許雅娟，張婧喆，張淼，孫宗宗，班彥杰，王彪，侯曉峰，蔡琰鈞，李晶晶

（鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州）

0 引言

隨著生活水平的提高及對(duì)孕期營養(yǎng)認(rèn)識(shí)的不足，孕期體重增加過多孕婦日益增多。孕期體重增加過多對(duì)母兒預(yù)后有著深遠(yuǎn)影響，如增加妊娠期并發(fā)癥發(fā)生率，增加巨大兒發(fā)生率、胎糞吸入綜合征、新生兒高膽紅素血癥、兒童代謝綜合征及兒童肥胖等風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。近年來，腸道菌群在代謝性疾病中的調(diào)控作用逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。大量研究表明，腸道菌群穩(wěn)態(tài)通過參與宿主脂質(zhì)、碳水化合物等營養(yǎng)代謝影響體重和能量平衡，并作為免疫系統(tǒng)成熟的關(guān)鍵刺激因素，減少感染和炎癥反應(yīng)[4-5]。有研究表明，孕期體重增加過多者腸道菌群變化顯著[6]。但孕期體重增加過多具體與何種腸道菌群相關(guān)的研究仍較少，本研究對(duì)不同孕期體重增加水平的孕晚期孕婦腸道菌群進(jìn)行物種差異分析及母兒預(yù)后比較分析，并對(duì)差異物種進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，旨在為保障母兒健康、改善妊娠結(jié)局提供新思路。

1 資料與方法

1.1 基本資料

本研究選取2017年9月至2018年1月于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院足月待產(chǎn)的符合納入及排除標(biāo)準(zhǔn)的孕婦61例。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者均自愿參加，并簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）孕晚期時(shí)在該醫(yī)院待產(chǎn)的孕婦；（2）孕周≥37周（根據(jù)末次月經(jīng)推算）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有嚴(yán)重的心肺、血液系統(tǒng)、高血壓等慢性疾病者；（2）接受過腸道手術(shù)者；（3）近1月內(nèi)腹瀉或合并消化道慢性病史者；（4）孕期患有合并癥和并發(fā)癥者；（5）長期服用抗菌藥物或激素類藥物者；（6）孕期進(jìn)行抗生素治療者，孕期服用酸奶、益生菌及活菌類藥物2周以上者；（7）雙胎妊娠及以上者；（8）嚴(yán)重焦慮、抑郁或有認(rèn)知功能障礙者；（9）輔助生殖技術(shù)妊娠者；（10）大便常規(guī)檢查異常者。根據(jù)2009年美國醫(yī)學(xué)研究院 (institute of medicine，IOM)孕期體重增加指南[7]，將納入的61例孕婦分為：孕期體重增加不足（N=9），孕期體重增加適宜（N=22），孕期體重增加過多（N=30）。因孕期體重增加不足的數(shù)量較少，我們將孕期體重增加不足孕婦和孕期體重增加適宜孕婦合并為非孕期體重增加過多組（Non-Excessive GWG，N=31），并將其與孕期體重增加過多組（Excessive GWG，N=30）進(jìn)行比較。

1.2 數(shù)據(jù)收集

糞便樣本的采集在醫(yī)院進(jìn)行，簡言之，糞便樣本采集：用無菌勺采集受試者的新鮮糞便置于20mL凍存管內(nèi)后置入液氮罐中，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰柜中保存，直至進(jìn)行DNA提取、16SrRNA基因測序及qPCR驗(yàn)證（DNA提取、16SrRNA基因測序及qPCR均由華大基因科技有限公司提供）。

一般人口社會(huì)學(xué)資料：調(diào)取受試孕婦住院期間病歷，獲得孕婦的一般社會(huì)學(xué)資料，包括分娩時(shí)年齡、學(xué)歷、身高、孕前體重、孕期體重增加、分娩孕周、孕次、產(chǎn)次、分娩方式、新生兒體重、新生兒Apgar評(píng)分等。分娩時(shí)年齡是根據(jù)中華人民共和國身份證號(hào)碼計(jì)算的。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用軟件USEARCH（v7.0.1090）[8]將測序序列聚類為OTU（操作分類單元），并通過RDP classifer（v2.2）軟件與數(shù)據(jù)庫Greengene_2013_5_99比對(duì)，進(jìn)行物種注釋，置信度閾值設(shè)置為0.5。qPCR反應(yīng)體系由16ul的反應(yīng)體系組成，包括95℃預(yù)變性2min；94℃變性10s；60℃退火10s；72℃延伸40s。共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在ABI ViiA 7 PCR儀上進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

孕婦一般社會(huì)學(xué)資料采用卡方和維爾克森秩和檢驗(yàn)（wilcoxon rank sum Test）檢驗(yàn)兩組數(shù)據(jù)是否有差異。本研究所使用的分析軟件為SPSS 24.0版和R 3.1.1版。

孕婦腸道菌群組成與差異分析采用LEfSe多級(jí)物種差異判別。從門到屬水平上區(qū)別Non-Excessive GWG和Excessive GWG兩組孕婦孕晚期腸道菌群豐度的差異。該軟件首先利用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)找到具有顯著豐度差異的物種。最后采用線性判別分析（LDA）來估算每個(gè)組分（物種）豐度對(duì)差異效果影響的大小，LDA sore分值越高，豐度越高，影響越大。

為了檢查差異物種的絕對(duì)和相對(duì)定量之間的數(shù)據(jù)一致性，分別從Non-Excessive GWG組和Excessive GWG組中隨機(jī)抽取5個(gè)樣本對(duì)差異物種進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，qPCR反應(yīng)在ABI ViiA 7 PCR儀上對(duì)384孔板中進(jìn)行每個(gè)樣本做三次平行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)中的CT值數(shù)據(jù)的采集采用校正的閾值設(shè)定，絕對(duì)定量分析設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線后可直接生成樣品的拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 孕婦基本情況及母兒預(yù)后

