高海嬌,徐 超,程古月,袁宗輝 (華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室(HZAU)/農(nóng)業(yè)部獸藥殘留檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢430070)

G 蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptros,GPCRs)是一種嵌入到脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)且完整的膜蛋白,分布于組織最廣泛的超大家族蛋白。根據(jù)跨膜結(jié)構(gòu)的相似程度可分為以下5個(gè)亞家族:A 族視紫紅樣受體家族(包括α和β亞家族),B 族分泌素樣受體家族,C族谷氨酸鹽樣受體家族,D 族黏附樣受體家族和E 族frizzled/Taste2家族[1-2]。這些受體能夠被胞外配體激活,包括蛋白,多肽,光,激素,離子和小分子等,從而通過(guò)細(xì)胞膜向G 蛋白傳達(dá)信號(hào)[3]。β腎上腺素能受體(β-adrenergic receptor,β-AR)屬于G 蛋白偶聯(lián)受體A 族視紫紅樣受體,由7次跨膜螺旋組成。β-AR 具有各自的藥理學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)的特點(diǎn),主要分為以下3 類:β1-AR、β2-AR 和β3-AR[4]。β1-AR 大 多 存 在 于 心 血管,主要引起血管舒張和增加心輸出量,β2-AR 主要存在于支氣管平滑肌以及骨骼肌,造成支氣管舒張[5]。目前報(bào)道β3-AR 存在脂肪細(xì)胞,在調(diào)節(jié)并釋放瘦蛋白發(fā)揮重要作用[6-7]。

腎上腺素受體興奮劑與β-AR 有較好的親和性,因此該受體廣泛用于β腎上腺素類藥物與蛋白的結(jié)合研究。本文將重點(diǎn)介紹β2-AR 的結(jié)構(gòu)和功能,并總結(jié)該受體的表達(dá)純化方式。分析β興奮劑受體蛋白中部分氨基酸突變對(duì)蛋白活性的影響以及β2-AR 在興奮劑殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。

1 β2腎上腺素能受體的結(jié)構(gòu)及活性中心

1.1 結(jié)構(gòu)組成β-AR 的組成包括:7 次螺旋跨膜(transmembrane,TM)結(jié)構(gòu),3個(gè)胞外環(huán)(extra-cellloop,ECL)和3 個(gè) 胞 內(nèi) 環(huán)(inner-cell-loop,ICL)。β2-AR 含 有3 個(gè) 糖 基 化 位 點(diǎn)(Asn6、Asn15 和Asn187)以及2個(gè)額外的螺旋肽,即螺旋Ⅷ和ECL2中段的短螺旋片段[8]。蛋白的7次跨膜結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)一系列的螺旋折疊,這些跨膜螺旋共同參與并形成一個(gè)“口袋”狀配基結(jié)合位點(diǎn)。與藥物的結(jié)合部位主要位于靠近胞外環(huán)的跨膜Ⅲ,Ⅴ,Ⅵ,Ⅶ以及胞外環(huán)ECL2[9]?？拷麅?nèi)的跨膜氨基酸及胞內(nèi)環(huán)主要結(jié)合G 蛋白并參與G 蛋白信號(hào)的傳導(dǎo)以及β-arrestin的招募[10]。β2-AR 以單體或者組成型二聚體形式動(dòng)態(tài)平衡的存在于細(xì)胞膜上,與細(xì)胞膜上的蛋白結(jié)合位點(diǎn)相互作用,并且維持一定的表達(dá)水平[11]。部分GPCR 以二聚體才能發(fā)揮功能如C 族γ氨基丁酸受體B,但β2-AR 的單體形式能夠保證蛋白發(fā)揮功能,并且與配體按1∶1結(jié)合[12-13]。

