陳龍，曲麗媛，劉雪瀅，王航宇，張珂*，王金輝,3

(1 石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002； 2 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150081； 3深圳弘?yún)R醫(yī)藥科技有限公司，廣東 深圳 518000)

苦豆子(Sophoraalopecuroides)為豆科(Leguminosae)槐屬植物，其全草、根及種子均可入藥，最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載苦豆子藥材具有清熱解毒、抗菌消炎、利尿去火、止痛鎮(zhèn)靜等功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究苦豆子中生物堿具有良好的藥理作用，如苦參堿具有保護(hù)心血管系統(tǒng)[1]、抗肝損傷[2]、抗腫瘤[3]等作用。郝偉亮等[4]結(jié)合2005—2015年苦豆子相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)苦豆子化學(xué)成分和藥理作用進(jìn)行綜述，吐爾孫阿衣等[5]對(duì)苦豆子定量定性方法、提取方法以及臨床應(yīng)用進(jìn)行進(jìn)行簡(jiǎn)單綜述。目前研究表明，苦豆子藥材中含有20多種生物堿，含量約為6.11%～8.03%，其結(jié)構(gòu)屬于喹諾里西啶類，根據(jù)母核結(jié)構(gòu)不同，分為苦參堿型、苦豆堿型、金雀花堿型、鷹爪豆堿型和羽扇豆堿型、蘇苦西堿型6類生物堿，且不同類型的生物堿結(jié)構(gòu)十分相似[6]。

由于中藥中成分復(fù)雜，傳統(tǒng)的提取分離方法費(fèi)時(shí)耗力，傳統(tǒng)的鑒別方法僅能夠?qū)λ幉闹心硯追N成分進(jìn)行定性或定量分析，缺乏對(duì)其系統(tǒng)化的研究。本研究結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)苦豆子分子離子峰和特征碎片離子進(jìn)行解析，推斷化學(xué)結(jié)構(gòu)和可能存在的化合物。旨在建立一種超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜方法(ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole-Mass Spectrum，UPLC-TQ-MS)定性分析苦豆子藥材成分的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器及耗材

超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters ACQUITY UPLC-Xevo TQ-MS，美國(guó)Waters公司)，實(shí)驗(yàn)制水機(jī)(Milli-Q Advantage A10，美國(guó)Millipore公司)、超聲儀(KQ-300DE，昆山市超聲儀器有限公司)、渦旋混合儀(IKA3617025，德國(guó)IKA公司)。

BakerbondTMSPE 固相萃取柱(C18-3 mL，美國(guó)J.K.Baker公司)、一次性油系濾器(尼龍膜，0.22 μm，13 mm，Biosharp公司)

1.2 材料

苦豆子經(jīng)鑒定為豆科槐屬植物苦豆子SophoraalopecuroidesL.的干燥果實(shí)。

1.3 試劑

乙腈、甲醇和甲酸均為質(zhì)譜級(jí)(美國(guó)霍尼韋爾公司)，實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自制(電阻率≥18.2 MΩ·cm)。

1.4 供試品樣品的制備和凈化

將干燥的苦豆子藥材粉碎，過40目篩，精密稱取1.0 g粉末，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，室溫下超聲提取30 min，取上清液離心(8000 r/min，10 min),吸取離心后上清液過SPE柱凈化。

分別吸取甲醇、水5 mL活化平衡SPE柱，吸取待凈化的上清液1 mL注入SPE柱內(nèi)，甲醇2 mL洗脫供試品，收集洗脫液，過0.22 μm濾膜，進(jìn)樣分析。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

液相條件：色譜柱Waters ACQUITY BEH C18(2.1×100 mm，1.7 μm)，柱溫：35 ℃，樣品池溫度：4 ℃，流速0.2 mL/min；流動(dòng)相：A-乙腈，B-0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫(0～16 min，10%～35% A；16～16.5 min，35%～95% A；16.5～20 min，95%～95% A)。

