李仲娟，楊細(xì)風(fēng)，諶章舟，陳用軍

（1. 湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院 黃石 435003；2. 湖北省腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黃石 435003；3. 鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院 湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院 皮膚科 黃石 435000）

目前，點(diǎn)陣激光術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床皮膚疾病治療及皮膚美容[1]。激光術(shù)后的機(jī)體的狀態(tài)直接關(guān)系皮膚感染、皮膚修復(fù)過度等不良反應(yīng)。也有學(xué)者指出，臨床上長(zhǎng)期過度使用激光治療還會(huì)帶來一定的皮膚癌變風(fēng)險(xiǎn)[2]。這也是當(dāng)代皮膚疾病治療及皮膚美容技術(shù)的欠缺。作為臨床的一種治療手段，調(diào)節(jié)機(jī)體的狀態(tài)來彌補(bǔ)這些缺陷是非常必要。傳統(tǒng)中藥靈芝在《本草綱目》中記載靈芝具有益氣血、安心神、健脾胃的功效[3]?，F(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)純化的靈芝酸是靈芝中特有三萜類成分，也是機(jī)體免疫機(jī)能調(diào)節(jié)的主要活性成分[4]。在局部的皮膚修復(fù)及全身的抗癌免疫活動(dòng)中有重要作用[5]。本研究通過研究靈芝酸對(duì)點(diǎn)陣激光治療術(shù)后小鼠皮膚損傷，體內(nèi)的炎性反應(yīng)及與皮膚癌變風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的Bcl-2蛋白和p53蛋白的表達(dá)，來探討靈芝酸對(duì)點(diǎn)陣激光治療術(shù)后黏膜免疫中的防御機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)2 月齡KM 小鼠，體質(zhì)重25-35 g，雌性，共24 只，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物編號(hào)：SCXK（鄂）2015-0018。

1.1.2 主要儀器與試劑

吉林科英激光技術(shù)有限責(zé)任公司的二氧化碳點(diǎn)陣激光治療機(jī)，長(zhǎng)沙湘智速離心機(jī)，日本Olympus 的Bx53 顯微鏡，飛科fs360 電動(dòng)剃須刀。濃度為20 mg/mL 靈芝酸化合物由日本靈芝研究所友情提供，以熊果酸和齊墩果酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，靈芝酸的純度大于98%。IL-6，TNF-α 和IFN-γ 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。Bcl-2，p53 和Bax蛋白的免疫組化試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司。。

1.2 方法

1.2.1 CO2點(diǎn)陣激光照射小鼠皮膚

將小鼠隨機(jī)分成照射對(duì)照組和給藥組，每組12只在相同的環(huán)境下飼養(yǎng)一周，將小鼠背部?jī)蓚?cè)毛發(fā)用剃刀剔除干凈，使其皮膚裸露，將兩組小鼠送往黃石市中心醫(yī)院用歐洲之星2940 餌激光照射小鼠左側(cè)背部裸露皮膚，照射完成后給藥組立刻2 mg/kg的靈芝酸溶液灌胃，然后將小鼠置于適宜條件下飼養(yǎng)，第二天觀察小鼠點(diǎn)陣激光照射部位皮膚變化并記錄。兩組小鼠均為每周照射一次，并持續(xù)照射四周。

1.2.2 提取小鼠取血樣

點(diǎn)陣激光照射小鼠皮膚四周后，停止照射，將小鼠固定倒立，用剪刀剪開頸部皮膚和動(dòng)脈，用10 mL EP 管裝取頸部動(dòng)脈血，放置2 小時(shí)，轉(zhuǎn)速3000 r/min，離心10 min。取上層血清置于2 mL EP 管中，編號(hào)標(biāo)記放入冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 小鼠皮膚切片制作與HE染色

用剪刀和鑷子將取血后的小鼠背部點(diǎn)陣激光照射部位的皮膚剪下，將取下的樣本皮膚放入4%甲醛溶液中固定24 h。乙醇梯次脫水硬化后進(jìn)行包埋切片。切片樣本二甲苯脫蠟洗滌多次后，經(jīng)無水乙醇和純凈水的多次洗滌完成脫蠟。形成小鼠皮膚切片的樣片。

取樣片用蘇木精染液浸染5 min，純凈水洗去染液，用1%的鹽酸乙醇分化液洗滌10 s，0.5%伊紅液浸染3 min；85%乙醇洗滌脫水15 s，95%乙醇重復(fù)洗滌脫水后中性樹膠封固備用。

1.2.4 血液細(xì)胞因子的測(cè)定

IL-6、INF-γ或TNF-α按試劑盒檢測(cè)說明書進(jìn)行。取包被抗單克隆抗體96孔酶標(biāo)板，分別加入100 uL已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗體或各組小鼠的血清，37℃孵育1 h，洗3 次。再加入100 uL 酶標(biāo)抗抗體,繼續(xù)孵育1 h，洗3次后加入等量底物液，室溫孵育15 min，加入終止液后，酶標(biāo)板比色。已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗體繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本細(xì)胞因子水平。常溫下15 min 內(nèi)用450 nm 波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀檢測(cè)OD 值。IL-6、TNF-α、IFN-γ均以上述操作完成。

