季嘉誠，邱 峰，雷新響

中南民族大學藥學院，武漢 430074

華中五味子(SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.)為木蘭科(Magnoliaceae)五味子屬(Schisandra)植物，主要產(chǎn)于湖北、湖南、四川、貴州、云南東北部等地區(qū)，生于海拔600-3000米的濕潤山坡邊或灌叢中[1]。根據(jù)現(xiàn)代研究表明，華中五味子具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)鎮(zhèn)靜、PAF拮抗、延緩衰老、清除自由基、抑制過氧化脂質(zhì)形成、抗炎、抗HIV等藥理作用[2]。其中，任榮從華中五味子中分離得到的methylgomisin O和schisantherin A具有抗炎活性作用[3]；Gao等[4]人從華中五味子中分離得到的anwulignan具有較好的肝保護作用；Liu等[5]從華中五味子中分離得到的schisphenthin A等三萜類化合物具有抗增殖作用，分離得到的schisphenlignan L等木脂素類化合物具有神經(jīng)保護作用。

因此，華中五味子中仍具有待發(fā)現(xiàn)、活性較好的成分。鑒于華中五味子果實的研究較多，本實驗選取華中五味子藤莖，對其化學成分和活性進行了較為系統(tǒng)的研究。從中分離了得到7個化合物，通過波譜學數(shù)據(jù)鑒定了其化學結(jié)構(gòu)，分別為：6′′-O-對羥基苯甲酰紅景天苷(1)、nectandrin B(2)、7-(3,4-dimethoxyphenyl)-7′(4′-hydroxy-3′-methoxyphenyl)-8,8′(dimethylbutyl) acetate(3)、henricine B(4)、(8R,8′R)-3,4-dimethoxy-3′,4′-methylenedioxy-7,7′-dioxo-8,8′-neolignan(5)、secoisolariciresinol(6)、calceolarioside B(7)?；衔?為新化合物，化合物1、6、7具有較好的NO釋放的抑制作用。

1 儀器與材料

Bruker AM-600型核磁共振光譜儀(德國Bruker公司)；Agilent 1260Ⅱ型HPLC(Agilent公司)，色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6×250 mm)，粒徑5 μm；半制備柱Venusil XBP C18柱(10×250 mm)，粒徑5 μm；TBP-5010型中壓柱(上海同田生物技術(shù)股份有限公司)；柱色譜硅膠(200～300目，青島海洋化工廠)；薄層硅膠板(青島海洋化工廠)；95%乙醇(武漢興和達商貿(mào)有限公司)；反相硅膠 Chromatores(日本Fuji公司)；石油醚(化學純，上海泰坦化學有限公司)；乙酸乙酯(化學純，上海泰坦化學有限公司)；甲醇(化學純，上海泰坦化學有限公司)；色譜甲醇(SIGMA公司)；色譜乙腈(成都科隆化學品有限公司)。

小鼠單核巨噬細胞 RAW264.7， 購自中科院細胞庫；吲哚美辛(阿拉丁公司)；NO檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；LPS(上海源葉生物科技有限公司)。

華中五味子由中南民族大學藥學院楊光忠教授鑒定為華中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.的藤莖。

2 提取與分離

將華中五味子藤莖曬干，粉碎后稱重，得10 kg。隨后用25升95%乙醇在室溫下滲漉提取3次，每次4天。將提取液進行抽濾，除去藥渣，在進行濃縮，得浸膏。浸膏用乙酸乙酯進行萃取，萃取三次。將萃取液減壓濃縮后得乙酸乙酯部位168 g。用300 g正相柱硅膠(200～300目)拌樣，3 000 g正相柱硅膠(200～300目)濕法裝柱，采用干法上樣，進行柱層析。用石油醚-乙酸乙酯體系(體積比15∶1→0∶1)進行梯度洗脫，根據(jù)TLC檢測后的色譜行為相似性，得6個組段，編號為Fr.A～F。將Fr.B用反相硅膠柱層析分離，得8個組分：Fr.B-1～B-8。將Fr.C用反相硅膠柱層析分離，得4個組分：Fr.C-1～C-4。取Fr.C-2(39.0 mg)進行半制備型HPLC純化(甲醇：水=55∶45，3 mL/min)，得化合物5(2.0 mg，tR=6.9 min)。取Fr.C-3(123.6 mg)進行半制備型HPLC純化(甲醇∶水=60∶40，3 mL/min)，得化合物2(7.7 mg，tR=33.0 min)和化合物3(3.2 mg，tR=40.8 min)。將Fr.D用反相硅膠柱層析分離，得10個組分：Fr.D-1～D-10。取Fr.D-5(113.8 mg)進行半制備型HPLC純化(乙腈∶水=40∶