質(zhì)譜條件：(1) 離子源為電噴霧離子源(ESI)，正離子模式檢測(cè)，質(zhì)量掃描范圍(m/z)50～1200 Da，毛細(xì)管電壓 2 kV，錐孔電壓 50 V，離子源溫度 150 ℃，脫溶劑溫度 450 ℃，脫溶劑氣流速 550 L/h；(2) 依據(jù)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)篩查建立子離子MS/MS全掃描，方法為：設(shè)定其母離子質(zhì)量，質(zhì)量掃描范圍(m/z)50～1200 Da，碰撞能量范圍(V)30～50，其余質(zhì)譜參數(shù)同 (1)；(3) 依據(jù) (2) 中選擇相應(yīng)的共用離子對(duì)，建立母離子MS/MS全掃描，方法為：設(shè)定其子離子質(zhì)量質(zhì)量掃描范圍(m/z)50～1200 Da，碰撞能量范圍(V)30～50，其余質(zhì)譜參數(shù)同 (1)。

1.6 質(zhì)譜檢測(cè)分析

首先參考文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)篩查建立子離子MS/MS全掃描質(zhì)譜分析方法，根據(jù)母離子和特征離子信息解析確定質(zhì)譜裂解規(guī)律，再根據(jù)以上信息確定化合物結(jié)構(gòu)。最后根據(jù)共用離子對(duì)進(jìn)行母離子MS/MS全掃描分析，根據(jù)以上裂解規(guī)律和母離子信息推測(cè)可能存在的未知化合物，圖1為正模式下苦豆子總離子流色譜圖。

圖1 苦豆子正模式下總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatography of sophora alopecuroides in positive mode

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜裂解規(guī)律和結(jié)構(gòu)解析

2.1.1 四環(huán)型苦參堿類的質(zhì)譜裂解規(guī)律

質(zhì)譜裂解途徑見圖2，可知其裂解方式可能為兩種，其一是失去2個(gè)H形成分子內(nèi)雙鍵(m/z247)，接著失去一分子C3H3NO，產(chǎn)生特征離子(m/z176)，失去一分子C2H2，得到特征離子(m/z148)，最后中性碎片(CH2)丟失得到(m/z122)。其二是先發(fā)生β裂解和分子內(nèi)重排，得到特征離子(m/z148)，接著發(fā)生RDA裂解，得到(m/z112)，最后中性碎片丟失得到(m/z98)。

根據(jù)以上裂解規(guī)律分析質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果，m/z176和148碎片離子的存在可作為判斷四環(huán)苦參堿型成分的依據(jù)，表1中所列四環(huán)苦參堿型化合物都基本滿足該條件，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)篩查[7-8]，可判斷其結(jié)構(gòu)式。

如圖3質(zhì)譜圖中信息可知，其母離子離子峰m/z249.24、m/z148.03 [M+H-C5H10NO]、m/z111.80 [M+H-C8H10NO]和m/z86.07 [M+H-C10H12NO]推測(cè)其為苦參堿或槐定堿。

圖2 苦參堿-四環(huán)型化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律Fig.2 Mass spectrometric fragmentation of matrine-tetracyclic compounds

圖3 苦參堿-四環(huán)型化合物質(zhì)譜圖譜Fig.3 Mass spectrogram of matrine-tetracyclic compounds

2.1.2 鷹爪豆堿-四環(huán)型的質(zhì)譜裂解規(guī)律

鷹爪豆堿質(zhì)譜裂解規(guī)律見圖4。其質(zhì)譜裂解規(guī)律歸納為，首先發(fā)生β裂解和分子內(nèi)重排得到(m/z186)，接著中性碎片丟失得到特征離子(m/z148)，m/z148可發(fā)生結(jié)構(gòu)互變，經(jīng)過一系列的中性碎片丟失，得到(m/z112;98)。四環(huán)苦參堿類和鷹爪豆堿類化合物在質(zhì)譜裂解行為中都會(huì)出現(xiàn)失去2個(gè)H，形成具有雙鍵結(jié)構(gòu)的季胺離子，這種離子的裂解與沒有失去2個(gè)H的離子的過程基本一致，都會(huì)發(fā)生一系列的中性碎片丟失。根據(jù)以上質(zhì)譜裂解規(guī)律分析質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果，從圖5中可知，其母離子離子峰m/z233.10、經(jīng)過一系列中性碎片丟失得到m/z98.00，推測(cè)其結(jié)構(gòu)為苦豆堿[9]。

