蔣國芳

(泉州師范學院海洋與食品學院，福建泉州 362000)

0 引言

昆蟲是地球上種類多、數(shù)量大的一類生物群體。為應對外界復雜的生境，昆蟲經(jīng)過長期的進化，逐漸發(fā)展并形成了高度靈敏和復雜的嗅覺系統(tǒng)[1-3]。昆蟲通過嗅覺系統(tǒng)識別生境中的各種化學氣味分子，以引導昆蟲進行覓食、交配、選擇產(chǎn)卵地點和躲避天敵等生命活動[4-6]。昆蟲的嗅覺系統(tǒng)包含多種嗅覺蛋白，如氣味結合蛋白(Odorant-Binding Proteins，OBPs)、化學感受蛋白(Chemosensory Proteins，CSPs)、氣味受體(Odorant Receptor，OR)、離子型受體(Ionotropic Receptor，IR)和感覺神經(jīng)元膜蛋白(Sensory Neuron Membrane Proteins，SNMPs)等[7，8]，這些嗅覺蛋白能夠與環(huán)境中的化學氣味分子相互作用。探索昆蟲對外界氣味分子的識別機制，有助于了解昆蟲的寄主識別、種間互作和種內(nèi)交流等行為，還可為害蟲防治和預測預報提供新的途徑和思路。

蝗蟲是農(nóng)林牧業(yè)的重要經(jīng)濟昆蟲。作為世界上最古老的作物蟲災——蝗災一直影響著人類的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生活[9]。千百年來，人們對蝗蟲開展了大量的研究，取得了豐碩的成果[10]。本文重點綜述蝗蟲氣味結合蛋白和化學感受蛋白方面的研究進展。

1 蝗蟲氣味結合蛋白

氣味結合蛋白(OBPs)是昆蟲化學感覺系統(tǒng)(由觸角和上頜、唇瓣組成)的重要分子元件。氣味結合蛋白在昆蟲覓食和繁殖過程中扮演非常重要的角色。OBPs是一類分子量為14—17 kDa的水溶性球蛋白，由120—150個氨基酸組成，在N端有一段疏水性信號肽，由18—20個氨基酸組成，可促使蛋白分泌到細胞外[11,12]。氣味結合蛋白在不同昆蟲種間的序列相似性較低，但典型OBPs結構中一般存在6個保守的半胱氨酸，并且這6個保守半胱氨酸形成3個二硫鍵，可以對蛋白三維結構起到穩(wěn)固作用[13-15]。目前依據(jù)保守的半胱氨酸的數(shù)量和特征，可將OBPs分為Classic OBPs、Plus-COBPs、DimerOBPs和Minus-COBPs 4種亞型[16,17]。

1.1 氣味結合蛋白的種類及鑒定

首個東亞飛蝗(Locustamigratoria)OBP基因由Ban等[18]克隆鑒定出來，實驗表明油酰胺和α-戊基肉桂與該OBPs有很強的結合親和力。之后，Yu等[19]于2007年通過N末端氨基酸測序技術在東亞飛蝗觸角中鑒定出LmigOBP1的兩個亞型，LmigOBP1c和LmigOBP1d。Yu等[20]于2009年發(fā)現(xiàn)2個新的OBP，即LmigOBP2和LmigOBP3，它們在氨基酸序列上與之前報道的LmigOBP1有很大差異。2018年研究者從飛蝗觸角和唇須轉(zhuǎn)錄組中鑒定出2種編碼新型氣味結合蛋白(OBP15和OBP16)的序列[21]。

2005年首個CSPs和OBPs在沙漠蝗(Schistocercagregaria) 中被克隆出來[22]。隨后鑒定出沙漠蝗2個經(jīng)典OBPs的保守亞家族，分別命名為Ⅰ-A和Ⅱ-A，其具有共同的亞家族特異性氨基酸基序[23]。

