秦亞東，汪榮斌，方鳳滿，李林華

1安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系；2安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蕪湖 241002

白及為蘭科植物白及Bletillastriata(Thunb.) Reichb.f.的干燥塊莖，具收斂止血、消腫生肌之功[1]，作為臨床常用藥材，具悠久的藥用歷史。白及主要含有聯(lián)芐類、菲類、菲醌類、聯(lián)苯并菲類、黃酮類及2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類等化學(xué)物質(zhì)[2,6,7]，現(xiàn)代研究表明這些次生代謝產(chǎn)物在抗菌[3,4]、抗腫瘤[5,6]、抗炎[7]等方面不斷顯示新的活性。

近年來由于市場對(duì)白及的需求量增加，野生白及資源遭到了掠奪性采挖，面臨滅絕的危險(xiǎn)，市場供應(yīng)主要依靠人工栽培品。眾所周知，藥用植物次生代謝產(chǎn)物的含量與產(chǎn)地、環(huán)境、采收時(shí)期及加工等因素關(guān)系密切，代謝產(chǎn)物的種類及含量可能會(huì)對(duì)臨床療效產(chǎn)生影響。已有文獻(xiàn)報(bào)道白及主要有效成分含量與海拔高度關(guān)系密切[8]、野生與栽培品中天麻素(gastrodin，GAS)和1，4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯(militarine，MIL)含量存在較大差異[9]；同時(shí)學(xué)者對(duì)不同產(chǎn)地白及指紋圖譜及多指標(biāo)含量進(jìn)行測定的基礎(chǔ)上對(duì)白及質(zhì)量評(píng)價(jià)及栽培品質(zhì)量研究進(jìn)行了有益嘗試[9-11]。但對(duì)白及不同采收期，差異次生代謝產(chǎn)物及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律研究尚未見報(bào)道。本文利用HPLC建立白及栽培品不同采收期次生代謝產(chǎn)物指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別不同采收期特征差異成分及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，同時(shí)采用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(HPLC-HRMS)技術(shù)對(duì)特征差異次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，闡明特征差異代謝產(chǎn)物隨季節(jié)變化規(guī)律，以期為指導(dǎo)白及采收期及內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Agilent 1290型超高效液相色譜色譜儀(Agilent,USA)、Shimadzu LC-20AD型高效液色譜相色譜儀(Kyoto，Japan)、AB Sciex Triple TOF 5600型高分辨串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB SCIEX，America)、DV215CD型 Discovery電子天平(Ohaus，USA)、JK-250DB型超聲波清洗儀(合肥金尼克機(jī)械制造有限公司)、Minispin型臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf，Germany)。

1.2 材料

引種安徽省南陵縣何灣鎮(zhèn)野生白及，經(jīng)安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校汪榮斌副教授鑒定為蘭科植物白及Bletillastriata(Thunb.) Reichb.f.，栽培于安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥苑，栽培3年后，自2014年11月起每間隔半個(gè)月采集地下塊莖，樣品編號(hào)信息見表1。按《中國藥典》方法[1]除去泥土及須根后，置沸水煮15 min，曬至半干，除去外皮，曬干，粉碎后過40目篩，裝密封袋置4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

表1 白及樣品信息及兩個(gè)主要差異性成分的含量(mg/g)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

樣品編號(hào)Sample No.采集時(shí)間Collection date天麻素GAS1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯MIL季節(jié)SeasonS202015.8.282.1922.584S212015.9.151.8424.094S222015.9.292.5119.014S232015.10.142.2522.094S242015.11.23.2617.884