目前,人類的β2-AR 和鳥(niǎo)類的β1-AR 的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析。以人源β2-AR 為例,跨膜Ⅰ至Ⅶ對(duì)應(yīng)的氨基酸包括以下:TMⅠ29～60,TMⅡ67～96,TMⅢ103～136,TMⅣ147～171,TMⅤ197～229,TMⅥ267～298 和TM Ⅶ305～328,胞內(nèi)環(huán)包括ICL1,61～66;ICL2,137～146;ICL3,230～266;胞外環(huán)包括ECL1,97～102;ECL2,172～196;ECL3,299～304;以及短肽螺旋Ⅷ[14]。ECL1,ECL2 和ECL3分別連接TM2、TM3、TM4、TM5 和TM5、TM6[15-16]。TM1的Lys60和螺旋8的Glu338氨基酸殘基參與蛋白二聚體的形成,該位點(diǎn)的突變同N端羰基化位點(diǎn)突變產(chǎn)生相同的結(jié)果,進(jìn)一步說(shuō)明了N 端羰基化位點(diǎn)通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白的二聚而影響蛋白功能[17]。在TM3和TM6胞質(zhì)端,由(天冬氨酸/谷氨酸)精氨酸(色氨酸/酪氨酸)以及谷氨酸組成蛋白內(nèi)部非共價(jià)鍵來(lái)穩(wěn)定跨膜結(jié)構(gòu),β2-AR 是非保守序列,配基與蛋白結(jié)合時(shí),離子鎖被破壞,因此突變?cè)撐稽c(diǎn)時(shí)將改變蛋白活性[18]。

1.2 活性位點(diǎn)KOOISTRA 等[19]研究了GPCR晶體結(jié)構(gòu)并預(yù)測(cè)蛋白配體的功能。通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)與同源模型的建立,證明了蛋白構(gòu)象與配基結(jié)合的微小差異足夠影響功能發(fā)揮。在結(jié)構(gòu)模擬中,包含選定結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基靈活性或使用多晶體結(jié)構(gòu)或與不同配基結(jié)合的蛋白模型,從而系統(tǒng)得考慮了蛋白質(zhì)構(gòu)象和對(duì)接模擬的靈活性。目前人源β2-AR與配基結(jié)合的活性氨基酸以及作用機(jī)制已經(jīng)通過(guò)分子模擬或者對(duì)接等手段研究清楚[20]?；钚园被嶂饕挥赥M3,TM4,TM5,TM6,TM7 以及ECL2,表1總結(jié)了β2-AR 存在的化學(xué)鍵以及與藥物結(jié)合的活性氨基酸和作用方式。

1.2.1 二硫鍵 位于胞外環(huán)ECL2的2對(duì)半胱氨酸殘基Cys106/Cys191 和Cys184/Cys190 形 成 二 硫鍵,分別與ECL1和TM3相互作用,穩(wěn)定ECL2的結(jié)構(gòu)[14]。早在1990年HENRIK 通過(guò)放射性配基結(jié)合試驗(yàn)與二硫蘇糖醇競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合β2-AR 受體,證明了有至少2對(duì)二硫鍵即Cys106-191,184-190參與了藥物與配體的結(jié)合[21]。

1.2.2 氫鍵 β2-AR 與配基結(jié)合的主要作用力,包括Asp、Ser、Trp、Phe和Asn。PLAZINSKA 等[22]模擬了人源β2-AR 蛋白活化與非活化狀態(tài)下與藥物分子(非諾特羅)的結(jié)合模式,中心結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括TM3,TM5,TM6 和TM7?；罨腁sp-113 既可以與帶羥基的配基以氫鍵結(jié)合,Asn312也可以與羥基或者氨基以氫鍵結(jié)合,但在非活化狀態(tài)下無(wú)法與藥物相互作用[23]。Ser203,Ser204,Ser207 通過(guò)氫鍵鍵合了大部分的β興奮劑藥物,同時(shí),Ser165與Ser207聯(lián)合組成的活塞口袋也在蛋白發(fā)揮活性的過(guò)程中有著重要作用[24]。Trp286 和Phe290 殘基以高度保守的Trp286 為中心形成芳香環(huán)結(jié)合位點(diǎn),Trp286作為蛋白的活性撥動(dòng)開(kāi)關(guān),其旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體在蛋白活性與非活性狀態(tài)中相應(yīng)得發(fā)生變化,從而促使藥物與蛋白結(jié)合[25]。

1.2.3 疏水作用力 疏水活性中心主要由Val114,Val117,Ile169 和Phe290 組 成。Val114 是 高 度 保守序列,與藥物的乙醇胺單鏈或芳香環(huán)結(jié)合,該位點(diǎn)突變會(huì)降低與藥物的特異性結(jié)合但不影響蛋白的表達(dá)或者折疊[26]。Val117,Ile169 和Phe290 分別與藥物的氨基和苯環(huán)相互作用,形成疏水中心[27]。