1.2.5 免疫組化法檢測(cè)p53 蛋白和Bcl-2 蛋白的表達(dá)分析

取小鼠皮膚切片的樣片，每張片子滴加一滴3%的過氧化氫，室溫下孵育5 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；滴加一滴稀釋倍數(shù)為1∶200 的p53 蛋白或Bcl-2 蛋白一抗工作液，37℃孵育2 h；用PBS 緩沖液沖洗5 min，重復(fù)洗滌3次；滴加辣根酶標(biāo)記的p53蛋白或Bcl-2 蛋白第二抗體工作液，37℃孵育30 min；再用PBS 緩沖液沖洗5 min，重復(fù)洗滌3 次；每張切片滴加1滴新鮮配制的DAB 液顯色20 min，最后用淡蘇木素復(fù)染細(xì)胞核30 s；不同濃度乙醇完成脫水；二甲苯洗滌后中性樹膠封固備檢。Bcl-2 和p53 陽性細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色，不顯棕黃色者為陰性細(xì)胞；采用數(shù)碼顯微鏡觀察并在高倍鏡下采集圖像，每張組織切片不少于3 個(gè)視野。圖像輸入免疫組化圖像分析系統(tǒng)，分析測(cè)定卵巢組織不同視野的平均光密度值。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 點(diǎn)陣激光術(shù)前后小鼠皮膚觀察

如圖1 所示，圖1A 為沒有進(jìn)行激光術(shù)的正常小鼠，其毛色光潔柔順；圖1B為照光后小鼠反則皮膚，剃毛后可見其皮膚光滑無損傷及瘢痕；圖1C為激光術(shù)后給藥組小鼠的皮膚，可見皮膚表面粗糙，有部分紅斑；與圖1D 相比的皮膚粗糙有結(jié)痂并伴有脫屑等臨床反應(yīng)要輕。圖2A 和圖2C 為未照光小鼠皮膚HE 染色圖片，圖2B 和圖2D 為照光小鼠皮膚HE 染色圖片，其中圖2C 和圖2D 為照射激光完成后給藥組立刻灌胃2 mL 0.2%的靈芝酸溶液小鼠。圖2A 和圖2C 表現(xiàn)正常皮膚特征，表皮細(xì)胞多層，纖維及膠原組織豐富，表皮和基底層分明。圖B中可見皮膚角質(zhì)層增厚伴隨大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。圖2D 中小鼠的表皮細(xì)胞層次較少，炎性反應(yīng)比圖2B 較輕。圖2 為多次試驗(yàn)中的代表。

圖1 實(shí)驗(yàn)四周后小鼠表皮的觀察（（A 空白小鼠；B 未照光皮膚；C 照光后給藥皮膚；D 照光后皮膚））

圖2 小鼠皮膚HE染色觀察

3.2 點(diǎn)陣激光術(shù)前后小鼠體內(nèi)炎性因子的分析

圖3 激光術(shù)后小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子的比較

圖4 小鼠Bcl-2和P53蛋白的表達(dá)分析

組相比有顯著性差異(P<0.01)，其中激光照射不給藥組中的IFN-γ 分泌151.9 ± 18.5 量比點(diǎn)陣給藥組要23.2±12.2 多。圖3B 顯示激光照射四周后，點(diǎn)陣組和給藥組小鼠血清中都分泌有TNF-α，兩組的TNF-α 分泌量與對(duì)照組相比有顯著性差異(P < 0.01),其中點(diǎn)陣組中的TNF-α 分泌量為87.2 ± 13.2，給藥組小鼠的TNF-α 分泌量為44.5 ± 5.6；圖3C 顯示激光照射四周后后，點(diǎn)陣組和給藥組小鼠血清中的IL-6濃度分別為26.7±4.1、19.2±6.4，與對(duì)照組相比有顯著性差異,其中點(diǎn)陣組和給藥組間也有顯著性差異(P<0.01)。

3.3 小鼠Bcl-2和P53蛋白的表達(dá)分析

圖4A 分別為未照光小鼠的皮膚樣片的Bcl-2 和P53 蛋白表達(dá)免疫組化染色。圖4B 和圖4C 分別為點(diǎn)陣組和給藥組的小鼠皮膚Bcl-2 和P53 蛋白表達(dá)染色圖片。圖4B 可見Bcl-2 和P53 蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽性，圖4C 可見Bcl-2 和P53 蛋白表達(dá)呈弱陽性。圖4 為多次試驗(yàn)中的代表。各組Bcl-2 和P53 蛋白表達(dá)情況經(jīng)單因素方差分析得：Bcl-2 和P53 蛋白28d 各組方差齊分別為（F=1.34，F(xiàn)=1.26，），進(jìn)一步經(jīng)LSD 法分析，給藥組與點(diǎn)陣組比較Bcl-2蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.4 小鼠Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)分析

