李英，李潔康，唐慧，張曉艷，馬凌波，徐慧玲，李冬妹*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002； 2 石河子大學(xué)科研處，新疆 石河子 832002；3 石河子市婦幼保健院，新疆 石河子 832000； 4 蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 73000)

卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒，又名人類8型皰疹病毒(human herpesivirus-8，HHV-8)[1]。該病毒引發(fā)的卡波氏肉瘤(kaposi’s sarcoma,KS)是艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)最常并發(fā)的腫瘤和死亡原因之一。KSHV 能引發(fā)原發(fā)性滲出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma,PEL)和多中心 Castleman’s 病(multicentric castleman’s disease,MCD)[2]，還與多發(fā)性骨髓瘤，血管肉瘤，惡性皮膚腫瘤和鱗狀細(xì)胞癌有關(guān)[3]。

在我國(guó)，新疆是KSHV的高感染區(qū)，由KSHV感染引發(fā)的經(jīng)典型卡波氏肉瘤主要見于新疆的維吾爾族人和哈薩克族人[4]。同時(shí)，新疆也是艾滋病的高發(fā)區(qū)，因此由KSHV感染引起的疾病在新疆的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)更高。

本研究前期檢測(cè)了新疆地區(qū)卡波氏肉瘤患者和正常人的KSHV感染率，并通過抑制性差減雜交和Affymetrix 表達(dá)譜芯片比較了4對(duì)KSHV感染的卡波氏肉瘤組織與正常皮膚組織差異表達(dá)基因[5]，依據(jù)基因差異表達(dá)譜和Connectivity Map Database數(shù)據(jù)庫(kù)提供的信息，利用生物信息學(xué)方法，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物信息學(xué)系協(xié)助預(yù)測(cè)了可能逆轉(zhuǎn)病毒持續(xù)感染的藥物，其中小白菊內(nèi)酯(parthnolide,PTL)是顯著性較高的藥物。小白菊內(nèi)酯是醫(yī)用草本植物小白菊的主要活性成分，為倍半萜內(nèi)酯類化合物。小白菊內(nèi)酯具有抗炎、抗病毒等多種藥理作用[6]，近年來大量的體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)小白菊內(nèi)酯具有明顯的抗腫瘤作用[7]。本研究嘗試?yán)肒SHV感染細(xì)胞系研究小白菊內(nèi)酯對(duì)KSHV感染細(xì)胞是否具有抑制作用。此研究將為開發(fā)抗KSHV感染藥物，抑制KSHV致病性和治療相關(guān)疾病提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小白菊內(nèi)酯購(gòu)于Sigma公司，高糖DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、嘌呤霉素、G418購(gòu)于GIBCO公司，潮霉素購(gòu)于Invitrogen 公司，CCK-8購(gòu)于Biosharp公司，1%結(jié)晶紫購(gòu)于Solarbio公司，兔抗人Cyclin D1購(gòu)于Bioworld Technology公司，鼠抗人Bcl-2購(gòu)于博奧森公司，山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG購(gòu)于zsbio公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SK-RG細(xì)胞(KSHV感染的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)培養(yǎng)于含 10% 的胎牛血清、6 μg/mL 嘌呤霉素的高糖 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，islk.219細(xì)胞(KSHV感染的內(nèi)皮來源的細(xì)胞)采用含 10% 的胎牛血清、6 μg /mL 嘌呤霉素、100 μg /mL G418 和100 μg/mL潮霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，BCBL-1細(xì)胞(KSHV感染的淋巴瘤細(xì)胞)在含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這3種細(xì)胞在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以 8×103個(gè)/孔種植于96孔板中。在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，加入相應(yīng)濃度的小白菊內(nèi)酯，每個(gè)濃度設(shè) 4 個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8試劑37 ℃ 孵育4 h，酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm 處光密度(optical density，OD)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，用軟件 GraphPad Prism 5.01 計(jì)算 IC50。據(jù)IC50，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組并重復(fù)此實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)不同濃度的小白菊內(nèi)酯處理細(xì)胞24 h，48 h后的OD值。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以400個(gè)/100 mm2皿的密度接種于培養(yǎng)皿中，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，處理組加入不同濃度的小白菊內(nèi)酯，對(duì)照組加入等體積的生理鹽水。后在37 ℃，5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞集落形成，終止培養(yǎng)。PBS清洗3次，4%多聚甲醛進(jìn)行4 ℃ 固定20 min，用1%的結(jié)晶紫染料染30 min，雙蒸水洗去染液，室溫自然干燥后，計(jì)數(shù)(≥50個(gè)細(xì)胞為一個(gè)克隆)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