60，3 mL/min)，得化合物4(14.4 mg，tR=33.0 min)。將Fr.F用反相硅膠柱層析分離，得11個組分：F-1～F-11。取Fr.F-5(204.9 mg)進行半制備型HPLC純化(乙腈∶水=15∶85，3 mL/min)，得化合物1(2.1 mg，tR=23.3 min)。取Fr.F-7(137.6 mg)進行半制備型HPLC純化(乙腈∶水=19∶81，3 mL/min)，得化合物7(9.6 mg，tR=18.5 min)。取Fr.F-8(151.8 mg)進行半制備型HPLC純化(乙腈∶水=23.5∶76.5，3 mL/min)，得化合物6(7.5 mg，tR=18.7 min)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1黃色粉末狀物質(zhì)， -50°(c0.02，MeOH)，HR-ESI-MS譜給出的準分子離子峰m/z443.131 1[M + Na]+(計算：443.131 8)，故確定分子式為C21H24O9，不飽和度為10。結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structure of compound 1

表1 化合物1的1H和13C譜數(shù)據(jù)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

PositionδH(J in Hz)δC3.90,m1''4.31,d,7.8104.62''3.22,m75.13''3.39,m784''3.39,m725''3.58,m75.56''4.41,dd,11.8,6.364.94.59,dd,11.8,2.1

化合物1的1H NMR譜和13C NMR譜(Table 1)中顯示兩個典型的苯環(huán)對位雙取代系統(tǒng)[δH6.66(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.80(2H，d，J=8.8 Hz，H-3，5)，6.98(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，7.85(2H，d，J=8.8 Hz，H-2，6)]，一個葡萄糖信號[ 4.31(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′′)，3.22(1H，m，H-2′′)，3.39(1H，m，H-3′′)，3.39(1H，m，H-4′′)，3.58(1H，m，H-5′′)，4.41(1H，dd，J=6.3，11.8 Hz，H-6a′′)，4.59(1H，dd，J=2.1，11.8 Hz，H-6b′′)]，一個亞甲基信號[2.81(2H，m，H-7′)]，一個含氧亞甲基信號[3.70，3.91(2H，m，H-8′)]和一個酯基信號(δC168.05)。因此，基本可以推出該化合物的平面結(jié)構(gòu)。此化合物1的詳細結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可以從本刊官網(wǎng)免費下載(www.trcw.ac.cn)。

在HMBC譜可以看出(圖2)，H-3′(δH6.98)與C-7′(δC36.54)存在相關，H-8′(δH3.70，3.91)與C-7′(δC36.54)存在相關，H-1′′(δH4.31)與C-8′(δC72.44)存在相關，H-2(δH7.85)與C-7(δC168.05)存在相關以及H-6′′(δH4.41，4.60)與C-7(δC168.05)存在相關，可以推出乙氧基連在C-4′(δC130.57)上，葡萄糖連的位置在C-8′上，對羥基苯甲酸通過酯化反應連在糖的6′′位上。因此，可以確認化合物1的平面結(jié)構(gòu)，如圖1所示。

由于葡萄糖的端基氫的耦合常數(shù)為7.8 Hz，因此可以推出糖苷鍵為β構(gòu)型，通過文獻調(diào)研，可以發(fā)現(xiàn)化合物1與6′′-O-galloyl salidroside[6]非常相似，它們之間差別就是化合物1少了3、5位的羥基。通過文獻查閱還可以發(fā)現(xiàn)化合物1應該是紅景天苷[7]跟對羥基苯甲酸酯化形成，故推斷出化合物1的葡萄糖為β-D型。因此，化合物1為6′′-O-對羥基苯甲酰紅景天苷。

圖2 化合物1的關鍵HMBC相關Fig.2 The key HMBC correlations of compound 1

化合物2黃色油狀;1H NMR(CDCl3，600MHz)δH：1.03(6H，d，J=6.6 Hz，3-Me，4-Me)，2.32(2H，m，H-3，H-4)，3.88(6H，s，3′-OMe，3′′-OMe)，4.49(2H，d，J=6.6 Hz，H-2，H-5)，5.62(2H，s，4′-OH，4′′-OH)，6.91(2H，s，H-2′，H-2′′)，6.92(2H，d，J=1.7 Hz，H-5′，H-5′′)，6.95(2H，d，J=1.7 Hz，H-6′，H-6′′)；13C NMR(CDCl3，150 MHz)δC：13.0(3-Me，4-Me)，44.3(C-3，C-4)，55.9(3′-OMe，3′′-OMe)，87.3(C-2，C-5)，109.1(C-2′，C-2′′)，114.1(C-5′，C-5′′)，119.3(C-6′，C-6′′)，134.2(C-1′，C-1′′)，145.0(C-4′，C-4′′)，146.4(C-3′，C-3′′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[8]報道對照基本一致，故鑒定化合物為nectandrin B。