Zhang等[24]鑒定了生活在中國北方草原的亞洲小車蝗(Oedaleusasiaticus)的15個OBPs(OasiOBP1-15)；該蝗蟲與東亞飛蝗關系密切，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，其OBPs最初是由一個共同的祖先進化而來，但它們獨特的化學感覺系統(tǒng)適應不同的生態(tài)系統(tǒng)。之后，Zhang等[25]從黃脛小車蝗(Oedaleusinfernalis)整體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中推測出18個OBPs。

Li等[26]從黃脊竹蝗(Ceracriskiangsu)頭部轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫中鑒定了8個OBP基因；Yuan等[27]在青脊竹蝗(Ceracrisnigricornis)中鑒定出20個OBPs。近期，Cui等[28]用轉(zhuǎn)錄組學方法鑒定出中華稻蝗(Oxyachinensis)18個OBPs、13個CSPs、94個OR、12個IR和2個SNMP的編碼基因。

1.2 氣味結合蛋白表達分布特征

Yu等[21]通過蛋白質(zhì)印跡(Western blot)試驗，發(fā)現(xiàn)LmigOBP2存在于飛蝗觸角、口器和尾須中，但在這些組織中均未檢測到LmigOBP3。另有學者研究了東亞飛蝗胚胎中化學感受器的發(fā)育以及OBPs和CSPs的分泌；Trichogen細胞首先參與形成釘子的結構，然后在回縮后，它們開始在感受器淋巴中分泌OBPs和CSPs[29]。LmigOBP1的合成始于孵化前0.5 h左右的胚胎發(fā)生時期，尤其是在觸角的毛狀感受器和基部感受器中；而LmigOBP2僅見于觸角毛狀感受器的外感受器淋巴(OSL)，而在任何類型的觸角感受器中均未檢測到LmigOBP3；抗血清實驗數(shù)據(jù)表明，在蝗蟲中OBPs和CSPs具有不同的時間表達模式，并且在不同類型的感受器中表達。也有人證實飛蝗大部分氣味結合蛋白和化學感受蛋白在跗節(jié)中都有大量的表達[30]。高博[31]采用雙染色熒光原位雜交技術明確了東亞飛蝗幾種化學感受蛋白的共表達特征，為探討氣味感受通路奠定基礎。徐笑[32]對16個LmigOBP基因在不同組織、發(fā)育階段、性別中的表達模式進行系統(tǒng)性的研究，探討飛蝗OBPs的功能。近期，Li等[21]運用RT-PCR和實時定量PCR (qRT-PCR)分析明確了16個LmigOBP基因中有11個在觸角和唇須中共同表達，OBP4、OBP10和OBP16基因僅在觸角中表達，OBP6基因在雄性唇須中的相對表達水平遠高于雌性，OBP8基因在若蟲中高度表達。

表達譜分析發(fā)現(xiàn)沙漠蝗OBP基因和CSP基因同時在若蟲和成蟲的觸角、跗節(jié)、唇須、翅和其他散居和群居型蝗蟲的器官中表達。免疫細胞化學實驗表明：CSP-Ⅰ和CSP-Ⅲ存在于外感覺淋巴和觸角的表皮和角質(zhì)層之間的子表皮空間，而氣味結合蛋白存在感覺淋巴中[22]。Jiang等[23]闡明了2個亞家族OBPs成員的表面拓撲結構和內(nèi)腔結構。對Ⅰ-A亞家族和Ⅱ-A亞家族SgreOBPs基因的觸角拓撲表達顯示出不同的感器和細胞特異性表達模式。這些發(fā)現(xiàn)使我們對蝗蟲OBP的分子和進化特征及其在觸角上的表達有了初步了解，有助于進一步了解不同OBP亞家族在蝗蟲嗅覺中的具體作用。Pregitzer等[33]分析了14個OBP亞型基因在沙漠蝗觸角中的表達和感受器特異性。沙漠蝗觸須中只有少量的基本感受器，但有大量的毛形感受器。采用不同的研究方法發(fā)現(xiàn)，只有一部分觸角OBP基因在2種觸覺類型中都有表達。這些OBP基因以前被證明在觸角的基底感受器或觸角感受器中表達。比較兩種感受器的表達模式，發(fā)現(xiàn)在觸須的2種感受器中均有OBP6和OBP8兩種亞型基因的表達，而在觸角上只有1種感受器中有這兩種亞型的表達。總而言之，這些數(shù)據(jù)表明在觸覺的2種感受器中，OBP基因的表達存在差異，但部分重疊。觸角和觸須之間OBP亞型基因表達模式的差異可能表明OBP基因在這兩種化學感覺器官中具有不同功能。