表1 人源性β2-AR 的活性氨基酸及其作用方式

1.2.4 鹽橋 β2-AR 中參與鹽橋形成的位點(diǎn)包括以下:Lys60(TM1)和Glu338(helix8),Asp113(TM3)以及Asp192(ECL2)和Lys305(TM7)。上述已經(jīng)提及TM1的Lys60和螺旋8的Glu338參與了蛋白二聚體的形成,該氨基酸殘基同時(shí)也在蛋白的一系列正確折疊后形成了鹽橋。分子模擬中可觀察到激動(dòng)劑結(jié)合并激活蛋白的過(guò)程主要涉及2步,首先是配基上質(zhì)子化的氨基與Asp113(TM3)相互作用形成鹽橋,隨其螺旋5旋轉(zhuǎn)并暴露氫鍵結(jié)合位點(diǎn)與藥物相連[24]。分子模擬配基通過(guò)蛋白內(nèi)部的結(jié)合通道,發(fā)現(xiàn)ECL2中的Asp192和TM7的Lys305形成的鹽橋正處于配基進(jìn)入蛋白活性中心的通路中,當(dāng)配基正準(zhǔn)備結(jié)合蛋白時(shí),則破壞該鹽橋的形成,加速蛋白與配基的相互作用。不同類型的β腎上腺素受體模擬與藥物結(jié)合的氨基酸序列有一定差異,總的仍存在于ECL2和TM7上的氨基酸[28]。

2 β2興奮劑受體的表達(dá)方法

β2-AR 是7次跨膜蛋白,因其結(jié)構(gòu)的特異性以及多次跨膜,該蛋白一直處于低水平表達(dá)。以下總結(jié)了目前β2-AR 的表達(dá)方法,主要分為真核、原核細(xì)胞表達(dá),以及無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)(表2)。

2.1 真核細(xì)胞表達(dá)

2.1.1 CHO 細(xì)胞系 Chinese hamster ovary cell line(CHO)為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)株。HOFFMANN 等[29]在CHO 細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)蛋白β1-AR、β2-AR 和β3-AR,表 達(dá) 量 分 別 為(0.37±0.08),(0.28±0.02)和(0.38± 0.08)nmol/g。BAKER 等[30]在前人的基礎(chǔ)上,對(duì)火雞β1-AR 進(jìn)行突變,包括首尾氨基酸和內(nèi)環(huán)ICL3 部分堿基的刪除,以及熱穩(wěn)定性的6個(gè)堿基突變。在最終的突變體中,N 端刪除30個(gè)氨基酸,6個(gè)熱穩(wěn)定性突變體得到的蛋白含量最高,達(dá)到2.79 nmol/g,而野生型蛋白僅達(dá)到0.15 nmol/g。說(shuō)明對(duì)蛋白的氨基酸適當(dāng)?shù)倪M(jìn)行增減以及突變,能夠改變蛋白的表達(dá)量,但是與藥物的特異性結(jié)合還需要進(jìn)行后續(xù)分析。

2.1.2 HEK293 細(xì) 胞 Human embryonic kidney cells(HEK293)細(xì)胞為人源胚胎腎細(xì)胞。CHELIKANI等[31]構(gòu)建了四環(huán)素誘導(dǎo)的HEK293高度表達(dá)倉(cāng)鼠源β2-AR 蛋白的體系,該蛋白在膜蛋白中可得到蛋白(220.00±40.00)nmol/g,最終純化后可得到活性蛋白12.40 nmol/g。另外,王迪[32]用四板細(xì)胞瓶(15 cm)培養(yǎng)HEK293 細(xì)胞并表達(dá)倉(cāng)鼠源β2-AR 蛋白,最終得到純化蛋白2.25 nmol/g,一次純化 最 終 得 到 蛋 白135 μg。WANG 等[33]也 在HEK293細(xì)胞中表達(dá)豬源β2-AR 蛋白,但在膜蛋白中含有蛋白約17.00～23.00 nmol/g,一次得到純化蛋白160.00μg。PARMAR 等[34]在β2-AR 的N 端添加了黃色熒光蛋白(YGP),在HEK293細(xì)胞中表達(dá)野生型與突變型的人源β2-AR 蛋白,野生型蛋白可得到(2.78±0.30)nmol/g蛋白,突變型蛋白的表達(dá)量比野生型降低了85%。