化合物3微黃油狀；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δH：0.78(3H，d，J=6.8 Hz，H-9′)，1.02(3H，d，J=6.8 Hz，H-9)，1.79(1H，m，H-8)，2.03(3H，s，H-11)，2.42(1H，m，H-8′)，3.68(1H，d，J=11.2 Hz，H-7′)，3.80(3H，s，4-OMe)，3.82(1H，overlap，H-7)，3.82(3H，s，3-OMe)，3.85(3H，s，3′-OMe)，4.16(1H，dd，J=10.8，4.8 Hz，H-7)，6.73(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.81(1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6′)，6.86(1H，d，J=8.3 Hz，H-5)，6.90(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，6.91(1H，dd，J=8.3，2.0 Hz，H-6)，6.92(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δC：13.5(C-9′)，17.1(C-9)，21.0(C-11)，34.4(C-8)，40.3(C-8′)，56.5(C-7′)，56.5(3′-OMe)，56.5(3-OMe)，57.3(4-OMe)，67.2(C-7)，112.8(C-2′)，112.8(C-2)，113.0(C-5′)，116.3(C-5)，121.2(C-6′)，121.2(C-6)，137.6(C-1′)，139.7(C-1)，145.6(C-4′)，148.6(C-4)，148.9(C-3′)，150.2(C-3)，173.3(C-10)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[9]報道對照基本一致，故鑒定化合物為7-(3,4-dimethoxyphenyl)-7′(4′-hydroxy-3′-methoxyphenyl)-8,8′(dimethylbutyl)acetate。

化合物4白色粉末;1H NMR(CD3OD，600 MHz)δH：0.75(3H，d，J=7.0 Hz，H-9′)，0.98(3H，d，J=7.0 Hz，H-9)，1.89(1H，m，H-8)，2.02(3H，s，H-11)，2.36(1H，m，H-8′)，3.62(1H，d，J=11.73 Hz，H-7′)，3.80(1H，d，J=11.2 Hz，H-7)，3.82(3H，brs，H-12)，3.82(3H，brs，H-13)，4.12(1H，dd，J=10.9，5.1 Hz，H-7)，6.71(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.73(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.76(1H，dd，J=8.0，1.6 Hz，H-6′)，6.78(1H，dd，J=8.0，1.6 Hz，H-6)，6.85(1H，d，J=1.6 Hz，H-2′)，6.87(1H，d，J=1.6 Hz，H-2)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δC：13.5(C-9′)，17.1(C-9)，21.0(C-11)，34.3(C-8)，41.9(C-8′)，56.5(C-12)，56.5(C-13)，57.2(C-7′)，67.4(C-7)，112.6(C-2′)，112.8(C-2)，116.1(C-5′)，116.3(C-5)，121.1(C-6′)，121.2(C-6)，138.0(C-1′)，138.4(C-1)，145.3(C-4′)，145.3(C-4)，148.8(C-3′)，148.8(C-3)，173.8(C-10)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[10]報道對照基本一致，故鑒定化合物為henricine B。

化合物5微黃油狀；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δH：2.14(3H，brs，H-9)，2.15(3H，brs，H-9′)，3.78(3H，s，3′-OMe)，3.87(1H，m，H-8′)，3.89(3H，s，4′-OMe)，3.95(1H，d，J=14.8 Hz，H-8)，6.02(2H，s，OCH2O)，6.78(1H，d，J=8.2 Hz，H-5′)，6.91(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，6.92(1H，d，J=1.6 Hz，H-2′)，7.05(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)，7.23(1H，dd，J=8.2，1.6 Hz，H-6′)，7.28(1H，dd，J=8.2，2.0 Hz，H-6)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δC：15.9(C-9′)，16.0(C-9)，48.2(C-8′)，48.4(C-8)，54.9(3′-OMe)，55.1(4′-OMe)，102.1(OCH2O)，107.2(C-5′)，107.6(C-5)，109.9(C-2′)，110.7(C-2)，124.8(C-6)，126.4(C-6′)，129.7(C-1)，131.5(C-1′)， 148.1(C-3′)，148.9(C-3)，152.2(C-4′)，153.8(C-4)，197.8(C-7′)，198.3(C-7)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[11]報道對照基本一致，故鑒定化合物為(8R,8′R)-3,4-Dimethoxy-3′,4′-methylenedioxy-7,7′-dioxo-8,8′-neolignan。

