林春發(fā),郝永峰,劉 娟,2? (.西南大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院中獸醫(yī)系,重慶 榮昌402460;2.重慶市高校獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心 中獸藥創(chuàng)新研發(fā)實(shí)驗(yàn)室,重慶 榮昌402460)

仔豬濕熱泄瀉是暑月炎天常發(fā)病癥,常導(dǎo)致仔豬小腸腸黏膜損傷。Notch信號(hào)通路是由Notch受體、Notch配體以及細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子3部分組成,是1條依賴于細(xì)胞間相互接觸傳遞的保守信號(hào)通路[1],既可促進(jìn)腸黏膜上皮細(xì)胞的增殖,在腸黏膜自我更新及維護(hù)腸黏膜完整性中也起著重要作用,又可決定腸黏膜上皮細(xì)胞的分化命運(yùn),調(diào)控腸黏膜上皮內(nèi)不同細(xì)胞的數(shù)量和比例,從而維持腸道在不同環(huán)境下結(jié)構(gòu)、功能的穩(wěn)態(tài)[2]。Hes-1、Hath-1 作為Notch信號(hào)通路下游的主要靶基因,決定著腸道上皮細(xì)胞的分化。Hes-1被激活時(shí),腸黏膜上皮細(xì)胞向吸收細(xì)胞系方向分化,Hath-1被激活時(shí),腸黏膜上皮細(xì)胞將向分泌細(xì)胞系方向分化[3-5],影響小腸內(nèi)分泌細(xì)胞的數(shù)量,維持不同環(huán)境下內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。

復(fù)方術(shù)苦芩是由西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院中藥創(chuàng)新研究室研發(fā),具有清熱燥濕、健脾和胃、利水止瀉等功效。前期研究[6]發(fā)現(xiàn)復(fù)方術(shù)苦芩在臨床上對仔豬濕熱泄瀉治療效果良好,通過改善胃腸功能、提高免疫、增強(qiáng)抗病能力、促進(jìn)腸黏膜修復(fù)、改善機(jī)體各類細(xì)胞因子等來發(fā)揮主要作用[7]。為此,本試驗(yàn)通過檢測復(fù)方術(shù)苦芩有效成分術(shù)苦芩多糖(ZKQPs)對濕熱泄瀉仔豬小腸Notch 信號(hào)通路中Notch-1、Hes-1和Hath-1的m RNA 表達(dá)量變化情況,進(jìn)一步闡明復(fù)方術(shù)苦芩有效成分ZKQPs對濕熱泄瀉仔豬小腸損傷修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料60只30～35日齡三元斷奶仔豬(長×大×榮昌),體質(zhì)量(10.0±0.3)kg,公母各半,由西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院統(tǒng)一購買。復(fù)方術(shù)苦芩,由 白術(shù)(5.5 份)、苦參(2.0 份)、黃芪(6.5份)、金銀 花(6.5 份)、白 頭 翁(5.5 份)、梔 子(2.5份)、黃芩(6.5份)、廣藿香(4.5份)組成,購自四川千金中藥飲片有限公司(批號(hào):160201);番瀉葉:購于安徽省毫州市德昌藥業(yè)有限公司,制備成每毫升含1 g生藥的番瀉葉提取液;白頭翁散:重慶天龍牧業(yè)科技有限公司(批號(hào):20170425)。RNA 提取試劑盒(UNIQ-10 柱式TRIzol總RNA 抽提試劑盒)購自生工生物工程(上海)股份有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自GoScriptTMReverse Transcription System;熒光定量試劑盒購自Ta KaRa SYBR?Premix ExTaqTMⅡ。