1.3 試藥和試劑

GAS(批號(hào)：110807-201605)對(duì)照品購自中國食品藥品檢定研究院、MIL(批號(hào)：lot16122231)對(duì)照品購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；乙腈、甲酸為色譜級(jí)(TEDIA，USA)、水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水、其余試劑為市售分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取白及粉末約0.5 g，置于15 mL具塞離心管中，精密加入60%(V∶V)甲醇-水溶液10 mL,控制超聲溫度不超過20 ℃，超聲1 h后離心處理(3 000 rpm)5 min，上層溶液過0.22 μm微孔有機(jī)濾膜，取續(xù)濾液，備用。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定GAS、MIL對(duì)照品適量，分別置于10 mL棕色容量瓶中，加60%(V∶V)甲醇-水溶液定容至刻度。精密量取GAS、MIL對(duì)照品溶液適量混合，搖勻后為混合對(duì)照品溶液，分別過0.22 μm微孔有機(jī)濾膜，取續(xù)濾液，備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18column(50×4.6 mm，1.8 μm)，保護(hù)柱：Agilent SB-C18column(5×2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相為溶劑A：0.1%甲酸乙腈，溶劑B：0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫，0～10 min，溶劑A由5%→20%，10～18 min，溶劑A由20%→30%，18～23 min，溶劑A 30%，23～30 min,溶劑A由30%→33%，30～45 min,溶劑A由33%→60%；流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長285 nm，進(jìn)樣量5 μL，典型色譜圖如圖1所示。

圖1 混合對(duì)照品(A)及白及典型樣品(B)HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of two mixed standards(A) and representative HPLC chromatograms of sample(B)注：1.天麻素；2.1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯。Note:1.GAS,2.MIL.

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn)

取S5樣品，按上述條件制備供試品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄各共有峰峰面積及保留時(shí)間，以MIL

色譜峰為參照，各共有峰相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于0.21%和0.72%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取S5樣品，按上述條件制備供試品溶液,分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄各共有有峰峰面積和保留時(shí)間，以MIL色譜峰為參照，各共有峰相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間RSD值分別小于0.25%和1.24%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取S5號(hào)樣品6份,按上述條件制備供試品溶液，按上述條件獲取6份供試品指紋圖譜，記錄各共有峰峰面積和保留時(shí)間，以MIL色譜峰為參照，各共有峰相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間RSD值分別小于0.46%和1.57%，表明重復(fù)性符合指紋圖譜要求。

2.5 指紋圖譜的建立

白及樣品按上述方法處理并進(jìn)行測定。數(shù)據(jù)以AIA.格式導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件(中國藥典委員會(huì)，2004A版)，以S1號(hào)樣品為參照，時(shí)間窗寬度為0.1，采用中位數(shù)法，經(jīng)多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配共生成共有峰16個(gè)。285 nm檢測波長下指紋圖譜疊加圖如圖2。

圖2 24批白及樣品的HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of the 24 batches of Bletilla striata samples

2.6 定量分析

參照文獻(xiàn)[9-11]，利用外標(biāo)一點(diǎn)法對(duì)GAS和MIL進(jìn)行定量計(jì)算，結(jié)果見表1所示。由表1直觀分析可見，GAS在Class1(S1～S6，冬季)和Class2(S7～S12，春季)樣品中的含量高于Class3樣品(S13～S18，夏季)和Class4(S19～S24，秋季)，GAS在冬、春季節(jié)平均含量是夏、秋季節(jié)的1.76倍，全年最高含量是最低含量的3.69倍；而MIL則相反，其在Class3和Class4樣品中的含量高于Class1和Class2樣品，MIL在夏、秋季節(jié)的平均含量是冬、春季節(jié)的1.53倍，全年最高含量是最低含量的2.67倍。

2.7 液質(zhì)條件及特征峰定性分析

使用島津Shimadzu LC-20AD型HPLC進(jìn)行色譜分離，色譜條件同“2.3”項(xiàng)；LC-Q-TOF-MS系統(tǒng)，采用電噴霧離子源(ESI)進(jìn)行正(PI)、負(fù)離子(NI)模式全掃描，掃描范圍m/z50～1 500；噴霧電壓4.5 kV，離子源溫度500 ℃，去簇電壓100 V，氣簾氣壓(N2)：35 psi，霧化氣壓(N2)：55 psi，輔助氣壓(N2)：60 psi。

