朱之星 ，紀 偉，顧堅磊 ，呂 暉 , ，田國力

1. 上海交通大學附屬兒童醫(yī)院，上海市兒童醫(yī)院生物醫(yī)學信息研究中心，上海 200040；2. 上海交通大學附屬兒童醫(yī)院兒童精準醫(yī)學大數據工程技術研究中心，上海 200040；3. 上海交通大學附屬兒童醫(yī)院新生兒篩查中心，上海 200040；4. 上海交通大學生命科學技術學院，上海交通大學－耶魯大學生物統計與數據科學聯合中心，上海 200240

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏癥是常見的一種先天性酶缺乏遺傳病，由定位于Xq28 上的G6PD 基因（OMIM:305900）突變導致G6PD 酶活性降低或缺乏。該基因編碼為一個由515 個氨基酸組成的酶蛋白亞基，其同源二聚體具有酶活性，并能進一步產生酶促活性的四聚體蛋白[1-2]。G6PD 酶活性的降低會引起紅細胞不能抵抗氧化損傷而遭受破壞，從而產生急性溶血，部分可引起新生兒期高膽紅素腦病，導致智力低下甚至死亡[2]。

G6PD 缺乏癥作為我國新生兒疾病篩查主要疾病之一，主要通過檢測濾紙干血片血斑樣品的酶活性，并結合后續(xù)生化或基因檢測來明確診斷。隨著測序技術的發(fā)展，G6PD 基因的突變位點被廣泛研究[3-5]。1993 年杜傳書團隊[5]利用APCR 單鏈產物以雙脫氧鏈終止法對該基因進行DNA 序列測定，首次在中國人群中發(fā)現了6 種G6PD 基因突變位點。如今，G6PD 缺乏癥已知突變位點已達近200種[3]，其中在中國人群中被報道的有40 多種[4,6-7]。多種基因檢測方法不斷發(fā)展[6,8-10]，其中多色探針熒光PCR 熔解曲線法[10]因其檢測速度快、簡便、低成本等特點而被廣泛使用。

然而，基因突變導致G6PD 酶活性降低或缺乏的分子機制尚未明確。有研究[11]認為基因突變導致了G6PD 酶蛋白穩(wěn)定性的降低，也有研究[12-13]提示突變影響了輔酶NAPD+及底物與酶蛋白結合能力，從而影響其正常的生物學功能。為了更好地了解不同突變從哪些方面影響了酶活性，本研究分析了新生兒篩查G6PD 缺乏癥人群的酶活性及基因突變分布情況，從分子、結構及功能的角度將4 種常見突變，即c.95A>G、c.1376G>T、c.1388G>A、c.1024C>T，與野生型G6PD 酶進行比較，并對這些突變蛋白結構及功能進行預測分析，揭示G6PD 突變與酶學結構、功能的關系，以期為遺傳咨詢提供幫助。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入上海交通大學附屬兒童醫(yī)院2014—2017 年收集的205 103 例新生兒G6PD 缺乏癥篩查記錄（為保護患者隱私，在數據進行分析處理前，患者的個人可識別信息均已被剔除）。研究獲上海交通大學附屬兒童醫(yī)院倫理委員會批準（2019R075-E01）。

1.2 方法

新生兒出生72 h 后，針刺足跟采血于濾紙上，制成濾紙干血片標本。通過新生兒G6PD 缺乏癥篩查及分析并存于醫(yī)院新生兒篩查中心系統。

1.2.1 G6PD 酶活性檢測 采用新生兒G6PD 測定試劑（PerkinElmer，美國）及VICTOR ?D 熒光計（Wallac Oy， 芬蘭），遵照實驗室建立的標準操作流程檢測：在室溫下使血斑樣品和含有 G6P、NADP+的底物試劑反應30 min，可通過添加硫酸銅減緩反應速度。熒光計設定激發(fā)波長為355 nm 和460 nm，進行熒光強度測量（熒光強度與酶活性呈正比），由機載軟件處理得到G6PD 酶活性數據。設定酶活性的最低標準，以U/g（每克血紅蛋白中）為酶活性單位，活性低于2.0 U/g 判定為初篩陽性。