1.2 主要儀器設(shè)備酶標(biāo)儀,BIO-RAD 公司i Mark;熒光定量PCR 儀,TU-1950 Roche公司;高通道組織破碎機(jī),QIAGEN 公司Schwingmuhle TissuelyserⅡ;FX-IR170SX 型傅里葉變換紅外光譜儀,美國Nicolet公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藥物的制備 ZKQPs提取制備與鑒定:參考文獻(xiàn)[8-9],按比例稱取所需藥材共1 000 g,粉粹后加入8倍石油醚,置于多功能提取濃縮機(jī)組中,60℃回流提取3次;將藥渣加入6倍75%乙醇,回流提取2次,合并濾液,回收乙醇至無乙醇味,得濾液A;將醇提后藥物加入8 倍蒸餾水水提,提取3 次,得濾液B,合并濾液A、B,濃縮至1 g生藥/m L,加入無水乙醇至含醇量達(dá)80%進(jìn)行醇沉,4℃過夜,過濾,加水溶解濾渣,反復(fù)醇沉3次;將粗提的多糖加水溶解后,加入sevag試劑除蛋白(5 次以上,至幾乎無蛋白);進(jìn)行2次醇沉,最后分別依次加入無水乙醇、丙酮、乙醚進(jìn)行洗滌、純化(3次以上),將洗滌純化后的多糖置于電熱鼓風(fēng)干燥箱30℃干燥過夜,得多糖。參照文獻(xiàn)[10]對提取的ZKQPs進(jìn)行紅外光譜鑒定,取2～3 mg ZKQPs及適量溴化鉀,將其倒入瑪瑙研缽中混勻,壓片,然后放入傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行測試。選擇4 000和400 cm－1作為光譜基線起止點(diǎn),計(jì)算特征峰的高度比,檢測其是否存在糖苷鍵及糖的主要官能團(tuán)。

番瀉葉提取液:將番瀉葉水提3次,濃縮為1 g生藥/m L的溶液。

1.3.2 動(dòng)物分組與處理 參考文獻(xiàn)方法[11],將適應(yīng)性飼養(yǎng)1周的斷奶仔豬60頭隨機(jī)分為A、B 2組,A組為空白對照組(10頭),飼養(yǎng)于濕度65%～75%,25～27℃的圈舍中,給予正常飼料、自由飲水;B 組為造模組(50頭),將其飼喂于35～38℃,相對濕度90%～95%的圈舍中,并飼喂高脂配合飼料(豬油18%＋蔗糖1%＋酒糟5%,連續(xù)10 d,隔天加入1%番瀉葉提取液)、自由飲水。將B 組造模成功后的50頭仔豬隨機(jī)分為模型組、陽性藥物組、ZKQPs高、中、低劑量組,分圈飼養(yǎng),飼喂正常仔豬配合飼料,自由飲水。ZKQPs高、中、低劑量組仔豬分別給藥為75,50,25 mg/kg,2 次/d,陽性藥物組仔豬給予白頭翁散1.0 g/kg,于每天上午9點(diǎn),下午15點(diǎn),拌料給藥2次,連續(xù)給藥7 d。模型組與空白對照組仔豬,拌以等量生理鹽水,正常飼喂飼料、自由飲水。

模型成功判定標(biāo)準(zhǔn)[7]:當(dāng)仔豬出現(xiàn)精神沉郁(喜臥,不愿走動(dòng))、采食下降、口渴喜飲、排便次數(shù)增加、排稀糞或水樣便、肛門紅腫、肛周污穢、尿黃短赤、身體消瘦、被毛粗亂等癥狀時(shí)可判定模型建立成功。

1.3.3 ZKQPs對濕熱泄瀉仔豬療效 試驗(yàn)期間觀察仔豬臨床癥狀變化,記錄仔豬精神狀態(tài)、采食狀況、飲水量、糞形態(tài)、糞臭味、體溫、尿短黃、被毛、肛門異常等情況,評(píng)價(jià)ZKQPs對仔豬濕熱泄瀉的療效,計(jì)算有效率,有效率＝(痊愈數(shù)＋顯效數(shù)＋好轉(zhuǎn)數(shù))/總發(fā)病數(shù)×100%。