亞洲小車蝗11個OBP基因在觸角和口器中特異性表達，此外4個OBP基因在翅中也有表達[24]。OasiOBP9和OasiOBP10在觸角中特異表達；其他的OBP基因表達在觸角以及其他化學感受器，如口器和翅；OasiOBP7在雄性觸角中的表達量明顯高于雌性觸角，但實時定量PCR顯示有9個OBP基因在雌性觸角中的表達量高于雄性觸角[24]。

Li等[26]發(fā)現(xiàn)黃脊竹蝗OBP1、OBP2和OBP8基因在觸角中的相對表達量明顯高于其他OBP基因，表明這3個OBP基因在蝗蟲的氣味識別中起重要作用。Yuan等[27]通過qRT-PCR檢測證實了大多數(shù)嗅覺相關差異表達基因(DEG)在青脊竹蝗觸角中富集。在這些基因中，有一些是性別偏向的，這表明它們在青脊竹蝗嗅覺系統(tǒng)中具有不同作用。

半定量RT-PCR分析表明，中華稻蝗6個OBP基因、1個CSP基因和2個IR基因在觸角中特異表達，提示它們在嗅覺中起作用。qRT-PCR分析表明，在觸角中唯一或主要表達的基因在雄性和雌性之間的表達水平也有顯著差異。在差異表達的基因中，17個OR基因、1個CSP基因和1個SNMP基因表現(xiàn)出雌性偏向表達，表明它們可能參與雌性特有的行為，如尋找產(chǎn)卵地點，而其余3個OR編碼基因則表現(xiàn)出雄性偏向表達，這表明它們可能在感知雌性信息素方面發(fā)揮作用[28]。

1.3 氣味結合蛋白氨基酸序列特征與三維結構

東亞飛蝗給農(nóng)作物造成了巨大的損失，特別是它們經(jīng)常以蝗災的形式肆虐世界?；认x通過嗅覺系統(tǒng)找到它們?nèi)∈车闹参锼拗鳎瑲馕督Y合蛋白在其中起重要作用。Yu等[20]發(fā)現(xiàn)東亞飛蝗的2個新的氣味結合蛋白LmigOBP2和LmigOBP3在氨基酸序列上存在很大差異，并且與已報道的LmigOBP1有很大的不同；此外，LmigOBP3還含有3個額外的半胱氨酸，這一事實以前沒有記錄在標準長度的OBP1中[18]。然而，LmigOBP2和LmigOBP3這兩種蛋白與一組有機化合物表現(xiàn)出驚人的結合親和力。這種驚人的結合親和力得到了三維模型的支持，顯示LmigOBP2和LmigOBP3的折疊非常相似，但與LmigOBP1的折疊明顯不同。此外，排列在3種蛋白結合袋中的幾個氨基酸殘基在LmigOBP2和LmigOBP3中似乎是保守的，但在LmigOBP1中不是。

Jiang等[34]通過同源建模，建立了飛蝗LmiOBP1的三維模型?；谠撃Ｐ偷膶幽M表明，LmiOBP1的Asn74是一個關鍵的結合位點，這一點通過定點突變和熒光分析得到了驗證。進而，Zheng等[35]解決了第一個LmicOBP1結構，它是溶液中的單體，二硫鍵在維持其功能方面起關鍵作用；他們發(fā)現(xiàn)飛蝗LmigOBP1具有獨特的由第7個α-螺旋形成的一個L形內(nèi)部疏水空腔壁，以容納線性配體，這與結合實驗一致；還證明了LmiOBP1中的配體結合口袋與最接近的蚊子同源OBP中的配體結合口袋有很大的不同。

