李希凡 ，韓紅梅 ，王志強 ，鄭文超 ，李天祥

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.河北生之谷農(nóng)業(yè)科技有限公司，石家莊 050200）

半夏為天南星科植物半夏 [Pinellia ternate（Thunb.）Breit.]的干燥塊莖。其味辛、溫，有毒。歸脾、胃、肺經(jīng)。具有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結(jié)等功效。本品是中國傳統(tǒng)的名貴中藥材，至今有達兩千多年的用藥歷史[1]。通過對常用588個中藥處方分析可知，半夏出現(xiàn)頻率位于第22位；在日本210個漢方中有半夏者46個，占22%；在300個常用痰嗽方中用半夏者有142個，約占46%，半夏為最廣泛應(yīng)用的30種中藥之一[2]。西醫(yī)學(xué)研究表明，半夏主要含有機酸、生物堿、半夏蛋白、揮發(fā)油、氨基酸、多糖和無機元素等化學(xué)成分，其中有機酸為半夏祛痰止咳成分，生物堿類具有鎮(zhèn)吐效果，多糖類有扶正祛邪、增強免疫力的作用[3-5]。2015版《中華人民共和國藥典》以琥珀酸作為指標(biāo)成分，但中藥以多成分、多靶點、多層次發(fā)揮治療作用。因此，本研究基于半夏的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，以總浸出物、多糖類、有機酸、生物堿為考察指標(biāo)，采用多組分對半夏進行整體質(zhì)量評價，來全面反映不同產(chǎn)地以及野生與栽培半夏整體質(zhì)量特征，為其臨床運用提供參考。

1 材料、儀器與試劑

1.1 藥材來源 為了客觀反映不同產(chǎn)地半夏藥材，對不同產(chǎn)區(qū)的主要產(chǎn)地，收集多個樣地的樣品。藥材來源于5個產(chǎn)區(qū)17個產(chǎn)地及樣地，樣品去除泥沙與雜質(zhì)，干燥，粉碎，過4號篩，備用。樣品信息見表1（栽培年限為1年）。

1.2 儀器 自動電位滴定儀（上海禾工科學(xué)儀器有限公司），紫外可見光分光光度計（上海美普達有限公司），遠紅外快速干燥箱（上海賀德實驗設(shè)備有限公司），電子天平（上海舜宇恒平科技儀器有限公司），二列四孔智能水浴鍋（河南省鞏義市儀器有限責(zé)任公司），調(diào)溫電熱套（山東省鄄城永興儀器廠），超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），循環(huán)水式多用真空泵（同上），無油空氣泵（天津市津分分析儀器制造有限公司），移液槍（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.3 試劑 硫酸（分析純，天津市化學(xué)試劑五廠），蒽酮（分析純，上?？曝S化學(xué)試劑有限公司），無水乙醇（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司），娃哈哈純凈水（天津娃哈哈宏振飲料有限公司），正丁醇（分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司），氯仿（分析純，同上），甲醇（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），乙腈（色譜純，天津市康科德科技有限公司），氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液（濃度：0.1015 mol/L，GB/T601-2016，同上）、鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液（濃度：0.1026 mol/L，GB/T601-2016，同上）。標(biāo)準(zhǔn)品：無水葡萄糖（批號：MUST-11020603，北京鼎國昌盛技術(shù)有限公司）、鹽酸麻黃堿（批號：171241-201508，中國食品藥品檢定研究院）。

表1 5個產(chǎn)區(qū)17個產(chǎn)地及樣地半夏藥材樣品采集信息表Tab.1 Collection information of Pinellia ternate samples from 17 producing areas and sample sites in 5 production areas

2 方法

2.1 總有機酸含量的測定

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱定半夏粉末約5g，置錐形瓶中，加乙醇50 mL，加熱回流1 h，同上操作，再重復(fù)提取2次，放冷，濾過，合并濾液，蒸干，殘渣精密加入氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）10 mL，超聲處理（功率 500 W、頻率 40 kHz）30 min，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加新沸過的冷水至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 測定方法 精密量取25 mL供試品溶液，照電位滴定法（2015版《中華人民共和國藥典》四部通則0701）測定，用鹽酸滴定液（0.1 mol/L）滴定，并將滴定的結(jié)果用空白實驗校正。每1mL氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）相當(dāng)于 5.904 mg的琥珀酸（C4H4O4）。