1.3.4 ZKQPs對濕熱泄瀉仔豬小腸組織中Notch-1、Hes-1、Hath-1 m RNA 的影響 試驗(yàn)結(jié)束后仔豬禁食12 h,每組隨機(jī)選取3只仔豬頸靜脈放血處死,剖解并采集小腸組織(十二指腸、空腸與回腸)。在每段小腸起始端2 cm 處采集各段小腸組織5 cm 冷凍保存,用于檢測Notch-1、Hes-1、Hath-1表達(dá)。登錄GenBank,根據(jù)已有的豬Notch-1、Hes-1 和Hath-1 和內(nèi)參基因β-actin mRNA 核苷酸序列,利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)相對應(yīng)的引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物信息見表1。仔豬小腸組織總RNA 提取嚴(yán)格參照UNIQ-10柱式TRIzol總RNA 抽提試劑盒說明書進(jìn)行操作。使用Promega 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(GoScriptTMReverse Transcription System),按照說明書方法將提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA,在Roche Light Cycler 96熒光定量PCR 儀上擴(kuò)增,共40個(gè)循環(huán),每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

表1 引物信息表

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用圖表和柱狀圖表示,采用單因素方差分析和多重比較實(shí)時(shí)熒光定量試驗(yàn)結(jié)果采用Bio-Rad CFX Manager 1.6軟件分析統(tǒng)計(jì),以GraphPad作圖。

2 結(jié)果

2.1 傅里葉變換紅外光譜法測定ZKQPs有效活性組分結(jié)果顯示(圖1),在紅外光譜圖4 000～400 cm－1的特征譜帶中,3 404.96 cm－1有很強(qiáng)的振動(dòng),說明是-OH的 伸 縮 振 動(dòng) 峰;1 741.82,1 625.79 cm－1存 在-COOH 收縮峰;1 402.64,1 262.81 cm－1處存在-C-H變角振動(dòng);在1 140.83,1 027.77,1 078.35 cm－1存在吡喃糖的特征吸收峰;834.38 cm－1處存在α-糖苷鍵。綜上所述,ZKQPs為含α-糖苷鍵的酸性吡喃型多糖。

2.2 ZKQPs對濕熱泄瀉仔豬的療效結(jié)果顯示,造模第3天開始,造模組仔豬陸續(xù)開始出現(xiàn)食欲減退,飲水次數(shù)增加,精神沉郁,糞便開始不成形,在造模第5天仔豬出現(xiàn)糞便溏稀、泄瀉如水樣、且腥臭,采食量大幅下降,飲水量增加,仔豬逐漸消瘦,被毛粗亂逆立,肛周有污物、肛門紅腫,可判定成功建立濕熱泄瀉模型。用藥后仔豬臨床癥狀出現(xiàn)好轉(zhuǎn);在給藥第5天時(shí),仔豬糞便基本成形,采食、飲水恢復(fù)正常。ZKQPs 高、中、低劑量組的有效率分別為90%,80%和70%;ZKQPs高、中、低劑量組的治愈率分別為80%,80%和50%(表2)。

圖1 ZKQPs紅外光譜圖

表2 ZKQPs對濕熱泄瀉仔豬臨床治療效果統(tǒng)計(jì)

2.3 ZKQPs對濕熱泄瀉仔豬小腸組織中Notch-1mRNA表達(dá)水平的影響試驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組仔豬十二指腸中Notch-1 mRNA 的表達(dá)量升高;ZKQPs各劑量組仔豬十二指腸的Notch-1 m RNA表達(dá)量均降低,ZKQPs高劑量組仔豬十二指腸中Notch-1 m RNA 的表達(dá)量,與模型組比較,差異顯著(P＜0.05)(圖2A)。如圖2A。模型組仔豬空腸中Notch-1 m RNA 的表達(dá)量升高;ZKQPs各劑量組仔豬空腸中Notch-1 mRNA 表達(dá)量均降低,與模型組比較,差異不顯著(P＞0.05)(圖2B)。模型組仔豬回腸中Notch-1 m RNA 的表達(dá)量升高;ZKQPs高、中、低劑量組仔豬回腸的Notch-1 mRNA 的表達(dá)量均降低,與模型組比較,差異極顯著(P＜0.01)(圖2C)。