上述研究為設計防治蝗蟲的小分子抑制劑提供了結構依據(jù)。

1.4 氣味結合蛋白生理功能

氣味結合蛋白OBPs在昆蟲對外界氣味分子的嗅覺識別中起著非常重要的作用。為了獲得更多關于飛蝗化學通訊元件的信息，Yu等[19]尋找其他氣味結合蛋白和糞便中可能代表該物種潛在信息化學物質(zhì)的揮發(fā)物。對一種觸角提取物的雙向電泳(2DE)分析表明，僅有3個緊密定位點可被蝗蟲OBP抗血清識別。用PCR和5′RACE-PCR方法還鑒定了3個基因，它們編碼同一氨基酸替代的彼此不同的亞型。一份糞便樣品的氣相色譜-電觸角(GC-EAD)頂空分析顯示，在兩性觸角中存在幾種引起劑量依賴性電生理反應的化合物。這些化合物中的大多數(shù)與沙漠蝗糞便中發(fā)現(xiàn)的化合物不同，據(jù)報道具有行為活性。用這些揮發(fā)物和重組OBP進行的配體結合實驗沒有顯示出親和力，表明飛蝗OBP的結合口袋需要比迄今已鑒定出的配體更大的分子。

氣味結合蛋白可能是通過干擾害蟲的化學通訊來控制害蟲種群的可能靶標。在東亞飛蝗的觸角中雖然已經(jīng)檢測到4種異構體，但僅發(fā)現(xiàn)1個單一的OBP,LmiOBP1[18]。Jiang等[34]使用67種揮發(fā)性氣味化合物研究了LmiOBP1的配體結合特異性。熒光分析表明，LmiOBP1不結合糞便揮發(fā)物和綠葉氣味，但對某些線性脂肪族化合物表現(xiàn)出較高的親和力，其中十五醇和2-十五酮是結合能力最強的配體。RNA干擾(RNAi)實驗證實，飛蝗群居行為特征受到LmigOBP4影響，這些結果表明，OBP在調(diào)節(jié)蝗蟲的相位相關行為方面也發(fā)揮著重要作用[20]。

張茜雯[36]通過飛蝗觸角電位(EAG)的方法對與LmigOBP4有結合能力的3種化合物進行測試，證實了LmigOBP4確實能夠影響與氣味分子結合蛋白有結合能力的化合物苯甲醛和2-庚酮的反應強度。初步證明了蝗蝻觸角電位對于甲基丙烯酸十二酯的反應有濃度梯度依賴性，甲基丙烯酸十二酯只有在合適的濃度才能引發(fā)蝗蝻觸角的電生理反應。

為了闡明第一個從飛蝗中發(fā)現(xiàn)的氣味結合蛋白 LmigOBP1的功能，Li等[37]采用RNA干擾的方法，將LmigOBP1特異的dsRNA注射到雄性若蟲血淋巴中，從而實現(xiàn)了對LmigOBP1基因的沉默。與正常若蟲相比，LmigOBP1基因敲除若蟲對玉米葉片揮發(fā)物((Z)-3-己烯醇、芳樟醇、壬醛、癸醛和(Z)-3-己烯基乙酸酯)的食量和觸角電位反應顯著降低。這些結果表明，LmigOBP1參與了對寄主植物氣味的感知。

2 蝗蟲化學感受蛋白

近年來關于在昆蟲中參與感受外界化學信息的關鍵蛋白的研究進展十分迅速。其中有一類小分子量可溶性蛋白具有較低的等電點，且含有4個保守的半胱氨酸，可依次連接形成2個二硫鍵，但是有研究發(fā)現(xiàn)這2個二硫鍵對化學感受蛋白結構的穩(wěn)定性并沒有明顯的作用[38-40]。由于該類蛋白最初在昆蟲化學感受器官中被發(fā)現(xiàn)，因此被認為與感受化學信息有關，被命名為化學感受蛋白(CSPs)。位于昆蟲感覺神經(jīng)元突觸淋巴液中的CSPs是一類酸性、分子量通常為10—15 kDa的可溶性嗅覺蛋白，具有100—130個氨基酸殘基，序列高度保守，N端具有信號肽，其高級結構由 6個α螺旋組成一個疏水腔[38]。

