胡 苡 ，周 薇，宋忠臣

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院牙周病科，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，上海市口腔 醫(yī)學(xué)研究所，上海 200011；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院· 口腔醫(yī)學(xué)院口腔微生態(tài)與系統(tǒng)性疾病實驗室，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海 200125

牙周炎（periodontitis）是一種微生物相關(guān)的、宿主介導(dǎo)的、多因素參與并導(dǎo)致牙周附著喪失的炎癥性疾病[1-2]。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis） 是牙周炎主要致病菌之一，脂多糖 （lipopolysaccharide，LPS） 是其主要毒力因子，有促進炎癥激活和放大的作用。牙周局部炎癥會破壞上皮的完整性，使牙周袋內(nèi)的炎癥介質(zhì)如白細胞介素（interleukin，IL）等細胞因子從牙周袋進入血液循環(huán)系統(tǒng)和外周免疫器官，引起系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)[3]。因此，牙周慢性反復(fù)感染和宿主炎癥免疫反應(yīng)不僅導(dǎo)致牙周支持組織的破壞，也成為許多系統(tǒng)性疾病如心血管疾病、糖尿病、呼吸系統(tǒng)疾病等的重要危險因素[4]。近年來探討牙周炎和系統(tǒng)性疾病的共同危險因素及可能機制已成為研究熱點。

牙周炎患者外周循環(huán)中促炎因子的表達量明顯高于健康人群，提示炎癥反應(yīng)及其釋放的炎癥因子可能是牙周炎與多種系統(tǒng)性疾病關(guān)聯(lián)的機制[5]。牙周炎可使全身處于微炎癥狀態(tài)，誘發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，通過炎癥機制促進包括阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）在內(nèi)的系統(tǒng)性疾病的發(fā)生和發(fā)展[6-7]。AD 是一種以進行性認(rèn)知功能障礙為主要臨床癥狀的神經(jīng)退行性疾病，已成為繼心腦血管疾病、惡性腫瘤之后威脅老年人生命的第三大疾病[8]。腦內(nèi)炎癥是AD 的關(guān)鍵病理標(biāo)志之一，認(rèn)知狀態(tài)惡化與促炎介質(zhì)入腦有關(guān)[9-10]。在AD 患者的血清和腦脊液中檢測到IL-1β、IL-6 等牙周炎相關(guān)細胞因子表達上調(diào)，與認(rèn)知功能衰退、AD 風(fēng)險進一步升高有關(guān)[11-13]。但目前牙周炎與AD的相關(guān)機制尚不清楚。

流行病學(xué)調(diào)查提示牙周炎與系統(tǒng)性疾病密切相關(guān)[4]。本課題組前期研究已證實，急性腹腔注射P. gingivalis-LPS 可誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥[14]。但實驗性牙周炎對外周及腦內(nèi)炎癥狀態(tài)的影響尚不清楚。因此，本研究擬觀察齦溝注射P. gingivalis-LPS 建立的實驗性牙周炎對大鼠外周血、外周免疫器官及中樞內(nèi)炎癥水平的影響，為證實牙周局部感染能夠誘發(fā)外周炎癥及腦內(nèi)炎癥提供實驗依據(jù)，以進一步探討牙周炎在AD 進程中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 實驗動物 8 ～10 周齡健康雄性SD 大鼠，體質(zhì)量250 ～300 g，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院中心實驗室[實驗動物使用許可證號SYXK（滬）2016-0016]提供，飼養(yǎng)在控制光、溫度和濕度的SPF 級環(huán)境中，并允許其自由獲得食物和水。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)（批件號SH9H-2019-A465-1）。

1.1.2 主要試劑與儀器 P. gingivalis-LPS、TAK-242（Invivogen，美 國），RNAiso Plus、PrimeScript?反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒（Takara，日本），LightCycler?480（Roche，瑞士），Iba1（Arigo Biolaboratories，中國臺灣），GFAP（Abcam，美國），激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP2，德國）。

1.2 齦溝內(nèi)注射P. gingivalis-LPS 建立大鼠實驗性牙周炎模型及實驗分組

8 ～10 周 齡SD 大 鼠 隨 機 分4 組（n=6），具 體 分組情況如下。①LPS 組：雙側(cè)上頜第一磨牙齦溝內(nèi)注射P. gingivalis-LPS。 ②LPS+TAK-242 組： 腹 腔 注 射TAK-242，1 h 后向雙側(cè)上頜第一磨牙齦溝內(nèi)注射等劑量的P. gingivalis-LPS。③TAK-242 組：腹腔注射TAK-242。④ 對照組（control 組）：腹腔注射等量生理鹽水。