表2 β2-AR 的表達(dá)水平

2.1.3 Sf9細(xì)胞 桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)是利用桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞(spodoptera frugiperda,Sf9)從而獲得受體。該系統(tǒng)是目前表達(dá)G 蛋白較為成熟的一種表達(dá)體系,能夠保證蛋白功能的完整性。KOBILKA 等[35]最初通過(guò)N 端添加16個(gè)短肽作為信號(hào)序列和Flag標(biāo)簽,C 端添加His標(biāo)簽,在昆蟲(chóng)-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白獲得可溶性蛋白23.00 nmol,經(jīng)過(guò)鎳親和純化可獲得具有親和性的蛋白6.00 nmol。HAMPE 等[36]通過(guò)N 端麥芽糖標(biāo)簽,C端6His標(biāo)簽構(gòu)建的β2-AR 融合蛋白分別在大腸桿菌和桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)。桿狀病毒獲得了較大腸桿菌更高的表達(dá)量,大腸桿菌表達(dá)6.00 nmol/g,而 昆 蟲(chóng) 細(xì) 胞 則 表 達(dá)17.00 nmol/g。PARKER 等[37]在昆蟲(chóng)細(xì)胞中首次表達(dá)了一系列的C端截短的火雞β1-AR 致使表達(dá)量有極大的提高,方便了去垢劑的溶解并且依然保持其調(diào)節(jié)活性,通過(guò)用亮氨酸代替116位非保守的半胱氨酸也會(huì)使表達(dá)量提高。為增加蛋白的表達(dá)量,可對(duì)氨基酸進(jìn)行突變,通常是增加GC含量,或者在不影響蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu),將疏水氨基酸突變?yōu)橛H水性氨基酸。

2.2 原核細(xì)胞表達(dá)利用大腸桿菌表達(dá)真核β-AR蛋白比真核細(xì)胞表達(dá)簡(jiǎn)單快速,但是原核細(xì)胞無(wú)法正確折疊蛋白也不能修飾,無(wú)法保證蛋白功能的完整性。β2-AR 是7次跨膜蛋白,對(duì)于大腸桿菌來(lái)說(shuō),表達(dá)跨膜蛋白會(huì)對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生一定的毒性,細(xì)菌會(huì)停止生長(zhǎng)從而導(dǎo)致表達(dá)量低,蛋白錯(cuò)誤折疊[38]。DANYI等[39]在基因改造后的大腸桿菌KS303 的內(nèi)膜上表達(dá)重組人源β2-AR,并通過(guò)β興奮劑與放射性配基競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合蛋白,最終可得蛋白濃度達(dá)到(0.38±0.02)nmo L/g。WANG 等[40]利用了大腸桿菌無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系表達(dá),通過(guò)優(yōu)化豬源β2-AR 密碼子使之盡可能多在大腸桿菌提取物中表達(dá),表達(dá)量可達(dá)到1.10 g/L(約22.00 nmo L/g),但是蛋白的活性比真核細(xì)胞表達(dá)的蛋白低。大腸桿菌無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系是模擬原核細(xì)胞的胞內(nèi)環(huán)境,人為的不斷添加底物和能量以維持環(huán)境的穩(wěn)定,但因?yàn)槿鄙俜g后修飾導(dǎo)致蛋白活性不高。

3 β2興奮劑受體的突變及親和性研究

目前突變研究最多的是人源β2-AR,包括蛋白的跨膜區(qū)點(diǎn)突變和N 端截短突變,表3總結(jié)了β2-AR 受體蛋白相關(guān)突變研究,蛋白的親和性主要參考抑制常數(shù)和半數(shù)有效量。

李曉娜[41]通過(guò)突變Asn6Gln和Asn15Gln除去N 端的2個(gè)糖基化位點(diǎn),在HEK293細(xì)胞中表達(dá)后顯示膜蛋白的表達(dá)水平無(wú)顯著性變化(突變體蛋白的表達(dá)量為野生型的0.8倍),但降低了蛋白二聚體的形成,影響異丙腎上腺素作用下β2-AR 對(duì)G 蛋白信號(hào)的激活,而187位的糖基化位點(diǎn)不影響受體的二聚。YAO 等[42]對(duì)跨膜TM3和TM6區(qū)域組成離子鎖的氨基酸進(jìn)行突變,包括Ile135Trp、Ala271Cys,同時(shí)突變5 個(gè)位點(diǎn)的絲氨酸。在SF9細(xì)胞中表達(dá)的突變體破壞了離子鎖,對(duì)于部分激動(dòng)劑如沙丁胺醇來(lái)說(shuō)不如完全激動(dòng)劑如異丙腎上腺素的親和性,異丙腎上腺素的抑制常數(shù)比沙丁胺醇小20多倍。TM2的122位谷氨酸是位于螺旋表面的非保守氨基酸,與TM 4-3-5螺旋上的氨基相互作用形成,維持空間結(jié)構(gòu)。ROTH 等[43]研究該氨基酸突變?yōu)槭杷被崛缟彼釙r(shí),能近10倍得增加蛋白的熱穩(wěn)定性(野生型半衰期3.00 min,突變型Glu122Trp半衰期27.80 min),蛋白表達(dá)量也增加了1.5倍,但是藥物的親和性下降了50%,顯示對(duì)異丙腎上腺素的抑制常數(shù)增大了1.0 倍。PARMAR等[34]突變TM1帶電荷氨基酸和螺旋8的遠(yuǎn)測(cè)部,通過(guò)生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移等方法測(cè)定蛋白二聚體的形成,突變Lys60Glu 和Glu338Ala后破壞了蛋白二聚體形成,使蛋白滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在眾多的突變體中,蛋白的表達(dá)量與野生型蛋白相比相差不多甚至更少,蛋白的親和力也沒(méi)有得到很大的提升,表明該受體非活性氨基酸的突變對(duì)蛋白的表達(dá)量和親和力沒(méi)有明顯改變。

