有明顯的凹凸不平現(xiàn)象，核內(nèi)染色質(zhì)出現(xiàn)不同程度的固縮（圖2E）；同時，胞漿中部分細胞器崩解，有的線粒體出現(xiàn)水腫和嵴狀結(jié)構(gòu)受損（圖2F）；表明復合應激法所致的腎精虧虛會導致孕鼠脾臟組織的超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常。與模型組孕鼠比較，補腎組孕鼠脾臟內(nèi)的細胞凋亡和壞死現(xiàn)象明顯減少（圖2G）；細胞內(nèi)的細胞核核膜不規(guī)則和染色質(zhì)固縮現(xiàn)象減輕（圖2H）；胞漿中的細胞器和線粒體形態(tài)明顯恢復（圖2I）；表明表明補腎填精方左歸丸可以使模型組孕鼠的脾臟超微結(jié)構(gòu)部分恢復正常。

2.4 孕鼠脾臟組織中TLR4、MyD88 和NF-κBp65 mRNA表達水平的比較

結(jié)果如圖3所示，與正常組比較，模型組孕鼠脾臟中TLR4、MyD88 和NF-κBp65 的mRNA 表達水平顯著降低（ΔP < 0.01），表明復合應激法所致的腎精虧虛會導致孕鼠脾臟中的TLR4 免疫通路相關基因的mRNA水平受到抑制。與模型組比較，補腎組孕鼠脾臟中TLR4、MyD88 和NF-κBp65 的mRNA 表達水平明顯回升（▲P<0.01），表明補腎填精方左歸丸能夠上調(diào)TLR4免疫通路中相關基因的mRNA水平。

圖2 孕鼠脾臟組織超微結(jié)構(gòu)的比較（電鏡×1700，×5000，×11500）

圖3 孕鼠脾臟組織中TLR4、MyD88和NF-κBp65 mRNA表達水平的比較

圖4 孕鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、NF-κBp65蛋白表達水平的比較

2.5 孕鼠脾臟組織中TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白表達水平的比較

結(jié)果如圖4所示，與正常組比較，模型組脾臟組織中TLR4、MyD88 和NF-κBp65 蛋白的表達水平顯著降低（ΔP <0.01），表明復合應激法所致的腎精虧虛會導致孕鼠脾臟中的TLR4 免疫通路相關基因的蛋白質(zhì)表達受到抑制。與模型組比較，補腎組孕鼠脾臟中TLR4、MyD88 和NF-κBp65 蛋白質(zhì)的表達水平明顯回升（▲P<0.01，＃P<0.05），表明補腎填精方左歸丸能夠上調(diào)TLR4免疫通路中相關基因的蛋白質(zhì)水平。

3 總結(jié)與討論

恐是中醫(yī)五志之一，長時間的過度恐懼會有損機體健康[14]?！端貑枴り庩枒蟠笳摗分刑岢隽恕翱謧I”理論。本實驗根據(jù)該理論采用復合應激法復制出腎精虧虛“恐傷孕鼠”模型[15-16]。中醫(yī)的“腎”本質(zhì)上包括了下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)、甲狀腺、性腺體的功能。目前，腎虛證動物模型的判斷依據(jù)主要是其是否有類似于人的腎虛證臨床表現(xiàn)以及其甲狀腺、腎上腺、生殖能力和免疫水平是否出現(xiàn)紊亂[17]。本實驗中，模型組孕鼠出現(xiàn)了喜歡扎堆、蜷縮拱背、口唇蒼白、雙眼無神、食欲減退、大便質(zhì)地較稀和皮毛枯疏無華等癥狀，也出現(xiàn)了流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎產(chǎn)數(shù)量明顯減少、產(chǎn)下死胎和甲狀腺激素（T3和T4）的水平降低等現(xiàn)象，結(jié)合中醫(yī)辯證和恐傷腎的病因病機，說明本實驗的腎精虧虛模型是成功的。左歸丸是具有補腎填精作用的經(jīng)典方劑[18-19]。本實驗中，左歸丸干預的補腎組孕鼠的生存狀態(tài)、生殖功能和甲狀腺激素水平都得到了顯著改善，這與文獻報道的左歸丸能提高生殖能力和調(diào)節(jié)腎精虧虛癥狀的結(jié)論一致[20-22]。