將islk.219細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于六孔板中，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，加入相應(yīng)濃度的小白菊內(nèi)酯處理24 h后，吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌2 次，加入適量的RIPA裂解液(使用前以1∶100的比例加入PMSF)，冰上裂解30 min，然后4 ℃，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，電泳90 min后轉(zhuǎn)膜。膜用含5%脫脂奶粉的1×TBST室溫封閉2 h，加入一抗(Cyclin D1 1∶1 000，Bcl-2 1∶1 000，β-actin 1∶1 000)，4 ℃ 孵育過夜，用1×TBST洗膜3次，每次5 min。二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h，用1×TBST洗膜3次，每次5 min，發(fā)光試劑顯色3 min，后進(jìn)行壓片顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同濃度小白菊內(nèi)酯組數(shù)據(jù)之間比較采用單因素方差分析，兩個(gè)樣本之間的比較采用配對(duì)樣本的t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8確定小白菊內(nèi)酯對(duì)KSHV感染細(xì)胞的IC50

采用CCK-8的方法檢測(cè)利用不同濃度的小白菊內(nèi)酯處理KSHV感染細(xì)胞islk.219、SK-RG、BCBL-1 24 h后的吸光度，用軟件GraphPad Prism 5繪圖并計(jì)算這3種細(xì)胞的IC50。Islk.219、SK-RG、BCBL-1細(xì)胞的IC50分別為21.08 μmol/L、10.75 μmol/L、13.65 μmol/L(圖1)。

圖1 小白菊內(nèi)酯處理KSHV感染細(xì)胞24 h后的IC50

2.2 小白菊內(nèi)酯使islk.219和SK-RG細(xì)胞形態(tài)改變

不同濃度的小白菊內(nèi)酯處理islk.219和SK-RG細(xì)胞24、48 h后，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)(200×)，islk.219和SK-RG細(xì)胞隨著小白菊內(nèi)酯濃度的升高和時(shí)間的增加，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化。

islk.219細(xì)胞隨著時(shí)間和濃度的升高，細(xì)胞膨大、腫脹、變圓、脫落，而SK-RG細(xì)胞變圓，細(xì)胞質(zhì)突起減少甚至消失，并且明顯可以看見脫落的細(xì)胞(圖2)。

圖2 小白菊內(nèi)酯處理KSHV感染細(xì)胞后形態(tài)改變情況(200×)

2.3 小白菊內(nèi)酯抑制islk.219、SK-RG、BCBL-1細(xì)胞的增殖

采用CCK-8與平板克隆法，檢測(cè)小白菊內(nèi)酯對(duì)KSHV感染細(xì)胞增殖的影響。與未加小白菊內(nèi)酯處理的對(duì)照組相比，用不同濃度小白菊內(nèi)酯處理的細(xì)胞的生長(zhǎng)情況均受到不同程度的抑制，并且隨著藥物濃度的增高，細(xì)胞增殖率隨之降低，呈濃度依賴性(圖3A、3B、3C)。與對(duì)照組相比，小白菊處理組的平板克隆數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05(圖3D、3E、3F)。

注：圖中A-C：小白菊內(nèi)酯處理islk.219、SK-RG、BCBL-1細(xì)胞24、48 h后的OD值；D-F：平板克隆結(jié)果，與對(duì)照組相比，P<0.01圖3 小白菊內(nèi)酯對(duì)KSHV感染細(xì)胞增殖的影響

2.4 小白菊內(nèi)酯降低islk.219細(xì)胞Bcl-2、Cyclin D1蛋白的表達(dá)水平

采用Western Blot 檢測(cè)小白菊內(nèi)酯對(duì)KSHV感染細(xì)胞islk.219的抗凋亡蛋白Bcl-2、和周期相關(guān)蛋白Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響。

結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，小白菊內(nèi)酯處理組的抗凋亡蛋白Bcl-2和周期相關(guān)蛋白Cyclin D1的蛋白量表達(dá)降低，并且隨著小白菊內(nèi)酯濃度升高，抗凋亡蛋白Bcl-2和周期相關(guān)蛋白Cyclin D1的蛋白表達(dá)越來越低，具有濃度依賴性(圖4)。