表3 人源性β2-AR 的突變研究

4 β2興奮劑殘留篩選的受體分析方法

目前,興奮劑藥物殘留檢測(cè)主要還是以儀器方法和免疫學(xué)方法為主。儀器方法包括高效液相色譜法(HPLC)和氣/質(zhì)聯(lián)用分析法(GC/MS),最低檢測(cè)限分別可達(dá)到鹽酸克倫特羅0.25μg/L和萊克多巴胺0.50μg/L[44-45]。免疫分析法是以抗原抗體的特異性、可逆性結(jié)合為核心反應(yīng)的分析方法,該方法具有快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、處理量大等特點(diǎn)。由于抗體的特異性高,只能同時(shí)檢測(cè)一種或少數(shù)幾種藥物[46-47],如LIU 等[48]合成半抗原SAL 并獲得抗體后建立酶聯(lián)免疫分析方法,測(cè)得的沙丁胺醇的最低檢測(cè)限為0.02μg/L。受體分析法是基于興奮劑與β2-AR 結(jié)合,類似于免疫分析法中抗原與抗體的結(jié)合,一般采用β2-AR 作為受體,結(jié)合多種標(biāo)記技術(shù)以提高靈敏度,如同位素標(biāo)記和酶標(biāo)記等[49](表4)。

4.1 放射性受體分析方法CHARM 法采用放射免疫受體分析技術(shù)檢測(cè)興奮劑的殘留,通常先將待測(cè)樣品與一定量的受體反應(yīng),然后加入一定量的同位素(3H 或125I)標(biāo)記藥物,反應(yīng)平衡后,離心除去未與受體結(jié)合的標(biāo)記藥物,測(cè)定結(jié)合的標(biāo)記藥物的放射性,根據(jù)結(jié)合率推算樣品中待測(cè)藥物的含量[50]。二氫阿普洛爾(dihydroalprenolol,DHA)和氰基吲哚洛爾(cyanopindolol,CYP)作為β受體拮抗劑,能夠特異性結(jié)合β2-AR,并能與其余的興奮劑藥物產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用。NODA 等[51]最早測(cè)定β2-AR 蛋白活性并獲得高親和性的野生型蛋白,與[125I]CYP 的親和性Kd值為35.60 pmol/L。因此,該類方法皆通過(guò)放射性標(biāo)記這2種藥物并測(cè)得β2-AR 對(duì)配體的親和性。

MEENAGH 等[52]在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(CHO)表達(dá)受體蛋白,利用[3H]DHA 檢測(cè)了沙美特羅、馬布特羅、克倫特羅、西馬特羅和萊克多巴胺,其中對(duì)沙美特羅的親和性最高,半數(shù)抑制濃度(50%inhibition concentration(IC50))為87.50μg/L,抑制常數(shù)Ki為54.58μg/L,對(duì)萊克多巴胺的親和性最低(IC50為3 313.25μg/L,Ki為20 722.89μg/L)。BOYD 等[53]在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(NCB20-D1 cells)中表達(dá)人源性可溶蛋白β2-興奮劑受體,也通過(guò)3H標(biāo)記DHA 檢測(cè)上述5種藥,該類藥物對(duì)沙美特羅的親和性最高,其IC50為112.90μg/kg,最低檢測(cè)限為12.10μg/kg。DANYI等[39]在大腸桿菌KS303表達(dá)人源性可溶蛋白β2-興奮劑受體,通過(guò)[125I]CYP檢測(cè)該類藥物,測(cè)得對(duì)克倫特羅的親和性最高(IC50為15.67μg/L,Ki為6.58μg/L)。放射性受體分析方法靈敏度高,常用于檢測(cè)興奮劑與β2-AR 受體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,并研究后續(xù)G 蛋白偶聯(lián)受體的信號(hào)傳導(dǎo)功能[39]。但該方法采用了放射性同位素標(biāo)記藥物,容易造成放射性污染并對(duì)人體有一定的傷害,阻礙了實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。