滴定終點確定：自動電位滴定儀根據(jù)實驗得到的電位E值和滴定體積V值繪制一級微商ΔE/ΔV曲線，曲線峰值對應(yīng)的體積即為滴定終點。

2.1.3 樣品含量測定 取半夏樣品按“2.1.1”項下方法制備樣品，按“2.1.2”項下方法進行測定，計算半夏有機酸的含量，重復(fù)3次，結(jié)果取算術(shù)平均值。

2.2 總生物堿和多糖含量的測定

2.2.1 供試品溶液的制備總生物堿 精密稱定半夏樣品粉末約0.25 g，置50 mL錐形瓶中，加濃氨水0.5 mL，濕潤后，加氯仿10 mL，稱定質(zhì)量。冷浸3 h后超聲提取1 h，加氯仿補質(zhì)量，過濾，殘渣以氯仿10 mL分3次洗滌，合并濾液與洗液，60℃以下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收氯仿至干。加入氯仿8.0 mL溶解并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，依次加入0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液10 mL和溴麝香草酚藍標(biāo)準(zhǔn)液1.0 mL，充分振搖，靜置20 min，分取氯仿層，水層再用氯仿同法萃取2次，每次8 mL。合并氯仿層，用氯仿定容于25 mL量瓶中，即得總生物堿供試品溶液。

溴麝香草酚藍標(biāo)準(zhǔn)液配制方法：取0.1 g溴麝香草酚藍，精密稱定，溶于50%乙醇，定容至100 mL容量瓶即得。

多糖[6-8]精密稱定半夏藥材干燥粉末0.5 g，置于150 mL圓底燒瓶中，加入95%乙醇50 mL，水浴回流2次，每次0.5 h，過濾，棄去兩次濾液，回收濾渣，濾渣加蒸餾水50 mL，回流2次，每次1 h，過濾，合并兩次濾液，活性炭脫色后轉(zhuǎn)移定容至100 mL容量瓶中，取0.4 mL溶液稀釋至10 mL容量瓶中，取2 mL加入至25 mL具塞試管中，冰水浴中緩慢滴入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的硫酸蒽酮，搖勻，置于沸水浴中10 min，取出，冰水浴冷卻后即得多糖供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備 取鹽酸麻黃堿對照品約4.0 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得鹽酸麻黃堿濃度為0.16 mg/mL的對照品溶液。

取無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品精密稱定1.7 mg，加入蒸餾水定容至25mL容量瓶中，即得濃度為0.68 mg/mL葡萄糖對照品溶液。

2.2.3 檢測條件 取總生物堿、多糖供試品溶液于紫外413、625 nm波長處測定吸光度，并根據(jù)吸光度計算總生物堿及多糖含量。

2.2.4 方法學(xué)考察 線性關(guān)系考察分別精密吸取1.5、1.8、2.1、2.4、2.7、3.0、3.3、3.5 mL 的鹽酸麻黃堿對照品溶液至分液漏斗中，加蒸餾水至2.0 mL，加氯仿8.0mL，再依次加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液10mL和溴麝香草酚藍標(biāo)準(zhǔn)液1.0 mL，充分振搖，靜置15 min，分取氯仿層，水層再用氯仿同法萃取2次，每次8 mL。合并氯仿層，用氯仿定容于25 mL量瓶中，即得。以相應(yīng)的試劑同法制作空白。在波長413nm處測定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：Y=4.349 4X-0.360 5，R2=0.999 3，表明鹽酸麻黃堿含量在0.120 0～0.280 0 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

分別精密取對照品溶液 0.05、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.00、1.10 mL，蒸餾水定容至 10 mL，配制成濃度為 0.003 4、0.010 2、0.020 4、0.030 6、0.040 8、0.051 0、0.061 2、0.068 0、0.074 8 mg/mL 的葡萄糖系列對照品溶液。在“2.2.3”項方法下分別測定吸光度，以吸光度（Y）對濃度（X）做曲線，得線性回歸方程Y=10.89 3X-0.005 1，R2=0.999 8，表明葡萄糖濃度在0.003 4～0.074 8 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 重復(fù)性考察 按“2.2.1”項下總生物堿和多糖供試品溶液的制備方法分別取同一樣品各制備6份供試品溶液，按“2.2.3”項下檢測條件測定吸光度，RSD值分別為2.86%和2.56%，表明重復(fù)性良好。