化合物6紅色油狀；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δH：1.90(2H，m，H-8，H-8′)，2.57(2H，m，H-7a，H-7a′)，2.64(2H，m，H-7b，H-7b′)，3.58(4H，m，H-9，H-9′)，3.73(6H，s，3-OMe，3′-OMe)，6.53(2H，dd，J=8.0，1.8 Hz，H-6，H-6′)，6.58(2H，d，J=1.8 Hz，H-2，H-2′)，6.65(2H，d，J=8.0 Hz，H-5，H-5′)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δC：34.6(C-7，C-7′)，42.6(C-8，C-8′)，54.7(3-OMe，3′-OMe)，60.7(C-9，C-9′)，111.6(C-2，C-2′)，114.3(C-5，C-5′)，121.3(C-6，C-6′)，132.4(C-1，C-1′)，144.0(C-4，C-4′)，147.4(C-3，C-3′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[12]報道對照基本一致，故鑒定化合物為secoisolariciresinol。

化合物7褐色油狀；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δH：2.80(2H，m，H-β′)，3.23(1H，t，J=8.2 Hz，H-2′)，3.39(2H，m，H-3′，H-4′)，3.54(1H，m，H-5′)，3.72(1H，dd，J=16.9，8.1 Hz，H-α)，3.97(1H，dd，J=16.7，8.0 Hz，H-α)，4.34(2H，m，H-1′，H-6′)，4.51(1H，dd，J=11.8，1.8 Hz，H-6′)，6.30(1H，d，J=15.8 Hz，H-α′′)，6.55(1H，dd，J=8.0，1.8 Hz，H-6)，6.65(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.69(1H，d，J=1.8 Hz，H-2)，6.78(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′′)，6.90(1H，dd，J=8.0，1.8 Hz，H-6′′)，7.05(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′′)，7.58(1H，dd，J=15.8，2.0 Hz，H-β′′)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δC：35.3(C-β)，63.2(C-6′)，70.3(C-4′)，71.0(C-α)，73.6(C-2′)，74.0(C-5′)，76.5(C-3′)，103.1(C-1′)，113.4(C-α′′)，113.6(C-2′′)，114.9(C-5)，115.1(C-5′′)，115.7(C-2)，119.8(C-6)，121.8(C-6′′)，126.2(C-1′′)，129.9(C-1)，143.2(C-4)，144.7(C-3)，145.4(C-β′′)，145.9(C-3′′)，148.2(C-4′′)，167.8(C=O)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[13]報道對照基本一致，故鑒定化合物為calceolarioside B。

4 化合物抗炎活性研究

細胞培養(yǎng)參照文獻[14]的操作步驟，在CO2濃度為5%，溫度為37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)含有RAW 264.7巨噬細胞的培養(yǎng)基，隔天傳代，備用。衡量NO水平的指標為Griess法測定樣品中的NO2-/NO3-。取RAW 264.7單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板(200 μL /孔)中，細胞數(shù)為1×104/孔。在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，將100 μL 陽性藥(吲哚美辛)或受試化合物溶液加入到每個孔中，并設置5個復孔。在30 min后每孔加入100 μl的LPS(終濃度5 μg/mL)。然后置于37 ℃培養(yǎng)24 h，吸取培養(yǎng)液上清50 μL加入到酶標板中，加入50 μL Griess I試劑，再加入50 μL Griess II試劑，540 nm處測定吸光值。抑制率I的計算公式為:

化合物對LPS誘導RAW 264.7巨噬細胞釋放NO的抑制率見表2，可以看出吲哚美辛的抑制率為49.43%，化合物1、6、7的抑制率均比吲哚美辛的抑制率高，由此說明化合物1、6、7具有較好的NO釋放的抑制作用。這為今后探尋華中五味子抗炎活性成分提供了一些科學依據(jù)。

表2 化合物對LPS誘導RAW 264.7巨噬細胞釋放NO的抑制率

5 討論

目前，對于華中五味子的研究主要為果實，關于其藤莖的化學成分研究報道較少[15]。本實驗從華中五味子藤莖的95%乙醇提取物的乙酸乙酯部位分離、鑒定了7個化合物，化合物1為糖苷類化合物，化合物2～7均為木脂素類化合物，且化合物1為新化合物。此外對這些化合物進行了抗炎活性研究，研究表明化合物1、6、7在50 μmol/L的濃度下，對小鼠RAW264.7巨噬細胞的NO生成抑制率均比吲哚美辛的抑制率高，說明化合物1、6、7具有較好的NO釋放的抑制作用，這對木脂素類和糖苷類化合物的生物活性研究具有一定的價值和意義。炎癥是人類疾病中最常見的病理過程，大多數(shù)疾病均與此有關[16]。根據(jù)華中五味子的應用和價值，其抗炎活性及其作用機制值得進一步研究。本研究不僅豐富了華中五味子的化學成分及藥理活性研究，還為其木脂素成分、糖苷類成分的抗炎活性提供了實驗依據(jù)，并對華中五味子進一步的開發(fā)與利用提供了理論基礎。