邵園 王建 朱俊 畢建強(qiáng) 馮飛 許海云

近年有研究提出精神分裂癥患者腦內(nèi)存在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞增生激活[1-2]。喹硫平（quetiapine,QTP）是臨床常用抗精神病藥。既往認(rèn)為QTP通過阻斷多巴胺受體治療精神分裂癥。最近有研究發(fā)現(xiàn)，喹硫平可減輕小鼠腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞增生[3]。但是，喹硫平治療精神分裂癥的機(jī)制是否有減輕膠質(zhì)細(xì)胞增生的作用發(fā)揮其中，目前尚不清楚。銅腙（cuprizone,CPZ）暴露1周的小鼠表現(xiàn)出精神分裂癥樣行為，同時還產(chǎn)生腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞、白介素（interleukin-6,IL-6）激活等反應(yīng)，可作為精神分裂癥的動物模型之一[4-5]。本研究應(yīng)用CPZ暴露1周小鼠作為精神分裂癥動物模型，研究QTP對小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的作用，為精神分裂癥的治療提供新思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立及分組SPF級成年健康雄性6周齡C57BL/6小鼠48只，由廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)前在汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心適應(yīng)1周。之后小鼠隨機(jī)分成QTP+CPZ組、生理鹽水（normal saline,NS）+CPZ 組、QTP 組、NS組等 4組。實(shí)驗(yàn)時每只小鼠腹腔注射QTP（10 mg/kg/d，加拿大 AstraZeneca 公司）或 NS（1 mL/100 g），連續(xù)2周。實(shí)驗(yàn)第1周時，所有小鼠均喂食普通飼料。第2周時，小鼠喂食含CPZ（0.2%，w/w，美國Sigma公司）的飼料或普通飼料。QTP、CPZ、NS的劑量根據(jù)參考文獻(xiàn)及前期研究[6]。實(shí)驗(yàn)動物的操作和處理過程均遵守汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院飼養(yǎng)和使用實(shí)驗(yàn)動物的相關(guān)規(guī)定。

1.2 曠場實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Noldus動物行為視頻跟蹤分析系統(tǒng)檢測，觀察箱長×寬×高=50 cm×50 cm×35 cm。通過攝像系統(tǒng)記錄小鼠在10 min內(nèi)的自發(fā)活動。由計算機(jī)分析小鼠10 min內(nèi)的總路程、中央路程。

1.3 免疫熒光檢測GFAP、Iba-1表達(dá)用免疫熒光標(biāo)記的anti-膠質(zhì)纖維樣酸性蛋白（glia fibrillary acidic protein,GFAP）抗體檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化，用免疫熒光標(biāo)記anti-鈣離子連接蛋白分子-1（calcium bingding adaptor molecule-1,Iba-1）抗體檢測小膠質(zhì)細(xì)胞的變化。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第2天，所有小鼠灌注取腦，冰凍后25 μm連續(xù)切片，脫水、固定、4℃保存。切片取出，PBS洗5 min×3次；30% H2O2和甲醇按1:50混合，室溫靜置30 min，PBS 洗5 min×3 次；0.1%TritonX-100 浸泡，4℃ 10 min，PBS洗 5 min×3次； 山羊血清工作液浸泡30 min；一抗孵育（兔抗GFAP多克隆抗體，英國Abacam公司；兔抗Iba-1多克隆抗體，日本wako公司），空白對照加PBS，4℃過夜；室溫復(fù)溫 1 h，PBS 洗5 min×3次；加 HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育 30 min，PBS洗 5 min×3次；DAB 顯色 3～5 min，PBS洗片；貼片，常規(guī)脫水、透明、封片。用熒光倒置顯微鏡拍照，采用Image-Pro Plus(IPP)6.0軟件分析免疫熒光圖片，分析GFAP和Iba-1陽性細(xì)胞的積分光密度 （integrated option density,IOD）值。