采用腹腔注射10% 水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉大鼠。麻醉滿意后，對每只大鼠進行齦溝內(nèi)注射 （P. gingivalis-LPS）、腹腔內(nèi)注射（TAK-242），藥物劑量均為每次0.5 mg/kg，每周2 次，持續(xù)10 周。

1.3 蘇木精-伊紅染色

蘇 木 精- 伊 紅 染 色（hematoxylin-eosin staining，H-E staining）方法如下。按照每 100 g 體質(zhì)量，腹腔注射0.4 mL的10%水合氯醛麻醉大鼠。麻醉后取大鼠上頜骨，置于4%多聚甲醛中固定，4 ℃過夜。將上頜骨置于10%的EDTA脫鈣液中，每3 ～5 d 換液1 次，持續(xù)4 ～6 周，直至針能無阻力穿透上頜骨。切取大鼠上頜第一磨牙段組織塊，常規(guī)石蠟包埋，切片，脫蠟，蘇木素染色，沖洗，分化，浸泡，伊紅染色，沖洗，浸泡，脫水，透明，封片。

1.4 免疫組織化學(xué)染色觀察腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞及星形膠質(zhì)細胞

腹腔注射10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉大鼠。麻醉滿意后取材，固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、粘片、烤片、染色。采用離子鈣結(jié)合蛋白1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）標(biāo)記腦內(nèi)的小膠質(zhì)細胞，膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）標(biāo)記腦內(nèi)的星形膠質(zhì)細胞，采用LEICA 顯微鏡對每張切片進行拍攝。

1.5 實時定量熒光檢測

用實時定量熒光 PCR（real-time PCR，RT-PCR）檢測大鼠外周及中樞內(nèi)IL-1β、IL-6、IL-8 基因的表達水平。

大鼠麻醉后采集腹主動脈血，每只大鼠采集4 ～5 mL血，置于肝素鈉抗凝采血管內(nèi)。無菌條件下用等體積滅菌PBS 稀釋抗凝管內(nèi)剩余的3 ～3.5 mL 血，混勻待用。使用Ficoll 對外周血進行密度梯度離心（800×g，25 min），分離得到外周血單核淋巴細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。研磨大鼠脾臟及腦組織得到組織勻漿。

采用TRIzol 法提取RNA，按PrimeScript?反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄。得到cDNA 后按SYBR?Primix Ex Taq ? Ⅱ說明書，采用磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參基因，采用Light Cycler?480 進行RT-PCR。RT-PCR 反應(yīng)條件及流程：預(yù)變性（98 ℃，5 min），變性（98 ℃，15 s，40 循環(huán)），退火（55 ℃，15 s），延伸（72 ℃，30 s）。引物序列見表1。

表1 基因引物序列Tab 1 Primer sequences of target genes

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphd Prism5.0 軟件進行統(tǒng)計分析，定量數(shù)據(jù)以±s 表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步采用Tukey 法進行2 組間的比較。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗性牙周炎大鼠的牙周組織病理變化

通過H-E 染色觀察大鼠上頜第一磨牙區(qū)的牙周組織狀況。對照組與TAK-242 組大鼠牙槽骨未見明顯吸收，骨表面較平整光滑，纖維排列整齊清晰；而齦溝注射P. gingivalis-LPS 可造成大鼠上頜第一磨牙牙槽骨高度下降，與對照組相比，牙槽骨高度吸收至根尖1/3；且牙槽骨表面出現(xiàn)不規(guī)則吸收凹陷，伴大量炎癥細胞浸潤，纖維排列紊亂。在LPS+TAK-242 組，第一磨牙區(qū)的牙槽骨水平下降及炎癥反應(yīng)得到部分逆轉(zhuǎn)（圖1）。H-E 染色結(jié)果表明，齦溝注射P. gingivalis-LPS 可導(dǎo)致牙周炎樣病理改變，實驗性牙周炎模型成功建立。

圖1 齦溝注射P. gingivalis-LPS 誘導(dǎo)的牙周炎對大鼠牙周組織的影響（H-E 染色）Fig 1 Effects of periodontitis induced by P. gingivalis-LPS on periodontal tissues in rats (H-E staining)

2.2 實驗性牙周炎大鼠PBMCs 中促炎因子表達水平的變化

如圖2 所示，對照組與TAK-242 組大鼠PBMCs 的mRNA 表達水平均無統(tǒng)計學(xué)差異。與對照組相比，齦溝注射P. gingivalis-LPS 可顯著上調(diào)大鼠PBMCs 中IL-1β（P=0.027）、IL-6（P=0.007）、IL-8（P=0.038） 的mRNA表達。LPS+TAK-242 組與LPS 組相比，上述因子的上調(diào)均受到明顯抑制（P=0.010，P=0.013，P=0.020）。結(jié)果顯示，齦溝注射P. gingivalis-LPS 誘導(dǎo)的實驗性牙周炎可上調(diào)大鼠PBMCs 中促炎因子如IL-1β、IL-6、IL-8 的表達水平，且上述變化可部分被TAK-242 阻斷。