2.1 化學感受蛋白的種類和特征

迄今為止，有不少來自蝗蟲的化學感受蛋白基因被鑒定出來，包括沙漠蝗、東亞飛蝗、黃脊竹蝗、青脊竹蝗、中華稻蝗和亞洲小車蝗等。

從沙漠蝗的觸角、跗節(jié)和唇瓣中發(fā)現(xiàn)一類可溶性低分子量的蛋白(CSP-sg1-7，共7個)，其中有5個蛋白均具有109個氨基酸的多肽鏈，這些多肽序列在結構以及表達譜上不同于OBP，并且免疫定位試驗表明它們參與了蝗蟲的化學信號識別過程[38]。

在2000年，Picimbon等[41]在東亞飛蝗中第一次鑒定出OS-D蛋白。隨后，Ban等[42]從飛蝗觸角中確定了兩類CSPs，且通過熒光競爭結合試驗表明長鏈化合物是其最佳配體之一。之后，中國農(nóng)業(yè)大學張龍教授課題組針對飛蝗化學感受蛋白開展了一系列研究[42-47]，取得了顯著成績，其中Zhou等[47]通過對飛蝗Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫和EST核苷酸數(shù)據(jù)庫的初步篩選，已在東亞飛蝗中鑒定出70個編碼CSPs的序列。

Li等[26]從黃脊竹蝗頭部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定出3個CSP基因；Yuan等[27]在青脊竹蝗鑒定出10個CSPs；中華稻蝗有13個化學感覺蛋白被鑒定[28]。近期，周淵濤等[48-50]從亞洲小車蝗的觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定出17個CSP基因。

2.2 化學感受蛋白的表達分布

蛋白Northern印跡分析顯示，LmigOS-Ds在觸角和足中強烈表達[41]。通過在下唇須的感受器上進行CSP免疫細胞化學定位，發(fā)現(xiàn)化學感受蛋白特異性地存在于刺形感器的外感覺淋巴中[51]。研究者[52,53]在2010年分別確定了東亞飛蝗翅和跗節(jié)上的化學感受器，通過免疫細胞化學定位發(fā)現(xiàn)LmigCSP-Ⅱ也存在于外感覺淋巴中。為揭示蝗蟲中行為相變的潛在分子機制，Guo等[54]通過寡核苷酸微陣列分析比較了散居型和群居型時間過程中的基因表達模式，結果顯示幾個CSP基因和1個LmigTO1基因(takeoutgene)分別在群居和散居的蝗蟲中呈現(xiàn)高表達水平，而在散居和群居過程中表達趨勢相反。qRT-PCR實驗顯示，大多數(shù)CSP基因和LmigTO1基因具有豐富的觸角表達。RNAi結合嗅覺行為實驗證實，CSP基因家族和LmigTO1基因參與了個體之間在群居過程中由排斥轉(zhuǎn)變?yōu)槲?，以及在孤化過程中反向轉(zhuǎn)變。這些發(fā)現(xiàn)表明，由CSP基因和takeout基因調(diào)控的對蝗蟲發(fā)出嗅覺信號的響應參與了飛蝗的行為階段變化，并提供了一種與蝗蟲聚集形成相關的分子機制。Zhou等[47]第一次篩選出東亞飛蝗70個CSP基因序列，并發(fā)現(xiàn)其中17個CSP基因在雌性生殖器官中大量表達，只有CSP91基因在雄性器官中表達。