1.2.2 16 個中國人群常見G6PD 突變位點的PCR 擴增 采用熒光PCR 熔解曲線法，取直徑為3 mm 的3 個濾紙干血片，參照全血-824 核酸提取Mini 試劑盒（廈門致善生物科技有限公司，中國）說明書，通過 Lab-aid 824全自動核酸提取儀（廈門致善生物科技有限公司，中國）提取人基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂?SLAN-96S熒光定量PCR 儀（廈門致善生物科技有限公司，中國）對靶標基因進行PCR 擴增。

反應的體系均為：DNA 模板2.6 μL，2×PCR 混合體系 14.0 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各0.7 μL，用雙蒸水補足體積至25.0 μL。反應程序為：50 ℃UnG 酶處理2 min；95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，65 ℃～56 ℃退火15 s（每個循環(huán)下降 1 ℃），76 ℃延伸20 s 以上過程進行10 個循環(huán)；隨后95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，76 ℃延伸20 s 過程進行50 個循環(huán)。

采用G6PD 基因突變檢測試劑盒，根據靶標與探針雜交產物熔點的差異來檢測突變位點，可以定性檢測出16種中國人群常見的G6PD 基因突變，分別為：c.95A>G、c.383T>C、c.392G>T、c.487G>A、c.493A>G、c.517T>C、c.519C>T、c.592C>T、c.871G>A、c.1004C>A、c.1024C>T、c.1360C>T、c.1376G>T、c.1381G>A、c.1387C>T、c.1388G>A。

1.3 酶活性及突變情況統計學分析

應用R3.6.3 軟件對數據結果進行統計分析，定量數據以M（Q1，Q3）表示，定性數據以n （%）表示。Wilcoxon秩和檢驗分析酶活性與突變基因類型之間的關系，在顯著性水平=0.05 的條件下，對檢驗假設“H0:μ1=μ2；H1:μ1≠μ2”進行檢驗，其中μ1、μ2 分別為2 個總體的均值，以秩和W 作為統計量，P<0.05 認為有統計學意義。所有檢驗均為雙側檢驗。隨后對不同突變的酶活性采用G6PD 缺乏癥嚴重等級分型[14-15]進行描述性統計分析，以比較不同突變對患者造成的影響是否具有差異。

1.4 酶蛋白空間結構預測

G6PD 基因具有13 個外顯子，除去1 號外顯子不編碼蛋白，根據cDNA 翻譯的氨基酸序列，包含有515 個氨基酸，此外G6PD 的活性蛋白在人體中以同源二聚體和同源四聚體形式出現[2]。

G6PD 的cDNA 參考序列及氨基酸序列來源于Ensembl基因組數據庫（ENST00000393564.6），Psipred[16-17]、SOPMA[18]、JPred4[19]被用來預測蛋白的二級結構。使用SWISS-MODEL[20]預測氨基酸鏈的空間結構，并參比PDB[21-22]蛋白結構數據庫6e08 和6e07.1.A 分別構建蛋白單體及二聚體。

為保證預測可靠性，利用Mupro[23]、SDM[24-25]、CUPSAT[26]、mSCM[27]、DUET[28]、Dynamut[29]6 種基于結構、圖形特征、統計勢能等蛋白穩(wěn)定性分析工具同時對突變前后蛋白的穩(wěn)定性進行預測，以突變后蛋白折疊自由能的變化量ΔΔG作為統計量。若ΔΔG>0[23-29]，則表示突變后蛋白結構的穩(wěn)定性增加，反之表示蛋白結構穩(wěn)定性降低。蛋白結構及預測圖使用PyMOL 完成，LigPlot+[30]用來構建配體與蛋白相關作用預測圖。

采用PROVEAN[31]工具預測氨基酸的改變對蛋白功能的影響。為保證更高的有害突變靈敏度，設置閾值為-1.3[31]，PROVEAN 得分≤-1.3 的變量被認為是“有害的”，得分> -3 的變量被認為是“中性的”。