2.3 實驗性牙周炎大鼠脾臟中促炎因子表達水平的變化

如圖3 所示，對照組與TAK-242 組大鼠脾臟的mRNA 表達水平均無統(tǒng)計學(xué)差異。與對照組相比，齦溝注射P. gingivalis-LPS 可顯著上調(diào)大鼠脾臟中IL-6（P=0.033）和IL-8（P=0.001） 的mRNA 表 達。LPS+TAK-242 組 與LPS 組相比，IL-1β（P=0.027）、IL-8（P=0.005）的上調(diào)均受到明顯抑制；IL-6 的表達呈下調(diào)趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示，齦溝注射P. gingivalis-LPS 誘導(dǎo)的實驗性牙周炎可上調(diào)大鼠脾臟中促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8的表達水平，且上述變化可部分被TAK-242 阻斷。

圖2 齦溝注射P. gingivalis-LPS 誘導(dǎo)的牙周炎對大鼠PBMCs 中促炎因子mRNA 表達水平的影響Fig 2 Effects of periodontitis induced by P. gingivalis-LPS on the mRNA expression of proinflammatory factors in the PBMCs of rats

圖3 齦溝注射P. gingivalis-LPS 誘導(dǎo)的牙周炎對大鼠脾臟中促炎因子mRNA 表達水平的影響Fig 3 Effects of periodontitis induced by P. gingivalis-LPS on the mRNA expression of proinflammatory factors in the spleen of rats

2.4 實驗性牙周炎大鼠腦內(nèi)海馬中小膠質(zhì)細胞及星形膠質(zhì)細胞的變化

在大鼠腦內(nèi)海馬中可見到小膠質(zhì)細胞被Iba1 染色。在對照組、LPS+TAK-242 組和TAK-242 組中僅有少量活化的小膠質(zhì)細胞；而在LPS 組中可觀察到具有不規(guī)則突起的、活化的小膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯增加（圖4A）。說明齦溝注射P. gingivalis-LPS 誘導(dǎo)的牙周炎可激活海馬的小膠質(zhì)細胞，且上述激活作用可被TAK-242 部分阻斷。

在大鼠腦內(nèi)海馬中可見到星形膠質(zhì)細胞被GFAP 染色。在對照組，LPS+TAK-242 組和TAK-242 組中僅有少量活化的星形膠質(zhì)細胞；而在LPS 組中可觀察到胞體增大、不規(guī)則突起增加的星形膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯增加（圖4B）。說明齦溝注射P. gingivalis-LPS 誘導(dǎo)的實驗性牙周炎可激活海馬的星形膠質(zhì)細胞，且上述激活作用可被TAK-242 部分阻斷。

2.5 實驗性牙周炎大鼠海馬內(nèi)促炎因子表達水平的變化

如圖5 所示，對照組與TAK-242 組大鼠內(nèi)海馬中各促炎因子的mRNA 表達水平均無統(tǒng)計學(xué)差異。與對照組相比，齦溝注射P. gingivalis-LPS 可顯著上調(diào)大鼠腦組織中IL-1β（P=0.040）、IL-6（P=0.035）、IL-8（P=0.010）的mRNA 表達。LPS+TAK-242 組與LPS 組相比，IL-1β（P=0.018）、IL-6（P=0.042）的上調(diào)均受到明顯抑制；IL-8 的表達呈下調(diào)趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示，齦溝注射P. gingivalis-LPS 誘導(dǎo)的實驗性牙周炎可上調(diào)大鼠腦組織中促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8 的表達水平，且上述變化可部分被TAK-242 阻斷。

圖4 齦溝注射P. gingivalis-LPS 誘導(dǎo)的牙周炎對大鼠海馬內(nèi)小膠質(zhì)細胞及星形膠質(zhì)細胞的影響（DAB 染色，×200）Fig 4 Effects of periodontitis induced by P. gingivalis-LPS on microglia and astrocytes in the hippocampus of rats (DAB staining, ×200)

圖5 齦溝注射P. gingivalis-LPS 誘導(dǎo)的牙周炎對大鼠海馬中促炎因子mRNA 表達水平的影響Fig 5 Effects of periodontitis induced by P. gingivalis-LPS on the mRNA expression of proinflammatory factors in the hippocampus of rats

3 討論

P. gingivalis-LPS 不僅可以破壞牙周支持組織，同時可造成全身微炎癥狀態(tài)，擴散至中樞神經(jīng)系統(tǒng)[15]。目前尚未有研究報道齦溝注射P. gingivalis-LPS 建立的實驗性牙周炎對外周及神經(jīng)炎癥的影響 。