2.4 ZKQPs對濕熱泄瀉仔豬小腸組織中Hes-1 mRNA表達(dá)水平的影響試驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組仔豬十二指腸中Hes-1 mRNA 的表達(dá)量升高;ZKQPs各劑量組仔豬十二指腸中Hes-1 m RNA 表達(dá)量均降低,其中ZKQPs高、中劑量組仔豬十二指腸中Hes-1 m RNA 的表達(dá)量,與模型組比較,差異極顯著(P＜0.01)(圖3A)。模型組仔豬空腸中Hes-1 mRNA 的表達(dá)量升高;ZKQPs各劑量組仔豬空腸的Hes-1 mRNA 表達(dá)量均降低,其中ZKQPs高、中劑量組仔豬空腸中Hes-1 m RNA 的表達(dá)量,與模型組比較,差異極顯著(P＜0.01)(圖3B)。模型組仔豬回腸中Hes-1 mRNA 的表達(dá)量升高;ZKQPs高、中、低劑量組仔豬回腸中Hes-1 mRNA 表達(dá)量均降低,與模型組比較,差異極顯著(P＜0.01)(圖3C)。

2.5 ZKQPs對濕熱泄瀉仔豬小腸組織中Hath-1 mRNA表達(dá)水平的影響試驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組仔豬十二指腸中Hath-1 m RNA 的表達(dá)量降低;ZKQPs高、中、低劑量組仔豬十二指腸中Hath-1 mRNA的表達(dá)量均升高,與模型組比較,差異極顯著(P＜0.01)(圖4A)。模型組仔豬空腸中Hath-1 m RNA的表達(dá)量降低;ZKQPs高、中、低劑量組仔豬空腸的Hath-1 m RNA 的表達(dá)量均升高,與模型組比較,差異極顯著(P＜0.01)(圖4B)。模型組仔豬回腸中Hath-1 m RNA 的表達(dá)量降低;ZKQPs高、中、低劑量組仔豬回腸的Hath-1 mRNA 表達(dá)量均升高,與模型組比較,差異極顯著(P＜0.01)(圖4C)。

圖2 仔豬各腸段組織Notch-1 mRNA 相對表達(dá)量 A.十二指腸組織Notch-1 m RNA 相對表達(dá)量;B.空腸組織Notch-1 m RNA 相對表達(dá)量;C.回腸組織Notch-1 m RNA 相對表達(dá)量;1.空白對照組;2.模型組;3.陽性藥物組;4.ZKQPs高劑量組;5.ZKQPs中劑量組;6.ZKQPs低劑量組。下同

3 討論

仔豬濕熱泄瀉多由高熱、高濕的環(huán)境使?jié)裥?、熱毒集聚仔豬體內(nèi),出現(xiàn)泄瀉現(xiàn)象。腸道是機(jī)體攝取營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所、是體內(nèi)最大的免疫組織器官、是保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要保障[12-13]。腸道黏膜層是腸道發(fā)揮其免疫功能的主要部位所在,主要包括黏膜上皮、固有層、黏膜肌肉層等。腸上皮細(xì)胞為單層柱狀細(xì)胞并彎曲褶皺形成絨毛-隱窩結(jié)構(gòu),腸黏膜上皮細(xì)胞主要由吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞3 部分組成,是腸道內(nèi)、外環(huán)境的界面,是食物消化、營養(yǎng)吸收、免疫等功能的主要組織細(xì)胞,也是腸道黏膜屏障的主要構(gòu)筑成分[14]。趙燕飛等[15]研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖具有改善小腸黏膜結(jié)構(gòu)和改善小腸營養(yǎng)物質(zhì)吸收的功能,多糖可從很多方面對腸道屏障進(jìn)行修復(fù);不僅可通過在腸上皮細(xì)胞表面形成類似于腸道屏障黏液層的親水凝膠層,也能通過降低腸黏膜通透性使腸道屏障得到保護(hù)[16-17]。復(fù)方術(shù)苦芩有效成分ZKQPs是由前期有效的處方復(fù)方術(shù)苦芩提取而來,經(jīng)紅外光譜鑒定證明為多糖物質(zhì)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)ZKQPs治療后,ZKQPs高、中、低劑量組的治愈率分別為80%,80%和50%;ZKQPs高、中、低劑量組的有效率分別為90%,80%和70%;表明ZKQPs對仔豬濕熱泄瀉有良好的治療效果。