2 結果

2.1 G6PD 酶活性檢測情況

2014—2017 年新生兒篩查的205 103 例G6PD 活性檢測血樣，男嬰106 654 例（52%），女嬰98 449 例（48%），中位采血日齡3 d（3 d，5 d），中位胎齡39+3周 （38+4周，40+1周），中位孕周體質量3 350 g（3 080 g，3 620 g）。通過熒光分析法測定G6PD 酶活性，確診G6PD 缺乏癥230例，其中男211 例（占92%），女19 例（占8%）。

2.2 基因突變檢測分析

采用多色探針熒光PCR 溶解曲線法對121 例G6PD酶缺陷樣本進行檢測分析，檢測出8 種點突變，其中7 種單堿基突變，分別是 c.95A>G、c. 1024C>T、c.392C>T、c.1376G>T、c.1388G>A、c.487G>A、c.517T>C，1 種復合點突變?yōu)閏.95A>G+c.1388G>A。來自全國14 個行政區(qū)不同突變的酶活性結果如圖1 所示。本研究人群除c.95A>G、c.1376G>T、c.1388G>A 3 種 常 見 突 變，c.1024C>T 也表現出高發(fā)生率，4 種突變占檢測總人數的91%，且前3 種突變酶活性主要分布在0.2 ～0.6 U/g，c.1024C>T 突變則主要分布在0.4 ～0.8 U/g。

采用Wilcoxon 秩和檢驗估計4 種主要突變與酶活性之間的關系。表1 顯示，c.1376G>T、c.1388G>A、c.95A>G 突變的酶活性兩兩之間差異均無統計學意義，3種突變與c.1024C>T 突變的酶活性比較，差異均有統計學意義，結果表明部分基因突變位點與酶活性有關 。

對不同突變進行分組，根據 G6PD 缺乏癥嚴重等級分型[14-15]進行統計分析，發(fā)現121 例陽性記錄僅表現出了Class Ⅲ和Class Ⅳ 2 種等級，且各突變兩兩之間比較差異均無統計學意義，見表2。

表1 4 種主要突變位點兩兩間的Wilcoxon 檢驗結果Tab 1 Wilcoxon test results between four major mutation positions

2.3 G6PD 酶蛋白的空間結構

2.3.1 G6PD 酶蛋白的二級結構 G6PD 野生型蛋白主要包含α-螺旋、β-折疊、β-轉角以及無規(guī)則卷曲，其中α-螺旋 有228 個氨基酸，β-折疊占66 個氨基酸，β-轉角有37個氨基酸，無規(guī)則卷曲有184 個氨基酸，4 種二級結構呈現于整個氨基酸鏈。與野生型蛋白相比，4 種突變蛋白的二級結構均有不同程度的改變，如表3 所示：4 種突變構成α-螺旋的氨基酸均減少，β-折疊的氨基酸均增加，c.95A>G 與c.1388G>A 2 種突變的β-轉角氨基酸均減少了2 個，無規(guī)卷曲增加了3 個。

表2 突變位點與酶活性缺乏嚴重度情況Tab 2 Severity of mutation positions and enzyme activities

表3 G6PD 野生型及4 種突變蛋白的二級結構預測情況Tab 3 Prediction of secondary structure of G6PD wild type and four mutant proteins

2.3.2 G6PD 蛋白野生型空間構型 G6PD 蛋白單體由多個α-螺旋（圖2A 藍紫）及β-折疊（圖2A 粉）構成了2個結構域，即底物結構域和α+β 結構域。前者較小的位于肽鏈N 端，參與底物的結合；后者主要由9 股β-折疊構成，與亞基的聚合有關；在折疊區(qū)還具有NAPD+配體的結合位點。G6PD 活性蛋白由2 個相同的亞基構成（圖2B橘黃和藍紫），具有2 個NADP+配體的結合位點以及多個GOL 位點（圖2）。