圖4 鷹爪豆堿-四環(huán)型化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律Fig.4 Mass spectrometric fragmentation of sparteine-tetracyclic compounds

圖5 鷹爪豆堿-四環(huán)型化合物質(zhì)譜圖譜Fig.5 Mass spectrogram of sparteine-tetracyclic compounds

2.1.3 金雀花堿-三環(huán)型化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律

根據(jù)其質(zhì)譜裂解規(guī)律，分析質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果，由圖7中信息可知，其母離子離子峰m/z191.22，經(jīng)過一系列裂解得到特征離子峰m/z160.20、148.16和134.16，推測(cè)其可能為金雀花堿結(jié)果如圖6所示。

圖6 金雀花堿-三環(huán)型化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律Fig.6 Mass spectrometric fragmentation of sophorine-tricyclic compounds

圖7 金雀花堿-三環(huán)型化合物質(zhì)譜圖譜Fig.7 Mass spectrogram of sophorine-tetracyclic compounds

總結(jié)以上裂解規(guī)律，并對(duì)其質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，分別鑒定了苦參堿-四環(huán)型、鷹爪豆堿-四環(huán)型、金雀花堿-三環(huán)型和羽扇豆堿-二環(huán)型這四類化合物，并歸納總結(jié)如表1所示，因TQ-MS/MS無(wú)法對(duì)一類別的同分異構(gòu)體進(jìn)行分別，因此，其同分異構(gòu)體仍需要其他分析方法進(jìn)行區(qū)分。

表1 苦豆子化學(xué)成分分析結(jié)果Tab. 1 Analysis of chemical constituents of sophora alopecuroides

2.2 根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律對(duì)未知化合物的表征

本研究共鑒定出8個(gè)未知化合物，如圖8所示，對(duì)比于已報(bào)道的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)為苦豆子中首次被發(fā)現(xiàn)的化合物。

化合物(1)根據(jù)其質(zhì)譜圖中顯示特征離子m/z177.07、122.02和m/z527.43[2 M+H]，考慮到生物合成和與氧化槐果堿裂解途徑類似，推測(cè)其氧自由基被還原成羥基，其分子式為C15H22N2O2，其可能結(jié)構(gòu)如圖8所示。

化合物(5)和(6)與氧化苦參堿質(zhì)譜裂解規(guī)律相似，其都有特征離子m/z247.17;178.04;121.95，考慮其極性及質(zhì)譜圖差異，其結(jié)構(gòu)如圖8所示。

化合物(2)、(3)、(4)除都有m/z247.17;178.04;121.95這些特征離子外，還顯示存在m/z279.37、264.32和m/z280.81、265.01這種類似的離子對(duì)，依據(jù)前面所述這類生物堿都會(huì)發(fā)生中性碎片丟失和失去2個(gè)H的質(zhì)譜裂解，且都是成對(duì)存在于整個(gè)裂解過程中，因此，推測(cè)其可能連有甲基，結(jié)構(gòu)如圖8所示。

圖8 預(yù)測(cè)苦豆子中未知化合物結(jié)構(gòu)Fig.8 Prediction of unknown compounds in sophora alopecuroides