圖3 仔豬各腸段組織Hes-1 m RNA 相對表達(dá)量 A.十二指腸組織Hes-1 mRNA 相對表達(dá)量;B.空腸組織Hes-1 m RNA 相對表達(dá)量;C.回腸組織Hes-1 m RNA相對表達(dá)量

圖4 仔豬各腸段組織Hath-1 m RNA 相對表達(dá)量 A.十二指腸組織Hath-1 mRNA 相對表達(dá)量;B.空腸組織Hath-1 m RNA 相對表達(dá)量;C.回腸組織Hath-1 m RNA 相對表達(dá)量

Notch信號(hào)通路是一條依賴于細(xì)胞間相互接觸傳遞的保守信號(hào)通路,在動(dòng)物發(fā)育過程中發(fā)揮著極為重要的作用;Notch 信號(hào)通路是由Notch受體、配體與DNA 蛋白結(jié)合而成的,在哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要有Notch-1～4 4種受體,其中Notch-1主要分布在腸道之中[18-20]。作為Notch 信號(hào)通路下游主要靶基因Hes-1、Hath-1 決定著腸道上皮細(xì)胞的分化[21-22],當(dāng)Notch-1激活后,激活靶基因Hes-1時(shí),腸黏膜上皮細(xì)胞向吸收細(xì)胞系方向分化,當(dāng)Notch-1與Hes-1被抑制,而Hath-1激活時(shí),腸黏膜上皮細(xì)胞將向分泌細(xì)胞系方向分化[23-24]。Notch信號(hào)通路促使腸黏膜上皮內(nèi)不同細(xì)胞間的數(shù)量和比例各不相同,從而維持不同的環(huán)境條件下腸道結(jié)構(gòu)的完整性、基本生理正常水平和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)仔豬發(fā)生濕熱泄瀉時(shí),仔豬小腸各腸段中的Notch-1、Hes-1表達(dá)量升高,Notch 信號(hào)通路中的Notch-1受體及Hes-1配體被激活,作為Hes-1競爭性配體Hath-1,在Notch-1受體及Hes-1配體被激活時(shí)受到抑制,從試驗(yàn)結(jié)果也能看出Hath-1的表達(dá)量在仔豬發(fā)生濕熱泄瀉時(shí)是降低,這是由于Notch-1受體及Hes-1配體的激活會(huì)使腸黏膜上皮細(xì)胞向吸收細(xì)胞系方向分化,分泌細(xì)胞相應(yīng)減少,進(jìn)而導(dǎo)致小腸內(nèi)黏液及相關(guān)物質(zhì)分泌不足,出現(xiàn)各種致病因素更加直接的侵襲小腸黏膜,使小腸黏膜受到損傷,病情加重。經(jīng)ZKQPs治療后發(fā)現(xiàn),仔豬小腸各腸段Notch-1、Hes-1的表達(dá)量降低,與之相反Hath-1的表達(dá)量升高;ZKQPs通過影響濕熱泄瀉仔豬小腸Notch 信號(hào)通路中Notch-1、Hes-1 和Hath-1的表達(dá)量,達(dá)到修復(fù)小腸腸黏膜的作用。綜上所述,ZKQPs 對濕熱泄瀉仔豬有治療效果。ZKQPs作用機(jī)理與其降低仔豬小腸Notch信號(hào)通路中Notch-1、Hes-1的表達(dá)量和升高Hath-1的表達(dá)量,以發(fā)揮ZKQPs對濕熱泄瀉仔豬小腸腸黏膜的修復(fù)作用,維護(hù)腸黏膜完整性有關(guān)。