圖4 小白菊內(nèi)酯對(duì)KSHV感染細(xì)胞Bcl-2、Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

目前，抗KSHV感染的藥物主要為抗病毒藥物，如阿昔洛韋、更昔洛韋、西多福韋等，其通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制皰疹病毒的DNA聚合酶從而抑制病毒的復(fù)制[8]。KSHV編碼的vMIP-I、vMIP-II 和vMIP-III蛋白具有促進(jìn)血管生成的作用[9]。因此，臨床上也用抗血管生成藥物來治療KS。例如：伊馬替尼、索拉非尼、阿瓦斯汀等[10]。盡管抗病毒藥物和抗血管生成藥物在一定程度上能緩解相關(guān)疾病的病癥。但是，這些療法并不完善，具有一定的不良反應(yīng)。阿昔洛韋會(huì)引起頭暈、嘔吐、靜脈炎、皮膚瘙癢，高劑量的靜脈注射可能會(huì)引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)障礙，大劑量的突擊注射可能會(huì)發(fā)生急性腎小管壞死。長(zhǎng)期服用索拉非尼會(huì)有心臟缺血、高血壓、胃腸道穿孔的危險(xiǎn)。因此，開發(fā)新的抗KSHV感染的藥物具有重要的意義。

近年來大量的實(shí)驗(yàn)表明，小白菊內(nèi)酯對(duì)多種癌癥具有抗腫瘤作用，如對(duì)白血病、鼻咽癌、非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、乳腺癌、黑色素瘤等[11]。小白菊內(nèi)酯還具有誘導(dǎo)一些寄生蟲死亡[12]，增強(qiáng)化療藥物和放療對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷的作用，并且其毒副反應(yīng)微弱。我們?cè)谇捌诘膶?shí)驗(yàn)中，也提示小白菊內(nèi)酯對(duì)于KSHV病毒的致病性可能有作用。然而，小白菊內(nèi)酯能否作為抗KSHV感染的藥物，還有待于研究，因此開展了本項(xiàng)研究。

KSHV感染的細(xì)胞主要以內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)KSHV還可以感染神經(jīng)元細(xì)胞并且能成功表達(dá)病毒基因[13]，我們采用islk.219(KSHV感染的內(nèi)皮來源的細(xì)胞)、SK-RG(KSHV感染的神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞)、BCBL-1(KSHV感染的淋巴瘤細(xì)胞)進(jìn)行CCK-8和平板克隆實(shí)驗(yàn)(BCBL-1細(xì)胞是懸浮細(xì)胞，所以未進(jìn)行此實(shí)驗(yàn))。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小白菊內(nèi)酯能抑制KSHV感染細(xì)胞的增殖，尤其是在平板克隆實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，小白菊內(nèi)酯處理組細(xì)胞的克隆數(shù)顯著減少(P<0.01)。

為了進(jìn)一步了解小白菊內(nèi)酯在蛋白水平上，對(duì)增殖和凋亡的影響，我們進(jìn)行了Western Blot實(shí)驗(yàn)。存活基因Bcl-2有抑制凋亡的作用，它所編碼的蛋白質(zhì)定位于線粒體內(nèi)膜、核周膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，其可通過抑制Casepase酶系和阻礙細(xì)胞色素C的釋放，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)凋亡刺激因子的耐受力[14]，從而抑制細(xì)胞凋亡。Cyclin D1蛋白是一種原癌基因，它能誘導(dǎo)細(xì)胞從G1 期進(jìn)入S 期，并具有促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的功能[15]，在促進(jìn)細(xì)胞增殖中起著十分重要的作用。因此，用Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Bcl-2和Cyclin D1蛋白的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小白菊內(nèi)酯能使KSHV感染細(xì)胞的Bcl-2和Cyclin D1的蛋白表達(dá)水平下降,并呈濃度依賴性。

綜上所述，我們得出結(jié)論小白菊內(nèi)酯可以通過影響KSHV感染細(xì)胞中Bcl-2和Cyclin D1蛋白的表達(dá)，使抗凋亡蛋白和周期蛋白降低，從而誘導(dǎo)KSHV細(xì)胞發(fā)生凋亡，為臨床進(jìn)一步防治KSHV感染提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。