2.2.6 精密度考察 精密量取總生物堿和多糖的對照品溶液，按“2.2.3”項下檢測條件測定吸光度，分別連續(xù)測量 6次，RSD值分別為 0.069%和0.059%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性考察 取一樣品，按“2.2.1”項下方法分別制備總生物堿和多糖的供試品溶液，按“2.2.3”項下檢測條件于 0、0.5、1、1.5、2、2.5 h 測定吸光度，RSD值分別為0.14%和0.16%，表明樣品至少在2.5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加標(biāo)回收率考察 精密稱量已知總生物堿和多糖含量的樣品粉末0.5 g，各6份，分別加入對照品適量，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，測定吸光度，計算兩者加標(biāo)回收率。平均加標(biāo)回收率分別為100%、98.8%，RSD分別為2.65%、3.87%。

2.2.9 樣品含量的測定 取半夏樣品按“2.2.1”項制備樣品，在“2.2.3”項方法下測定吸光度，按回歸方程計算總生物堿和多糖含量，各重復(fù)3次，結(jié)果取算術(shù)平均值。

2.3 浸出物含量的測定

2.3.1 浸出物的制備方法 取供試品約4 g，精密稱定，置250 mL的錐形瓶中，精密加水100 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用水補足失重，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量。

2.3.2 樣品含量測定 取半夏樣品按“2.3.1”項下方法制備樣品，計算半夏浸出物的含量，重復(fù)3次，結(jié)果取算術(shù)平均值。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。主要是方差分析和主成分分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同產(chǎn)地半夏各成分含量及方差分析 見表2。

表2 5個產(chǎn)區(qū)17個產(chǎn)地及樣地半夏各成分含量（±s，n=3）Tab.2 Content of active components of Pinellia ternate in 17 producing areas and sample sites in 5 producing areas（±s，n=3） mg/g

表2 5個產(chǎn)區(qū)17個產(chǎn)地及樣地半夏各成分含量（±s，n=3）Tab.2 Content of active components of Pinellia ternate in 17 producing areas and sample sites in 5 producing areas（±s，n=3） mg/g

注：同一列沒有相同英文字母者，表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；有相同英文字母者，則表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

樣品編號 浸出物 多糖類 生物堿類 有機酸類1 325.33±0.26fg165.66±0.18fg 0.53±0.01de 2.05±0.15d 2 348.33±0.25e 203.05±0.19bc 0.50±0.00f 2.41±0.16c 3 229.41±0.34j 149.10±0.34h 0.59±0.01b 2.75±0.18bc 4 277.94±0.26h 177.75±0.12e 0.58±0.01c 1.91±0.36d 5 464.49±0.14b 190.90±0.25d 0.50±0.01f 3.94±0.17a 6 317.00±0.14fg214.19±0.10a 0.50±0.01f 3.37±0.07ab 7 373.66±0.35d 168.59±0.27f 0.59±0.01bc1.06±0.26e 8 392.65±0.05c206.42±0.05b 0.54±0.01d 3.08±0.16b 10 202.83±0.16k143.50±0.14hi 0.53±0.01d 2.59±0.35bc 11 332.12±0.30f175.60±0.28e 0.58±0.01bc2.25±0.26cd 12 394.32±0.24c 199.03±0.10c 0.50±0.00f 4.31±0.77abcde 13 497.76±0.38a 161.61±0.48g 0.50±0.00f 3.26±1.22ab 14 235.07±0.31i 171.51±0.25ef 0.70±0.01a 2.66±0.19bc 15 310.80±0.40g 185.21±0.17d 0.52±0.01e 3.54±0.33ab 16 407.86±0.23c 141.54±0.19i 0.49±0.00f 3.27±0.74ab 9（硫熏） 314.52±1.84 202.79±3.61 0.55±0.02 2.84±0.07 17（硫熏） 243.35±6.45 134.53±1.97 0.49±0.00 2.23±0.03