應(yīng)用LC-Q-TOF-MS技術(shù)，按上述色譜分離條件及質(zhì)譜條件，對(duì)白及指紋圖譜中7個(gè)特征峰進(jìn)行分析，結(jié)果見表2所示。利用Agilent Mass Hunter version B.0400軟件對(duì)總離子流圖中的準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行提取，色譜峰2、9利用化學(xué)對(duì)照品比對(duì)；其余化合物利用精確相對(duì)分子質(zhì)量、二級(jí)碎片信息和文獻(xiàn)報(bào)道比對(duì)[13]進(jìn)行初步鑒定。結(jié)果顯示特征峰按化學(xué)結(jié)構(gòu)分為葡糖糖苷類：色譜峰2(4-羥甲基苯基-葡萄糖苷，gastrodin)；芐酯類：色譜峰4(4-(葡萄糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基芐酯，blestroside)、色譜峰9(1，4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯，militarine)、色譜峰11(1，4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯-2-(4-O-肉桂?；?葡萄糖苷，gymnoside Ⅴ)；菲類：色譜峰12(3，5-二羥基-1-甲氧基-9，10二氫菲，coelonin)、色譜峰14(芐基氫菲3，benzylhydrophenanthrene 3)、色譜峰13(4-甲氧基菲-2，7-二醇，4-methoxyphenanthrene-2，7-diol)。

2.8 多元統(tǒng)計(jì)分析

為更加客觀、直接的闡明不同采集時(shí)間白及次生代謝產(chǎn)物的差異性，利用SIMCA-P軟件進(jìn)行PCA、PLS-DA分析，其得分圖可以提供可視化的白及樣品分類情況，載荷圖能夠直觀的分析對(duì)白及樣品分類起主要作用的變量信息。將白及24個(gè)采集時(shí)間點(diǎn)的HPLC指紋圖譜共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA-P 11.5軟件，經(jīng)歸一化處理后進(jìn)行PCA分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，不同采集時(shí)間白及樣品Class1、Class2與Class3和Class4區(qū)分良好，但Class3和Class4難以達(dá)到有效區(qū)分，表明不同采集時(shí)間白及次生代謝產(chǎn)物存在差異。其中Class1樣品(S1～S6，冬季)和Class2(S7～S12，春季)分布在得分圖左側(cè)，t[1]象限負(fù)值區(qū)域，說明冬、秋兩季白及樣品次生代謝產(chǎn)物與夏、秋兩季差異明顯；Class3樣品(S13～S18，夏季)和Class4(S19～S24，秋季)分布在得分圖右側(cè)，t[1]象限正值區(qū)域，但夏季和秋季白及樣品彼此交叉，未能達(dá)到有效區(qū)分，說明夏、秋兩季白及樣品內(nèi)次生代謝產(chǎn)物差異不明顯。

表2 特征色譜峰初步定性結(jié)果

圖3 同采集時(shí)間白及樣品PCA得分圖Fig.3 Scores plot of PCA of Bletilla striata samples

為明確不同采集時(shí)間白及樣品次生代謝產(chǎn)物的差異性化學(xué)成分，縮小組內(nèi)差異，進(jìn)一步采用有監(jiān)督模式的偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，建立不同采集時(shí)間白及分類模型。由PLS-DA得分圖，由圖4A可知，Class1樣品(S1～S6，冬季)分布在最右側(cè)，t[1]象限正值和t[2]象限負(fù)值所組成的區(qū)域內(nèi)；Class2(S7～S12，春季)分布在得分圖右側(cè)，t[1]象限正值與t[2]象限正值所組成的區(qū)域內(nèi)，Class1和Class2以及與其他樣品區(qū)分效果較好，說明Class1和Class2之間以及與其他分類樣品中次生代謝產(chǎn)物差異明顯；Class3和Class4分布在得分圖左側(cè)，t[1]象限負(fù)值區(qū)域，同樣彼此交叉，未能實(shí)現(xiàn)有效區(qū)分，說明Class3和Class4次生代謝產(chǎn)物差異不明顯。

圖4 不同采集時(shí)間白及樣品PLS-DA得分圖(A)和載荷圖(B)Fig.4 Scores plot of PLS-DA and Loading plot of PLS-DA of Bletilla striata samples