圖5 為未照光小鼠的皮膚樣片的Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)免疫組化染色。蛋白表達(dá)免疫組化染色。Bcl-2 蛋白表達(dá)在點(diǎn)陣組顯示強(qiáng)陽性，在給藥組顯示弱陽性；Bax 蛋白表達(dá)在點(diǎn)陣組顯示弱陽性，在給藥組顯示強(qiáng)陽性。圖片為多次試驗(yàn)中的代表。Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)情況經(jīng)單因素方差分析得：28d 各組方差齊（F = 1.42；F = 1.38），進(jìn)一步經(jīng)LSD 法分析，點(diǎn)陣組與給藥組比較Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；根據(jù)其數(shù)值分別與對(duì)照分析發(fā)現(xiàn)，Bcl-2 在點(diǎn)陣組中的比值要大于給藥組；Bax 蛋白表達(dá)在點(diǎn)陣組中的比值要小于給藥組；兩者之間可能存在負(fù)相關(guān)。

4 討論

圖5 小鼠Bcl-2和Bax蛋白的比值分析

隨著醫(yī)療美容市場(chǎng)的蓬勃發(fā)展，點(diǎn)陣激光等激光設(shè)備得到了越來越廣泛的使用[7,8-10]。目前，有文獻(xiàn)報(bào)道，點(diǎn)陣激光的短期副作用主要是術(shù)后疼痛、皮膚感染、色素沉著等方面。但反復(fù)多次使用的安全性未見報(bào)道。有研究報(bào)道，p53 蛋白在經(jīng)過強(qiáng)脈沖激光長(zhǎng)期治療后皮膚中的表達(dá)明顯高于治療前，提示強(qiáng)脈沖激光治療導(dǎo)致的DNA 損傷可能會(huì)引起皮膚腫瘤的發(fā)生[11]。然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)能夠同時(shí)抗炎修復(fù)及防癌變作用的西藥。我國傳統(tǒng)中藥靈芝，早在漢代的《山海經(jīng)》中記載靈芝具有“久服延年、輕身不老”的功效。我國最早的藥學(xué)著作《神農(nóng)本草經(jīng)》也認(rèn)為是滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正培本的珍貴藥品[12]。另外，近代研究指出，靈芝酸能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫分子的功能介導(dǎo)局部及全身的免疫活動(dòng)[13]。靈芝酸在化妝品中的運(yùn)用目前主要集中在抗炎、抗過敏方面，Dudhgaonkar 等[14]對(duì)靈芝三萜的抗炎活性進(jìn)行研究表明，靈芝三萜能能抑制TNFα、IL-6、NO、PGE2的釋放，降低機(jī)體內(nèi)iNOS和COX-2的表達(dá)，陳偉也證明靈芝提取物對(duì)二甲苯鼠耳腫脹炎癥具有較好的抗炎作用[15-16]。圖1顯示，靈芝酸能夠顯著改變小鼠點(diǎn)陣激光術(shù)后表皮生長(zhǎng)狀態(tài)，HE 染色發(fā)現(xiàn)靈芝酸組小鼠體內(nèi)炎性細(xì)胞數(shù)量較其他點(diǎn)陣激光術(shù)后組別要少；圖3 通過測(cè)定機(jī)體炎性因子TNF-α、IL-6、IFN-γ發(fā)現(xiàn)，靈芝酸給藥組小鼠體內(nèi)三種細(xì)胞因子與點(diǎn)陣組有顯著性降低。這些結(jié)果與靈芝三萜的抗炎機(jī)理一致。

小鼠中的Bcl-2家族與細(xì)胞自噬相關(guān)，p53是抗癌衛(wèi)士。最近，Robert 認(rèn)為，細(xì)胞凋亡依賴于自噬機(jī)制。抑制Bcl-2 家族蛋白可以平衡細(xì)胞的自噬活動(dòng)［17］。靈芝酸在抗氧化和抗輻射預(yù)防癌變作用與Bcl-2 和p53家族蛋白的管理機(jī)理相關(guān)。研究指出，靈芝的水提物及醇提物清除DPPH 自由基從而阻止細(xì)胞基因突變[18]。Hsu 也證明證明靈芝提取物經(jīng)腹腔注射后可以提高經(jīng)X 射線照射后小鼠的存活量并能提高小鼠的體重，具有良好的抗輻射作用[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多次點(diǎn)陣激光治療后小鼠皮膚組織中Bcl-2 蛋白和p53 蛋白可出現(xiàn)陽性反應(yīng)，但給藥組小鼠皮膚組織中p53 蛋白和Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯減低，提示靈芝酸在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬活動(dòng)及抗癌變過程中具有重要調(diào)節(jié)作用。

隨著人們對(duì)“天然、綠色、安全、有效”消費(fèi)理念的追求，傳統(tǒng)藥物的代表靈芝的臨床價(jià)值會(huì)進(jìn)一步的挖掘。通過現(xiàn)代技術(shù)手段的評(píng)價(jià)后，會(huì)更科學(xué)合理的服務(wù)臨床。