2.3.3 G6PD 活性蛋白4 種高頻突變的空間構型 圖3 中顯示了4 種錯義突變氨基酸情況，以及突變位點與其他氨基酸共價鍵形成情況及相互作用的情況。

圖2 G6PD 蛋白空間構型Fig 2 G6PD protein spatial configuration

圖3 4 種突變位點與相鄰氨基酸的相互作用變化情況Fig 3 Interaction between four mutation sites and adjacent amino acids

從圖中可以看到，H32 位于蛋白Rossman 結構區(qū)，H32R 突變前后部分殘基之間的共價鍵斷裂，成型環(huán)消失，此外也形成了新的陽離子鏈接區(qū)及極性鍵作用區(qū)（圖3A）。R459 位于蛋白表面α 螺旋遠離輔酶和底物結合區(qū)，用于穩(wěn)定自身α 螺旋與相鄰α 螺旋。與野生型相比，R459L 突變后與相鄰α 螺旋間氫鍵、離子作用及極性作用均消失，與N181 號位氨基酸形成新的弱極性鍵（圖3B）。R463 同樣處于蛋白表面α 螺旋處，但與底物葡萄糖-6-磷酸結合位點相鄰（圖4），R463H 突變后部分氫鍵斷裂、離子相互作用減弱，并且遠離了配體甘油（GOL）的結合位點（圖3C、圖4），L342 位氨基酸處于α-β 結構域中的β-折疊區(qū)，L342F 突變導致該β 結構角度發(fā)生改變，另外形成了更多的疏水間連接，產生芳香基，出現成型環(huán)結構（圖3D）。

圖4 配體GOL 與氨基酸相互作用情況Fig 4 Interaction between ligand GOL and amino acids

2.3.4 穩(wěn)定性分析 采用6 種常用的蛋白穩(wěn)定性預測方法對4 個突變后蛋白進行分析，綜合結果顯示4 種突變均可能造成不同程度蛋白穩(wěn)定性的降低，尤其c.1388G>A 突變最為顯著（表4）。

表4 6 種預測方法對4 種突變蛋白穩(wěn)定性預測結果Tab 4 Six prediction methods for predicting the stability of four mutant proteins

2.3.5 氨基酸改變對蛋白功能的影響 采用PROVEAN分析軟件對4 種氨基酸改變導致的蛋白功能改變情況進行預測，結果顯示4 種突變的PROVEAN 得分均低于閾值-1.3，被判定為有害影響（表5）。

此現象表明，在蛋白質三維結構上，不同部分的4 個錯義突變對G6PD 的表達具有負面影響。

表5 4 種突變位點對蛋白功能影響的預測結果Tab 5 Prediction of the effect of four mutation positions on protein function

3 討論

本研究回顧性分析了205 103 例新生兒G6PD 酶活性篩查記錄，報道了其中的230 例酶活性檢測G6PD 陽性樣本，并對其中121 例進行了基因突變位點的檢測；共檢出8 種常見突變，其中3 種中國人群最常見突變被報道，發(fā)生率與其他研究相似，并有1 種突變c.1024C>T 在本研究中也表現出了高發(fā)生率。G6PD 基因的突變導致氨基酸的替換進而引起酶活性水平的降低。通過血液學研究，可根據紅細胞中殘留酶活性水平來判斷G6PD 缺乏癥癥狀嚴重程度。本研究的測定樣本均來自新生兒濾紙干血片，以2.0 U/g 作為篩查臨界值，所有突變體均顯示出了比野生型酶蛋白低的活性（圖1）。然而突變導致酶活性水平的降低可能是由于影響到G6PD 二聚體的形成、蛋白穩(wěn)定性、NADP+結合區(qū)或者底物結合區(qū)等，比如F501 號位氨基酸突變成C501 改變了NADP+結合位點的大小，L205號位氨基酸與底物G6P 的結合及催化作用有關，不同的影響因素可能引起不同的臨床表征。