昆蟲化學感受蛋白基因不僅在昆蟲化學感受器官中廣泛表達，在非化學感受器官中也有表達[22,51]，如沙漠蝗OBP和CSP同時在若蟲和成蟲的觸角、跗節(jié)、唇須、翅和其他散居、群居型蝗蟲的器官中表達[22]。

周淵濤[48]選擇亞洲小車蝗8個具有代表性的CSP基因(包括OasiCSP4、OasiCSP7-8、QasiCSP10-13和OasiCSP15)在雌雄成蟲不同組織中進行表達譜分析，結果表明：這些CSP基因在成蟲不同組織中的表達水平存在顯著差異；以雌性跗節(jié)中OasiCSP10的表達水平為對照，結果發(fā)現(xiàn)OasiCSP4、OasiCSP8和OasiCSP15的相對表達水平在大多數(shù)組織中遠高于OasiCSP10和OasiCSP12；OasiCSP11和OasiCSP13在觸角中的相對表達水平比其他組織高900多倍(P<0.05)；并且發(fā)現(xiàn)大多數(shù)組織中8個OasiCSPs基因的相對表達水平在雄性和雌性成蟲之間均具有顯著差異，尤其是OasiCSP11和OasiCSP13在雄性觸角中的表達量比在雌性觸角中更高。

2.3 化學感受蛋白的功能

已經(jīng)報道的研究結果表明，蝗蟲化學感受蛋白具有以下兩種功能：

2.3.1 化學檢測及氣味識別

在昆蟲嗅覺系統(tǒng)中，化學感受蛋白參與識別外界環(huán)境中的不同氣味物質(zhì)。通過熒光競爭結合試驗發(fā)現(xiàn)，昆蟲的化學感受蛋白對氣味配體的結合能力反映了化學感受蛋白基本的化學通訊作用。東亞飛蝗中CSPlm-Il-10能夠與油酰胺等多種長鏈化合物結合[40]。

雖然感覺器官的CSP已經(jīng)得到了廣泛研究，但對它們在身體其他部位的功能知之甚少。通過蛋白質(zhì)組學分析，Zhou等[44]發(fā)現(xiàn)細菌表達的CSP91結合脂肪酸具有油酸和亞油酸以及中長醇和酯的特異性；CSP在雌性生殖器官中的豐度和數(shù)量顯示了這些蛋白的重要作用，然而不能排除17個CSP中的每一個都有不同的功能，包括信號化學物質(zhì)的傳遞、激素的溶解、直接控制發(fā)育或其他未知的任務。

2.3.2 參與蝗蟲生長發(fā)育

康樂院士課題組研究發(fā)現(xiàn)CSP與飛蝗的生長發(fā)育密切相關[54，55]。東亞飛蝗中CSP3能調(diào)控蝗蟲從獨居到群居的生理和行為上的相互轉(zhuǎn)化[54]。通過系統(tǒng)發(fā)育和表達數(shù)據(jù)，Martín-Blázquez等[55]推斷出飛蝗和沙漠蝗化學感受蛋白基因在相變中參與的同源性和保守性。

3 展望

以上這些發(fā)現(xiàn)為更好地理解蝗蟲嗅覺感受的分子機制，增強對昆蟲嗅覺演變的理解起到重要作用。至今，科學家利用分子生物學實驗技術獲得蝗蟲氣味結合蛋白和化學感受蛋白，還開展了一些蛋白與多達幾十種揮發(fā)性分子的結合實驗，補充和完善了一些有價值的資料，為其相關功能機制的進一步揭示提供數(shù)據(jù)。對于蝗蟲氣味結合蛋白和化學感受蛋白有關特性功能的進一步挖掘和機制模型的進一步探索在未來可能依舊是熱點。隨著生物技術的發(fā)展，分子生物學與基因組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學以及生物信息學的緊密結合，更多昆蟲的嗅覺相關蛋白將被發(fā)現(xiàn)和鑒定，尤其近年來發(fā)展迅速的基因組編輯技術，無疑將極大地推進這些蛋白和基因功能的體內(nèi)驗證。