表4 β2-AR 的受體分析方法

4.2 酶標(biāo)記受體分析方法酶標(biāo)記受體法是基于受體配體間特異性相互作用和酶標(biāo)記技術(shù)而建立的一種檢測(cè)技術(shù),類似于ELISA 檢測(cè)方法。通過(guò)包被物即受體蛋白,酶標(biāo)記物即常規(guī)的辣根過(guò)氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)以及競(jìng)爭(zhēng)方法等方面的不同組合建立檢測(cè)模式。

CHENG 等[54]采用倉(cāng)鼠的β2-興奮劑受體作為受體蛋白,在昆蟲(chóng)細(xì)胞SF9 中表達(dá),表達(dá)量為50.00μg/L。分別以HRP-克倫特羅,HRP-沙丁胺醇,HRP-萊克多巴胺作為酶標(biāo)記藥物,建立了直接競(jìng)爭(zhēng)方法,分別檢測(cè)這3 類藥物,孵育檢測(cè)時(shí)間為1 h,IC50分別為33.28,52.50和32.96μg/L,其中對(duì)萊克多巴胺識(shí)別力最強(qiáng),其最低檢測(cè)量達(dá)到5.20μg/L。WANG 等[33]采用豬腎細(xì)胞的β2-興奮劑受體作為受體蛋白,在人胚腎細(xì)胞(HEK293)中表達(dá)。以HRP-克倫特羅為酶標(biāo)記藥物,用于檢測(cè)豬肝腎組織中的克倫特羅,沙丁胺醇和萊克多巴胺,IC50分別為34.00,53.00和63.00μg/L,最低檢測(cè)量達(dá)到4.00μg/L。WANG 等[40]克隆豬腎細(xì)胞的β2-興奮劑受體,采用無(wú)細(xì)胞表達(dá)蛋白系統(tǒng)純化表達(dá),純化后的蛋白含量高達(dá)800.00 mg/L(約16 nmol/g),與真核細(xì)胞HEK239 細(xì)胞的總膜蛋白表達(dá)量(17.00～23.00 nmol/g)近似,但是無(wú)細(xì)胞表達(dá)后的蛋白活性比在HEK293中降低10%～20%,對(duì)克倫特羅,沙丁胺醇和萊克多巴胺的IC50分別為45.99,60.38和78.02μg/L,說(shuō)明無(wú)細(xì)胞表達(dá)純化的活性蛋白含量減少。

5 展望

β2-AR 受體是G 蛋白偶聯(lián)受體最重要的一員,在受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。但是因?yàn)?次跨膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)致不能大量異源表達(dá),阻礙了蛋白的研究發(fā)展。本文綜述了β2-AR 蛋白在原核以及真核細(xì)胞的表達(dá),真核細(xì)胞能夠保證蛋白活性,但是蛋白表達(dá)量只能達(dá)到nmo L/g,遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到蛋白的需求。在蛋白的突變研究中,包括點(diǎn)突變和截短突變,表達(dá)量和親和力與野生型蛋白相差不大,還需要深入研究。因該蛋白較強(qiáng)的生物活性和親和力,能夠與興奮劑相互作用,因此廣泛用于興奮劑的殘留篩選。目前檢測(cè)的藥物包括克倫特羅,萊克多巴胺,沙丁胺醇,最低檢測(cè)限為4μg/L,但是對(duì)其他興奮劑藥物的識(shí)別還不能達(dá)到檢測(cè)水平。放射性標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果比酶標(biāo)記更為精確,但放射性物質(zhì)污染環(huán)境不能投入使用,只能在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中使用。因此,還需要繼續(xù)開(kāi)發(fā)檢測(cè)方法,優(yōu)化檢測(cè)條件。

G 蛋白偶聯(lián)受體在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,因此需要更加清晰研究7次跨膜蛋白的分子結(jié)構(gòu)以及與小分子藥物之間的相互作用機(jī)理。同時(shí)開(kāi)發(fā)或改造不同的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)為擴(kuò)大蛋白表達(dá)做準(zhǔn)備。