通過對G6PD 的結構分析，發(fā)現α-螺旋及β-折疊氨基酸數量的改變可能會直接影響多肽鏈在空間上的折疊情況，造成固有結構域上原子或氨基酸之間的錯位。c.95A>G 突變導致32 號位的組氨酸轉變成精氨酸，H32位點位于蛋白Rossman 結構域，是β-α-β 組成的超二級結構單元，其序列為His-Ile-Phe-Ile-Ile-Met，由32 號組基酸開始，至37 號甲硫氨酸結束，共6 個氨基酸。Rossman折疊的結構域常含有功能性結合部位或活性部位，能調控整個酶的活性，因此在該位點上的突變可能會改變口袋的位置或大小，從而影響酶活性。此外，很多Rossman結構區(qū)具有磷酸化位點，磷酸化位點常出現在His 或Asp位置；而在該單元中32 號位恰好是His 位置，因此該位點也可能與蛋白的磷酸化/去磷酸化有關，該位點的突變可能導致了該位點無法去磷酸化，從而影響酶活性。c.1376G>T 突變導致精氨酸（R）突變成亮氨酸（L），亮氨酸是一個更為保守的氨基酸，氨基酸的保守突變在決定蛋白質三維結構與功能方面起重要作用。野生型R459 與D181 和N185 之間的螺旋間相互作用對于酶的催化活性和穩(wěn)定性有重要影響，而突變型L459 導致螺旋間相互作用被削弱，從而使得相鄰兩螺旋的位移變大，螺旋結構變得松散。另外，L459 號位氨基酸的側鏈與四聚體聚合有關，二聚體和四聚體的動態(tài)平衡對維持G6PD 蛋白具有重要作用。R463 與R459 同處一個α 螺旋，與L292、C294、I295、E460 形成了穩(wěn)定的氫鍵、離子相互作用，穩(wěn)定蛋白α 螺旋結構以及底物G6P 結合區(qū)。H463 突變導致該位點的側鏈集團遠離底物，與底物相互作用消失（圖4），并且打斷了與L292、C294、I295 等氨基酸的各種共價鍵與非共價鍵作用（圖3C），與E460 號位的鹽鍵崩潰，進而導致酶活性降低。L342 位于G6PD 中α+β 結構域的9 股不平衡β-折疊區(qū)，后與c.1024C>T 突變導致了亮氨酸突變成苯丙氨酸，F342 增大了該位點氨基酸所需的空間（圖3D），而該位點的后一位氨基酸Y343 與底物GOL 接觸，L342 突變可能在空間結構上會造成Y343 與底物的錯位；L342 處于β 發(fā)夾結構并靠近β 轉角（PDB 6e08），與F354 號位氨基酸形成氫鍵穩(wěn)定發(fā)夾結構，F342 突變不僅會破壞穩(wěn)定的發(fā)卡結構，還可能由于空間障礙阻礙β-轉角的形成，使酶的三維結構改變。另外F342 突變增加了更多的疏水鍵，使得酶蛋白結構的剛性增加，而蛋白活性區(qū)的柔性與蛋白催化效率直接相關已經被證實，因此這一突變可能會導致蛋白催化活性的降低。4 種突變上述的結構錯位、空間障礙、氫鍵斷裂、鹽鍵崩潰、柔性降低等影響，均可能導致酶蛋白的不穩(wěn)定，從而降低突變蛋白的穩(wěn)定性；如表4 中總結，4 種突變蛋白穩(wěn)定性均表現出降低，并且對G6PD 蛋白均會造成不良影響，從而引起G6PD 蛋白的缺乏，造成新生兒的溶血等。

本研究詳細地分析了G6PD 基因突變與酶活性降低的關系，根據基因突變引起的表達差異，從蛋白結構和功能上分析導致酶活性降低的可能原因。一方面對指導臨床有重要作用；另一方面為我國G6PD 常見基因突變酶學結構與功能的研究提供了資料和理論依據，也為研究兒童遺傳代謝類疾病提供了蛋白結構的分析方向。在G6PD 酶學結構及功能的研究和應用上，仍有許多未解決的問題有待探索。大多數已知的突變位點的蛋白結構仍然未被解析，酶活性降低是由于蛋白結構改變、穩(wěn)定性降低、聚合能力的缺失還是配體結合能力的改變仍然不清楚，還有待未來研究人員探索。

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