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首次采用UPLC-TQ-MS/MS方法對(duì)苦豆子中化學(xué)成分進(jìn)行快速鑒別，共定性分析了四類生物堿成分，深入研究并總結(jié)其中三類生物堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律；基于其質(zhì)譜裂解規(guī)律，推測(cè)出了7種可能的苦豆子未知化合物。但本研究無(wú)法快速區(qū)分其生物堿類同分異構(gòu)體，需要結(jié)合其他分析手段進(jìn)行區(qū)分。

本研究采用正模式下MS/MS檢測(cè)分析的方法，而并沒有采用負(fù)模式的檢測(cè)分析方法，原因?yàn)椋簩?shí)驗(yàn)選用ESI電噴霧離子源，是質(zhì)譜中常用的軟電離源，在正模式下，檢測(cè)物可以得到正電荷，形成離子[M+H]+、[M+K]+或[M+Na]+；在本實(shí)驗(yàn)中主要檢測(cè)的是生物堿，容易得到離子而帶正電荷，根據(jù)質(zhì)譜離子源的電離方式和生物堿在質(zhì)譜分析的電離規(guī)律，生物堿易在正電離模式下得到電荷而形成正離子，如果本實(shí)驗(yàn)采用負(fù)模式的分析方法，被檢測(cè)的生物堿既不易被質(zhì)譜打碎形成帶有負(fù)電荷的離子，且由于選擇的電離方式不妥影響質(zhì)譜分析靈敏度，可能丟失被測(cè)物中微量的化學(xué)成分信息；因此選擇正離子模式分析苦豆子化合物。

目前，苦豆子中總生物堿的常用檢測(cè)方法為薄層色譜和HPLC檢測(cè)法，李永春[10]對(duì)提取得到的總生物堿提取液進(jìn)行薄層色譜定性分析，以乙酸乙酯-乙醇-氨水(5∶1∶0.5)為展開系統(tǒng)，碘化鉍鉀為顯色劑一次可以分析出8個(gè)總生物堿提取物內(nèi)的單體化合物，但需要與單體化合物標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)比對(duì)；高紅英[11]采用HPLC法檢測(cè)了不同采收期內(nèi)苦豆子中苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、9α-OH苦參堿和苦豆子堿A含量，但對(duì)其他化合物無(wú)法進(jìn)行表征，具有一定的局限性；本研究采用UPLC-TQ-MS方法對(duì)苦豆子中生物堿成分進(jìn)行定量分析，具有以下優(yōu)勢(shì)：(1) 針對(duì)傳統(tǒng)提取方法的不足，本方法僅需超聲提取即可用于檢測(cè)分析，與傳統(tǒng)提取分離方法相比具有操作簡(jiǎn)單、分析快捷和節(jié)約成本等特點(diǎn)。(2) 傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如薄層色譜[12]和HPLC[13]法，雖然可以分析苦豆子中部分生物堿，但對(duì)于苦豆子系統(tǒng)性化學(xué)成分的分析仍有所欠缺，且傳統(tǒng)檢測(cè)方法需要價(jià)格昂貴的標(biāo)準(zhǔn)品作為參考，本研究?jī)H需要其中幾種標(biāo)準(zhǔn)品作為參照確定結(jié)果準(zhǔn)確性，即可對(duì)苦豆子中可能存在的化合物進(jìn)行表征。(3) UPLC與HPLC相比具有分析時(shí)間短，進(jìn)樣量少等特點(diǎn)，質(zhì)譜分析具有靈敏度高、檢測(cè)限低等特點(diǎn)，本研究采用UPLC-TQ-MS方法可以對(duì)苦豆子中含量極低的成分進(jìn)行檢測(cè)，這是其他分析方法不具備的特點(diǎn)。同時(shí)，苦豆子中化學(xué)成分的含量隨季節(jié)更替也有一定的變化[14]，采用高靈敏度、低檢測(cè)限、檢測(cè)時(shí)間短的分析方法可以得到更加全面準(zhǔn)確的結(jié)果。因此，本研究可為定性分析研究苦豆子藥材生物堿類化學(xué)成分提供可靠依據(jù)。