由表2可知，不同產(chǎn)地半夏（除去硫熏的樣品）各化學(xué)組分含量有較大差異。1）基于藥典指標(biāo)成分琥珀酸的含量（2.5 mg/g），12號湖北荊州樣品含量最高，為4.31 mg/g；在15個樣品中5個樣品的含量低于藥典限量標(biāo)準(zhǔn)，各產(chǎn)地樣品琥珀酸的含量在1.06～4.31 mg/g之間，最高者是最低者約3倍以上，說明當(dāng)前市場流通的半夏藥材質(zhì)量參差不齊，并存在一定量的不合格藥材。2）基于生物堿類含量，約在0.49～0.70 mg/g之間，14號河北安國樣品含量最高，為0.70 mg/g，但與其他產(chǎn)地相比，無顯著性差異，各產(chǎn)地含量水平相當(dāng)，波動不大。3）各產(chǎn)地的浸出物的含量差異較大，其中13號湖北荊州樣品為497.76 mg/g，遠高于其他產(chǎn)地樣品含量，且具有顯著性差異。4）各產(chǎn)地樣品多糖類的含量差異較大，甘肅產(chǎn)區(qū)平均含量整體較高，最高者6號甘肅西和樣品含量為214.19 mg/g。

3.2 不同產(chǎn)地半夏（無硫熏）各藥效活性成分主成分分析 主成分分析是利用降維思想，把多個指標(biāo)轉(zhuǎn)化成少數(shù)幾個綜合指標(biāo)的一種統(tǒng)計學(xué)方法。其目的之一是在盡可能減少損失的基礎(chǔ)上得到幾個綜合因子來代表原來眾多變量。半夏是多組分的復(fù)合體，因此，采用主成分分析法對本實驗中測定的4類化學(xué)成分進行評價，綜合考察半夏藥材的品質(zhì)特征。

除去硫熏樣品的干擾，將不同產(chǎn)地半夏化學(xué)組分?jǐn)?shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，利用SPSS對表2數(shù)據(jù)進行分析。SPSS分析結(jié)果顯示，KMO=0.686，巴特利球性檢驗Sig值為0.000＜0.05，數(shù)據(jù)適宜進行主成分分析。

主成分載荷的大小表明主成分能解釋原始變量的程度，結(jié)合表3中的數(shù)據(jù)可知：第一主成分與浸出物、生物堿、有機酸的相關(guān)性較強，基本能夠代表半夏中此3種化學(xué)組分的綜合水平，貢獻率為53.33%；第二主成分主要與生物堿存在較強的相關(guān)性，貢獻率為21.11%，因此這兩個主成分基本反映了原始數(shù)據(jù)的大部分信息，可以體現(xiàn)半夏藥效成分的整體水平。

表3 主成分載荷矩陣及解釋的總方差Tab.3 Principal component load matrix and total variance of interpretation

以F1和F2的貢獻率與兩者累計貢獻率的比值作為權(quán)數(shù)，并以F=0.716F1+0.284 F2求出綜合得分值。由表4、表5結(jié)果可知，基于第一主成分和綜合主成分得分：1）湖北荊州、甘肅西和半夏浸出物、生物堿、有機酸化學(xué)組分含量豐富，整體水平較高，說明湖北荊州和甘肅西和兩地作為半夏優(yōu)質(zhì)產(chǎn)地具備一定的合理性。2）3個產(chǎn)地野生藥材樣品整體水平較高。將貴州省赫章縣的野生和栽培樣品進行比較，并結(jié)合湖北荊州2個野生樣品，野生半夏的浸出物、多糖類、有機酸類含量均高于栽培半夏，生物堿類的含量略低于栽培半夏。說明野生品半夏各化學(xué)組分含量總體水平較高，野生品質(zhì)優(yōu)于栽培半夏。見表6。

表4 15個半夏藥材樣品主成分值、綜合主成分得分Tab.4 Principal component values and comprehensive principal component scores of 15 samples of Pinellia ternate

表5 8個產(chǎn)地半夏藥材主成分均值、綜合主成分得分均值Tab.5 Mean value of principal component and comprehensive principal component scores of Pinellia ternate from 8 producing areas

表6 野生和栽培半夏各藥效活性成分含量（除去硫熏的加工方法）Tab.6 Content of active components in wild and cultivated Pinellia ternate（processing method for removal of sulfur fume） mg/g

3.3 硫熏對半夏各藥效活性成分含量影響的分析 基于半夏硫熏的加工方法，對比了同一產(chǎn)地甘肅清水縣和河北鹿泉硫熏后的樣品，結(jié)果顯示，硫熏半夏浸出物、多糖類、有機酸類成分均下降，其中浸出物下降最多，兩樣品平均下降30%，有機酸也降低20%，生物堿類成分基本保持不變?？梢?，硫熏過程使半夏各活性成分含量下降，見表7。