本研究參考Li 等[16]的實驗方法，采用向大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙齦溝內(nèi)注射P. gingivalis-LPS 的方法建立實驗性牙周炎模型。H-E 染色結(jié)果證實LPS 組大鼠的牙槽骨明顯吸收，骨表面出現(xiàn)不規(guī)則凹坑狀骨吸收，伴有炎癥細胞浸潤、纖維排列紊亂等牙周炎樣病理變化，提示牙周炎模型建立成功。

牙周炎釋放的免疫炎癥因子進入系統(tǒng)性循環(huán)可誘發(fā)系統(tǒng)性炎癥。牙周炎可上調(diào)牙周組織內(nèi)促炎因子IL-1β、IL-6的水平，上述因子進入系統(tǒng)性循環(huán)后可對遠隔組織及器官產(chǎn)生影響[17-18]。健康人群的外周循環(huán)中促炎因子表達水平極低，然而在牙周炎患者體內(nèi)，除牙周組織局部促炎因子水平升高外，外周循環(huán)中也可檢測到促炎因子表達明顯增加[5]。脾臟作為機體重要的淋巴器官和第二大免疫器官，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[19]。有研究[19]發(fā)現(xiàn)E. coli-LPS能夠誘發(fā)脾組織釋放大量促炎因子進入體循環(huán)。本實驗發(fā)現(xiàn)，齦溝注射P. gingivalis-LPS 建立的實驗性牙周炎可導(dǎo)致大鼠外周血及脾臟中促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8 的表達明顯上調(diào)，證實牙周炎可引發(fā)外周血及外周免疫器官炎癥。

神經(jīng)炎癥主要是由小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的活化以及細胞因子、趨化因子或生長因子的釋放引起的，且神經(jīng)炎癥通常發(fā)生在AD 初期[20]。Venneti 等[21]已證實，活化的小膠質(zhì)細胞可分泌促炎介質(zhì)，過度活化的星形膠質(zhì)細胞也可導(dǎo)致炎癥細胞因子的產(chǎn)生，并導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[22]。腦組織中普遍存在炎癥反應(yīng)，小膠質(zhì)細胞和星型膠質(zhì)細胞呈簇狀集中于淀粉樣斑塊周圍，神經(jīng)血管單元的“炎癥網(wǎng)絡(luò)”加劇神經(jīng)元丟失，在AD 形成和發(fā)展過程中具有關(guān)鍵性作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，LPS 組大鼠腦組織內(nèi)由Iba1 標(biāo)記的小膠質(zhì)細胞和GFAP 標(biāo)記的星形膠質(zhì)細胞均呈激活狀態(tài)，給予TAK-242 可阻斷上述變化。

持續(xù)性的外周和中樞炎癥及其連鎖反應(yīng)是AD 炎癥病理的關(guān)鍵特征[23]。腹腔注射P. gingivalis-LPS 可誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥[11]。IL-1β 的水平在AD 患者腦中持續(xù)上調(diào)，是AD的關(guān)鍵分子之一；已證實IL-1β 可促進活化的小膠質(zhì)細胞釋放多種炎癥介質(zhì)，進而激活星形膠質(zhì)細胞，形成細胞因子“正反饋”導(dǎo)致神經(jīng)炎癥[24-26]。IL-6 可介導(dǎo)AD 患者腦內(nèi)免疫反應(yīng)，參與神經(jīng)炎癥和老年斑的形成過程，在AD患者的血漿、腦脊液、腦內(nèi)斑塊中表達明顯增加，且其表達水平隨著AD 進展上調(diào)，可導(dǎo)致神經(jīng)細胞損傷[27-28]。IL-8 作為趨化因子可發(fā)揮炎癥趨化作用，在AD 狀態(tài)下吸引中性粒細胞至腦內(nèi)病變區(qū)加重?fù)p傷，在AD 患者的血清和腦脊液內(nèi)濃度均明顯高于健康對照組[29-30]。本實驗證實齦溝注射P. gingivalis-LPS 建立的實驗性牙周炎可上調(diào)大鼠腦組織內(nèi)IL-1β、IL-6、IL-8 的表達水平，促進神經(jīng)炎癥發(fā)展。

本實驗發(fā)現(xiàn)齦溝注射P. gingivalis-LPS 建立的實驗性牙周炎模型可以通過引發(fā)大鼠外周血和以脾為代表的外周免疫器官炎癥，同時使腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞活化，促進腦內(nèi)神經(jīng)炎癥；即牙周炎可通過外周及中樞的炎癥反應(yīng)促進AD 的發(fā)生和發(fā)展。

參·考·文·獻

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