本研究共納入61個(gè)孕晚期孕婦，根據(jù)美國IOM推薦的孕期增重標(biāo)準(zhǔn)，分為Non-Excessive GWG 組（N=31）與Excessive GWG組（N=30）。兩組孕婦在年齡、孕次、產(chǎn)次、分娩孕周方面無顯著性差異。但Excessive GWG組孕婦受教育水平低于Non-Excessive GWG 組，而且Excessive GWG組孕婦剖宮產(chǎn)率高于Non-Excessive GWG組。新生兒預(yù)后方面，Excessive GWG組孕婦新生兒體重及巨大兒比例均高于Non-Excessive GWG 組，而且1分鐘 Apgar評(píng)分低于Non-Excessive GWG 組（表1）。

2.2 測序序列

61個(gè)糞便樣本測序共得到2 535 467條序列，677個(gè)OUT。Good's coverage 為 99.64%，表明糞便樣本測序深度足夠，本次測序結(jié)果可以代表樣本的真實(shí)情況。

2.3 腸道菌群組成與差異

Non-ExcessiveGWG組與Excessive GWG組孕婦的腸道菌群組成（圖1），在門水平上按照相對(duì)豐度從高到低，依次是厚壁菌門Firmicutes（62.03%；68.84%）、擬桿菌門Bacteroidetes（16.31%；12.56%）、變形菌門Proteobacteria（11.34%；9.20%）、放線菌門Actinobacteria（8.17%；8.28%）。

通過LEfSe物種差異判別（圖2）顯示，Excessive GWG組中Firmicutes較多，其中Clostridium_celatum豐度最高，其豐度明顯高于Non-ExcessiveGWG組。

圖1 Non-ExcessiveGWG組與Excessive GWG組群落組成（門水平）

2.4 qPCR

表2為Non-ExcessiveGWG組與Excessive GWG組糞便樣本中Firmicutes qPCR結(jié)果。對(duì)比可發(fā)現(xiàn):Excessive GWG組孕婦腸道中Firmicutes菌量明顯高于Non-ExcessiveGWG組，與LEfSe物種差異判別結(jié)果一致。

表1 Non-Excessive GWG和Excessive GWG兩組孕婦及其新生兒的對(duì)比情況

圖2 LEfSe多級(jí)物種差異判別結(jié)果

表2 qPCR定量結(jié)果

3 討論與結(jié)論

由于社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，以及生活方式、飲食結(jié)構(gòu)和環(huán)境的改變，孕期體重增加過多的現(xiàn)象也日益嚴(yán)重，許多孕期并發(fā)癥和不良妊娠結(jié)局與肥胖密切相關(guān)。大量研究表明，肥胖會(huì)導(dǎo)致妊娠期高血壓、流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒窘迫、巨大兒等并發(fā)癥[9-11]。我們的研究中發(fā)現(xiàn)孕期體重增加過多孕婦剖宮產(chǎn)率增加，其新生兒體重、巨大兒比例均高于非孕期體重增加過多孕婦，而且發(fā)現(xiàn)孕期體重增加過多孕婦受教育水平低于非孕期體重增加過多孕婦，且其新生兒1分鐘 Apgar評(píng)分低于非孕期體重增加過多孕婦，因此孕期維持適宜體重增加意義重大。

作為人體內(nèi)最復(fù)雜的共生微生物生態(tài)系統(tǒng)，腸道菌群的種群數(shù)量最高，因此人體的生理代謝特性在健康或者疾病狀態(tài)下都會(huì)受到腸道菌群結(jié)構(gòu)變化的影響。2004年，美國華盛頓大學(xué)的Gordon研究組首次提出腸道菌群作為一種環(huán)境因素調(diào)節(jié)脂肪貯存的觀點(diǎn)，他們從調(diào)節(jié)能量代謝平衡的角度解釋了腸道菌群參與肥胖、2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制[12]。隨后，腸道菌群與肥胖相關(guān)性的研究日益受到人們的關(guān)注，但關(guān)于腸道菌群與孕期體重增加的研究仍較少，近幾年的研究中，GOMEZ等[13]通過研究超重孕婦與肥胖孕婦之間腸道菌群的差異性發(fā)現(xiàn)，肥胖者厚壁菌門、放線菌門豐度較超重者升高，而超重者無壁菌門相對(duì)豐度升高。王穎楠等[14]同樣發(fā)現(xiàn)肥胖孕婦腸道菌群中厚壁菌門比例上升，擬桿菌門比例下降，這與GOMEZ的結(jié)論一致。我們的研究發(fā)現(xiàn)孕期體重增加過多孕婦腸道菌群中厚壁菌門（Firmicutes）明顯增多，且我們進(jìn)行的qPCR定量驗(yàn)證也證實(shí)了這一結(jié)果。因此，維持孕期適宜體重增加，保持腸道菌群穩(wěn)態(tài)，可能成為保障母兒健康的一個(gè)新的出發(fā)點(diǎn)。

本研究通過分析61個(gè)孕晚期孕婦一般社會(huì)學(xué)資料及其腸道菌群，得到的結(jié)果為：孕期體重增加過多孕婦受教育水平及其新生兒1分鐘Apgar評(píng)分低于非孕期體重增加過多孕婦，其剖宮產(chǎn)率、新生兒體重及巨大兒比例均高于非孕期體重增加過多孕婦。且孕期體重增加過多孕婦腸道菌群中Firmicutes明顯增多。孕期維持適宜體重增加，將對(duì)維持腸道穩(wěn)態(tài)，改善母嬰結(jié)局起到重要作用。