表7 硫熏加工方法對半夏化學(xué)組分含量的影響（n=3）Tab.7 Effect of sulfur fumigation on chemical constituents of Pinellia ternate（n=3）

4 討論

4.1 湖北荊州、甘肅西和是半夏的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)地 半夏為中國歷史悠久的傳統(tǒng)中藥材，其道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)地出現(xiàn)過較大變遷。唐代以前，半夏以陜西一帶所產(chǎn)為主，逐漸移至山東、江蘇等地，而后以湖北、河南、山東一帶為主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)歷了一個由西到東，又由東至西的歷史變遷過程。目前，半夏主要栽培于甘肅、湖北、貴州、山西、河北等地[9]，文章通過對不同產(chǎn)地半夏樣品各藥效成分含量的測定和主成分分析，湖北荊州、甘肅西和半夏具有豐富的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，其藥材整體質(zhì)量較高，兩地作為半夏的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)地是有一定道理的。這也與古代本草中“產(chǎn)湖北荊州為最”和相關(guān)文獻中的描述相一致[10]。

4.2 半夏化學(xué)成分累積的影響因素 優(yōu)質(zhì)藥材的形成依賴于三大成因條件，即特定的生境（道地產(chǎn)區(qū)）、遺傳因素（優(yōu)良品種）、人為因素（栽培、采收、炮制加工技術(shù)）。湖北荊州和甘肅西和屬于丘陵或山林地帶，地勢相對較陡峭，利于疏水，土壤類型以壤土為主，氣候較溫暖，年均氣溫相對較低，符合半夏喜陰的習(xí)性。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，這兩地的半夏種源相對較純正，但通過實驗發(fā)現(xiàn)，優(yōu)質(zhì)產(chǎn)地也有不合格品的存在，這可能是由于大田多年種植，產(chǎn)生連作障礙以及土壤微生物失衡的結(jié)果。半夏忌旱怕澇，適宜的栽培、采收與加工技術(shù)對高品質(zhì)半夏的形成，至關(guān)重要，湖北荊州和甘肅西和作為半夏的主要產(chǎn)地，在生產(chǎn)技術(shù)上相對比較成熟，為優(yōu)質(zhì)藥材的形成提供了堅定的基礎(chǔ)。

4.3 野生半夏與栽培半夏 目前，半夏以培植為主，本研究收集野生樣品較少，但通過對野生與栽培半夏藥效成分含量考察，發(fā)現(xiàn)野生半夏各藥效成分含量均高于栽培品。這可能是因為野生半夏在自然環(huán)境下生長時間長而緩慢，次生代謝產(chǎn)物積累豐富，而栽培品半夏水肥條件優(yōu)越，土壤營養(yǎng)充足，在整個生長過程中，生物量增加較快，塊莖體積較大，次生代謝產(chǎn)物累積卻相對較少。同時，觀察野生與栽培半夏性狀特征，發(fā)現(xiàn)野生半夏塊莖較小，多數(shù)呈規(guī)則的類圓形，而栽培半夏塊莖較大，且多側(cè)生小塊莖。因此，營養(yǎng)因素是造成栽培半夏品質(zhì)低于野生半夏的主要原因之一，這與張綠明[11]的研究結(jié)果一致。

4.4 硫熏對半夏品質(zhì)的影響 硫熏是利用硫磺燃燒時產(chǎn)生的二氧化硫蒸制藥材的加工方法，有利于藥材的干燥和保存，同時二氧化硫的還原性可以保持半夏藥材原有的色澤，有效抑制霉變和褐變反應(yīng)。文章考察了硫熏對半夏藥效成分的影響，實驗結(jié)果表明硫熏會使半夏藥材各活性成分減少，同時，過量的硫熏還會使砷、汞等元素進入藥材中[12]。因此半夏的產(chǎn)地加工中不宜采用硫熏。

5 結(jié)論

研究從不同產(chǎn)地采集樣品，基于半夏3大功效成分及浸出物含量，全面而系統(tǒng)考察了不同產(chǎn)地半夏藥材整體質(zhì)量特征。湖北荊州、甘肅西和兩地藥材各化學(xué)組分總體水平較高，各產(chǎn)地藥材質(zhì)量參差不齊；半夏由野生變家種，品質(zhì)降低；硫熏造成了半夏有效成分含量降低和二氧化硫的殘留，影響臨床療效和用藥安全。