機體免疫功能的強弱與中醫(yī)理論中的“衛(wèi)氣”密切相關。中醫(yī)認為，衛(wèi)氣源于下焦腎氣，生于中焦脾胃所化生的后天之氣，最后借助于肺的宣發(fā)和肅降功能布于全身肌表，發(fā)揮其抗御之能。故此，免疫功能與機體的肺、脾、腎有關。腎精虧虛已被證實能影響機體的免疫功能[21-22]。基于此，本實驗以孕鼠的免疫器官—脾臟為靶標，探究“恐傷腎”對其免疫水平的影響。結(jié)果表明，模型組孕鼠脾臟結(jié)構(gòu)稀疏，脾小梁增寬，較多的淋巴小結(jié)面積縮小且界限模糊，白髓內(nèi)淋巴細胞數(shù)量大量減少且排列稀疏分散，并出現(xiàn)部分壞死的淋巴細胞。電鏡結(jié)果進一步證實模型組孕鼠脾臟內(nèi)有細胞凋亡和壞死現(xiàn)象，細胞內(nèi)的細胞核核膜不規(guī)則，部分核膜有明顯的凹凸不平現(xiàn)象，核內(nèi)染色質(zhì)出現(xiàn)不同程度的固縮；同時，胞漿中部分細胞器崩解，有的線粒體出現(xiàn)水腫和嵴狀結(jié)構(gòu)受損。這些形態(tài)學的改變都提示“恐傷腎”模型組孕鼠的脾臟組織出現(xiàn)了異常，而這種結(jié)構(gòu)異常可能是模型組孕鼠免疫功能受損的原因之一。左歸丸干預的補腎組孕鼠的脾臟結(jié)構(gòu)稍稀疏、白髓結(jié)構(gòu)輕度改變，淋巴小結(jié)界限較清晰，淋巴細胞的數(shù)量有所恢復；同時，脾臟內(nèi)的細胞凋亡和壞死現(xiàn)象明顯降低，細胞內(nèi)的細胞核核膜不規(guī)則和染色質(zhì)固縮現(xiàn)象減輕，胞漿中的細胞器和線粒體形態(tài)明顯恢復。本實驗的結(jié)果表明，左歸丸能有效改善腎精虧虛孕鼠脾臟的結(jié)構(gòu)，這與已有的左歸丸能改善免疫功能的結(jié)論具有一致性[21-22]。但是，本實驗選用脾臟為靶標，來探究“恐傷腎”及左歸丸干預對其的影響，能更進一步論證腎精虧虛與補腎填精與機體免疫系統(tǒng)的關系。

本課題組前期的研究表明，腎虛會影響TLR4 的表達[4]。TLR 可以識別外源的病原體和內(nèi)源性物質(zhì)及降解物，是連接天然免疫與特異性免疫的主要橋梁[5-6]。本次實驗發(fā)現(xiàn)模型組大鼠脾臟中TLR4 蛋白和基因的表達明顯減少，推測TLR 通路及下游中的相關因子會受到影響。TLR4 主要是通過觸發(fā)MyD88 進行細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，進而激活NF-κB 并啟動下游基因的表達。NF-κB由p50和p65構(gòu)成，通常p65與抑制蛋白IκB 結(jié)合將NF-κB 限定于細胞漿中。刺激條件下，外源性或/和內(nèi)源性配體與TLR4 結(jié)合并呈遞給胞內(nèi)MyD88，隨后通過級聯(lián)反應磷酸化并降解IκB，NF-κB與IκB解離并活化入細胞核啟動并調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄[10-11]。本實驗發(fā)現(xiàn)腎精虧虛模型組孕鼠脾臟內(nèi)的MyD88 和NF-κBp65 的mRNA 表達水平和蛋白表達水平都明顯下調(diào)，這表明腎精虧虛會降低孕鼠脾臟中的TLR4 的表達，并通過MyD88 的傳導作用于靶標因子NF-κBp65。補腎填精方左歸丸干預能顯著地逆轉(zhuǎn)模型孕鼠脾臟內(nèi)上述三種因子的下降，說明左歸丸能借助于激活TLR4/MyD88/NF-κBp65 通路來調(diào)控腎精虧虛引發(fā)的模型孕鼠免疫功能紊亂。臨床上已有研究開始探討腎虛與TLR4 及其下游免疫通路的關系。譚從娥等[23]發(fā)現(xiàn)右歸丸干預可以下調(diào)腎陽虛患者外周血中的TLR4 的表達而上調(diào)My D88 及NF-κB 的表達。這與本研究中左歸丸干預腎精虧虛大鼠脾臟中的TLR4 的變化趨勢相反，但是與My D88 及NF-κB 的變化趨勢一致。張揚等[24]發(fā)現(xiàn)溫腎方可提高腎陽虛型高丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平慢性乙型肝炎患者的外周血中的TLR4 活性以發(fā)揮其抗病毒療效。這與本研究中左歸丸干預腎精虧虛大鼠脾臟中的TLR4 的變化趨勢一致?？梢姡鼛啄?，TLR4/Myd88/NF-κB 通路在探究腎虛與免疫的關系中引發(fā)了較大的關注，但其具體的分子機制仍不清楚。

綜上所述，本實驗結(jié)果顯示腎精虧虛孕鼠的脾臟結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變，左歸丸干預可以有效改善這些變化，這能很好地補充已有的腎精虧虛相關的中醫(yī)藏象理論與實驗研究工作。本實驗結(jié)果進一步揭示腎精虧虛孕鼠脾臟中的TLR4、MyD88 和NF-κBp65 三種因子的mRNA 和蛋白質(zhì)表達水平都明顯下調(diào)，左歸丸干預可以有效逆轉(zhuǎn)該通路的下降趨勢，這說明該通路可能是補腎填精法治療腎精虧虛引發(fā)的免疫紊亂的靶標通路，為中醫(yī)藥治療腎精虧虛相關的免疫功能缺陷病證的研究提供了一定的依據(jù)。同時，中醫(yī)認為，腎為先天之本,脾為后天之本,生化之源,以滋養(yǎng)育胎。本實驗中的左歸丸干預不僅能有效改善孕鼠脾臟的結(jié)構(gòu)變化和TLR4/MyD88/NF-κBp65 免疫通路的變化也能顯著地提高孕鼠的生育能力，這進一步證實了基于機體的免疫調(diào)控機制來探討腎虛型胎漏、胎動欲墜等癥具有重要的臨床意義。