由載荷圖4B可知，在t[1]方向，變量色譜峰2(gastrodin)、11(gymnoside Ⅴ)對(duì)樣品向t[1]正值方向分布起到積極作用，說明色譜峰2、11由t[1]正值向負(fù)值方向其峰面積有不斷變小的趨勢；而變量色譜峰12(coelonin)、13(4-甲氧基菲-2，7-二醇)、14(芐基氫菲3)對(duì)樣品向t[1]負(fù)值方向分布起到積極作用，其峰面積由t[1]正值向負(fù)值方向其峰面積有不斷變大的趨勢，與GAS含量分析結(jié)果一致。在t[2]方向，變量4(blestroside)、9(militarine)對(duì)樣品向t[2]正值方向分布起到積極作用，是引起樣品在t[2]方向分散的主要變量。有圖4B可見，Class3和Class4分布相互交叉，區(qū)分效果不明顯，表明上述變量在Class3和Class4兩類中差異不明顯，這與《中國藥典》記載白及夏、秋季節(jié)采集的要求[1]相一致。綜上，白及樣品在由冬季-春季-夏、秋季生長過程中菲類化合物(4-甲氧基菲-2，7-二醇、benzylhydrophenanthrene 3、coelonin)的含量有不斷增加的趨勢；糖苷類化合物(gastrodin)及芐酯類化合物(gymnoside Ⅴ)的含量則不斷變小的趨勢，在冬、春季含量高；芐酯類化合物(blestroside、militarine)的含量有不斷升高的趨勢，在夏、秋季含量最高。

所建立PLS-DA模型的R2X=0.936，R2Y=0.851，Q2=0.828，表明模型穩(wěn)定，預(yù)測能力強(qiáng)。上述變量色譜峰2(gastrodin)、11(gymnoside Ⅴ)、12(coelonin)、13(4-甲氧基菲-2，7-二醇)、14(benzylhydrophenanthrene 3)、4(blestroside)、9(militarine)的Variable Important Plot(VIP)值均大于1，根據(jù)變量VIP值大于1作為特征變量的原則，上述7個(gè)變量可作為白及在不同采集時(shí)期重要特征變量以及不同采集時(shí)期的主要差異化學(xué)成分，這些差異性化學(xué)成分為不同采集時(shí)期白及內(nèi)在質(zhì)量差異的物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 討論

眾所周知，藥用植物次生代謝產(chǎn)物是藥效發(fā)揮的主要物質(zhì)載體，積極探索并闡明藥材在不同采收時(shí)間次生代謝產(chǎn)物累積差異及藥材質(zhì)量的形成規(guī)律具有重要意義。因此，針對(duì)白及栽培品不同采收時(shí)期樣品建立HPLC指紋圖譜，按采收季節(jié)對(duì)樣品進(jìn)行分類，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法，發(fā)現(xiàn)不同采收期樣品在PCA、PLS-DA分類中Class1樣品、Class2樣品與夏、秋兩季樣品能有效區(qū)分；而Class3和Class4樣品彼此交叉嚴(yán)重，難以獲得有效區(qū)分，說明7個(gè)特征變量成分在夏、秋兩季差異不如與春、冬兩季明顯。需要說明的是利用二極管陣列檢測器同時(shí)檢測254、270、285 nm指紋圖譜，254、270 nm下無監(jiān)督PCA分類模式難以將不同季節(jié)樣品進(jìn)行有效區(qū)分，故本文采用285 nm建立指紋圖譜。7個(gè)特征變量中色譜峰2、11、12、13和14對(duì)樣品在不同季節(jié)分布影響顯著；變量色譜峰4和9主要是引起樣品在t[2]方向分散的主要特征變量。有文獻(xiàn)報(bào)道在大鼠血清中檢測到MIL、GAS和blestroside原型產(chǎn)物[14,15]，說明這些入血成分與不同臨床藥效可能存在一定的相關(guān)性。

本研究采用HPLC技術(shù)建立化學(xué)指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法得到7個(gè)特征變量，并利用LC-HRMS聯(lián)用技術(shù)初步鑒定了7個(gè)特征變量，闡明了不同采收時(shí)期白及差異性化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，并初步理清了7個(gè)特征化學(xué)成分在不同季節(jié)含量的變化趨勢，其結(jié)果與《中國藥典》中描述的夏、秋季采集相一致，在一定程度上驗(yàn)證了夏、秋季采集的合理性；隨著白及次生代謝產(chǎn)物不斷被發(fā)現(xiàn)以及這些單體化合物在抗腫瘤、抗炎、抗菌等方面的作用不斷被闡明，根據(jù)7個(gè)特征化學(xué)成分動(dòng)態(tài)變化規(guī)律以及臨床治療目的，提高這些藥效成分在白及藥材中的含量，保證臨床用藥效果，為更加科學(xué)的控制采收時(shí)期和合理的制訂白及藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)和參考。