既往結(jié)果顯示，小鼠腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞增生主要集中在皮質(zhì)（cortex,CTX）及海馬 CA1區(qū)[7]，另外，CPZ選擇性損傷腦白質(zhì)，多集中在胼胝體（corpus callosum,CC）[8]，因此本研究觀察 CC、CTX、CA1 區(qū)GFAP和Iba-1陽性細(xì)胞IOD值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用雙因素（QTP用藥和CPZ建模兩個因素）方差分析主效應(yīng)和交互效應(yīng)，用Fisher′s LSD法進(jìn)行兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠自發(fā)活動對于曠場實(shí)驗(yàn)總路程，雙因素方差分析顯示 QTP（F=22.88，P＜0.01）和 CPZ（F=7.19，P=0.01）主效應(yīng)均有統(tǒng)計學(xué)意義，兩因素之間沒有交互作用 （F=2.11，P=0.16）。兩兩比較顯示，QTP+CPZ組比 NS+CPZ組總路程減少 （P＜0.01），NS+CPZ組小鼠總路程比 NS組增多 （P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

對于中央路程，QTP主效應(yīng)（F=1.36，P=0.26）、CPZ 主效應(yīng)（F=0.29，P=0.59）以及兩者交互作用（F=3.99，P=0.06）均無統(tǒng)計學(xué)意義。對于中央路程/總路程，QTP 主效應(yīng) （F=0.34，P=0.57）、CPZ主效應(yīng)（F=0.04，P=0.84）以及交互作用（F=2.42，P=0.14）均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 喹硫平和銅腙對小鼠自發(fā)活動的影響

2.2 小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活對于GFAP陽性細(xì)胞，在CC區(qū)，QTP與CPZ交互作用無統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.97，P=0.06），QTP 主效應(yīng)（F=6.58，P=0.02）和 CPZ 主效應(yīng)（F=46.84，P＜0.01）有統(tǒng)計學(xué)意義。兩兩比較顯示，QTP+CPZ組與NS+CPZ組相比 （P=0.04），NS+CPZ組與 NS組相比（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在CTX，交互作用（F=9.09，P=0.01）、QTP 主效應(yīng)（F=7.48，P=0.01）和 CPZ 主效應(yīng)（F=21.94，P＜0.01）均有統(tǒng)計學(xué)意義。在 CA1 區(qū)，交互作用（F=7.88，P=0.01）、QTP 主效應(yīng)（F=11.01，P＜0.01）和 CPZ 主效應(yīng)（F=29.76，P＜0.01）均有統(tǒng)計學(xué)意義。兩兩比較，在CTX和CA1區(qū)均顯示，QTP+CPZ組與NS+CPZ組相比（P＜0.01），NS+CPZ 組與 NS 組相比（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1及表2。

表2 喹硫平和銅腙對小鼠腦內(nèi)GFAP陽性細(xì)胞 IOD值的影響

圖1 各組小鼠腦內(nèi)GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)（100×）A為CC區(qū)，B為CTX區(qū)，C為CA1區(qū)。免疫熒光。

對于Iba-1陽性細(xì)胞，在CC區(qū)，兩因素交互作用（F=29.97，P＜0.01）、QTP 主效應(yīng)（F=23.83，P＜0.01）和 CPZ 主效應(yīng)（F=140.88，P＜0.01）均有統(tǒng)計學(xué)意義。在 CTX區(qū)，交互作用（F=9.02，P=0.01）、QTP 主效應(yīng)（F=9.02，P=0.01）及 CPZ 主效應(yīng)（F=43.45，P＜0.01）均有統(tǒng)計學(xué)意義。在 CA1區(qū)，交互作用（F=20.00，P＜0.01）、QTP 主效應(yīng)（F=21.23，P＜0.01）和 CPZ 主效應(yīng)（F=111.42，P＜0.01）均有統(tǒng)計學(xué)意義。兩兩比較顯示，在CC、CTX、CA1區(qū)，QTP+CPZ 組比 NS+CPZ 組減少（P＜0.01），NS+CPZ 組比NS組增加（P＜0.01）。見圖 2及表 3。

圖2 各組小鼠腦內(nèi)Iba-1陽性細(xì)胞表達(dá)（100×） A為CC區(qū)，B為CTX區(qū)，C為CA1區(qū)。免疫熒光。

表3 喹硫平和銅腙對小鼠腦內(nèi)Iba-1陽性細(xì)胞IOD值的影響

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，CPZ暴露1周增加C57BL/6小鼠的自發(fā)活動，同時小鼠腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯。并發(fā)現(xiàn)喹硫平能改善小鼠的行為學(xué)改變，具有減輕CPZ誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞增生的作用。這提示喹硫平減輕腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞增生可能是其受體外的作用機(jī)制之一，為精神分裂癥治療帶來了新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)，具有重要意義。

本研究曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)CPZ暴露1周后總路程增加，提示小鼠自發(fā)活動增多。既往也有研究表明，CPZ暴露的小鼠可能存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺系統(tǒng)激活[9]。但是TEZUKA等[4]研究顯示CPZ暴露1周的C57BL/6小鼠自發(fā)活動無明顯變化。兩項(xiàng)研究實(shí)驗(yàn)方法僅敞箱大小及實(shí)驗(yàn)時間不同：TEZUKA等[4]研究中敞箱大小為45.5 cm×25 cm×35 cm，實(shí)驗(yàn)時間5 min；本研究的敞箱大小為50 cm×50 cm×35 cm，實(shí)驗(yàn)時間10 min。這可能是實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致的原因，但需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。不過這提示CPZ暴露小鼠其自發(fā)活動具有動態(tài)變化的特征，這與精神分裂癥患者的癥狀復(fù)雜性一致，有的患者表現(xiàn)易激惹、活動多，有的卻表現(xiàn)淡漠、懶語少動[10]。QTP+CPZ組與NS+CPZ組小鼠相比，自發(fā)活動減少，提示QTP可以緩解CPZ誘導(dǎo)的自發(fā)活動增多。

本研究還顯示，CPZ暴露1周引起小鼠腦內(nèi)CC、CTX、海馬CA1區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞增生，這與TEZUKA等[4]的研究結(jié)果一致。也有其他研究表明CPZ暴露引起神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活[11]。更重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)，喹硫平在減輕CPZ誘導(dǎo)小鼠腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞增生的同時，還改善了CPZ誘導(dǎo)的自發(fā)活動增多。既往研究表明，喹硫平通過促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子來預(yù)防Aβ 25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡[12]，因此推測，QTP具有減輕腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞增生作用，可能通過此作用改善CPZ暴露小鼠的異常行為。但是本研究尚不能明確其因果關(guān)系，后續(xù)研究將對其進(jìn)一步驗(yàn)證、完善。

需要指出的是，腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞功能復(fù)雜，參與炎癥反應(yīng)等很多過程。既往有研究表明，CPZ模型小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生激活，并釋放大量IL-6、IL-1β等炎癥因子[13]。小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的炎癥因子在多發(fā)性硬化[14]、精神分裂癥[4]等疾病中具有重要意義?？梢姡切文z質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活在一定程度上可反映神經(jīng)炎癥反應(yīng)，但不能完全等同。遺憾的是，本研究未進(jìn)行腦內(nèi)相關(guān)炎癥因子的檢測。后續(xù)將對此進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步驗(yàn)證精神分裂癥膠質(zhì)細(xì)胞增生與免疫炎癥假說之間的關(guān)聯(lián)。

本研究沒有進(jìn)一步探討QTP減輕腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞增生的作用機(jī)制，但是QTP的藥理作用和本課題組既往研究[15]可以提供一些線索。QTP通過抑制核因子-κB （nucleus factor kappa B,NF-κB）途徑減弱APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活和促炎細(xì)胞因子升高[16]。另一個可能的作用機(jī)制是，QTP通過抗氧化作用發(fā)揮減輕膠質(zhì)細(xì)胞增生的作用。有研究表明，小鼠腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞增生與氧化應(yīng)激反應(yīng)有密切的關(guān)聯(lián)[17]。本課題組既往研究也發(fā)現(xiàn)，CPZ暴露使腦內(nèi)抗氧化物酶活性下降，表明出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)[15]。本研究小鼠經(jīng)同樣處理后表現(xiàn)出腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞增生?？烧J(rèn)為CPZ暴露的小鼠線粒體氧化應(yīng)激和膠質(zhì)細(xì)胞增生可能存在因果關(guān)系。既往也有研究表明氧化應(yīng)激可以激活氧化還原反應(yīng)及NF-κB，而NF-κB可促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞增加炎癥介質(zhì)的表達(dá)[18]。因此推測，QTP可能通過抗氧化作用改善CPZ短期暴露所致的膠質(zhì)細(xì)胞增生。

QTP減輕膠質(zhì)細(xì)胞增生的作用為精神分裂癥治療提供了新方向，對精神疾病研究具有重要意義。后續(xù)研究將觀察腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞增生與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)，以及喹硫平減輕膠質(zhì)細(xì)胞增生的作用機(jī)制，為精神疾病臨床治療提供更全面的幫助。