吳學進，王明月，李春麗，張振山，李萍萍，龐朝海

(中國熱帶農業(yè)科學院 分析測試中心 海南省熱帶果蔬產品質量安全重點實驗室，海南 ?？?571101)

砂仁是姜科豆蔻屬多年生草本植物，系四大南藥之一，為中國傳統(tǒng)大宗常用藥材，具有治療脾胃及妊娠安胎功效。隨著其在消化系統(tǒng)、鎮(zhèn)痛抗炎及代謝疾病等方面的療效越來越受到人們的關注，砂仁的人工種植規(guī)模也逐步擴大[1]。植物源中藥材農藥殘留可能來自人工種植過程病蟲害防治所用農藥殘留，或由種植環(huán)境水土中殘留農藥污染等。砂仁人工種植產品也面臨同樣的農藥殘留超標問題，因此建立砂仁中農藥殘留快速檢測方法對于保障砂仁及其中藥制品的產品質量安全，降低人民群眾的潛在健康風險具有現實意義。

目前，多組分農藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)[2]、液相色譜法(LC)[3]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[4]、氣相色譜-串聯(lián)質譜法(GC-MS/MS)[5]、液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)[6]等。其中GC-MS/MS具有靈敏度高、選擇性好、高通量、抗干擾能力強等優(yōu)點，且采用的多反應監(jiān)測模式(MRM)不僅解決了氣相色譜法和液相色譜法在檢測器靈敏度及確證檢測技術上存在的不足，還可有效消除GC-MS選擇離子掃描(SIM)中存在的離子信息少、定性不準的問題，且儀器價格也較LC-MS/MS低，因此已成為復雜基質樣品中多農藥殘留篩查分析的理想技術。

有機磷類農藥因具有廣譜、高效、降解快等特點而廣泛應用于蔬菜、水果病蟲害防治。但此類農藥殘留可通過食物鏈在人體內積累，具有神經毒性，可造成神經系統(tǒng)紊亂，還會引起染色體畸變，導致癌變或畸形[7]。QuEChERS方法是近年發(fā)展迅速的一種農藥多組分殘留檢測前處理方法，該法因快速、簡便、廉價、高效、安全等優(yōu)點而廣泛用于農藥多殘留快速檢測。QuEChERS結合GC、LC、GC-MS、GC-MS/MS、LC-MS/MS對水果蔬菜中的有機磷類農藥殘留檢測已有大量報道，但應用于中藥材中有機磷農殘檢測的報道較少[8-9]。

本研究以1%(體積分數)乙酸乙腈提取，優(yōu)化了QuEChERS凈化體系，建立了QuEChERS/氣相色譜-串聯(lián)質譜法(GC-MS/MS)同時檢測砂仁中28種有機磷農藥殘留的分析方法。方法操作簡便、快捷、靈敏度高、重復性好，適用于砂仁中的多種有機磷類農藥殘留的快速、高效、準確定性與定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與設備

Agilent 7890A氣相色譜-7000A串聯(lián)質譜儀(美國Agilent公司)；陶瓷均質子(美國Agilent公司，貨號：5982-9313)；MS 3 basic型振蕩器(德國IKA公司)；Mettler Toledo電子分析天平(瑞典梅特勒-托利多公司)；TTL-DCII型氮吹儀(北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司)；LXJ-Ⅱ型B離心機(上海安亭科學儀器廠)；XW-80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器有限公司)。

1.2 試劑與材料

乙腈、乙酸、乙酸乙酯(色譜純，美國Fisher公司)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和十八烷基硅膠鍵合相(C18)購于美國Agilent公司；石墨化炭黑(GCB)、氯化鈉、無水硫酸鎂(分析純，廣州化學試劑有限公司)；28種有機磷農藥標準品購自天津農業(yè)部環(huán)境質量監(jiān)督檢驗測試中心(質量濃度均為1 000 mg/L)。

實驗所用12個砂仁樣品購自海南、廣東、廣西、云南的中藥材市場，經廣東藥科大學藥學院王定勇教授鑒定為姜科，豆蔻屬多年生草本植物砂仁的干燥果實。

1.3 標準溶液的配制

混合標準儲備液：將28種有機磷農藥標準品隨機分成3組，然后精確吸取1.0 mL于10.0 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配成3組100 μg/mL混合標準儲備液。于-18 ℃冰箱中避光密封儲存?zhèn)溆?有效期6個月)。

混合標準儲備中間液：準確吸取上述3組混合標準儲備液各1.0 mL于10.0 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配成10.0 μg/mL混合標準儲備中間液。于4 ℃冰箱內避光保存(有效期1個月)。

混合標準工作溶液：準確吸取一定體積的混合標準儲備中間液于10.0 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，分別配成0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL混合標準工作溶液。于4 ℃冰箱內避光保存(有效期1周)。

基質混合標準工作溶液：準確吸取2.0 mL凈化后的基質空白溶液于15 mL塑料具塞離心管中，在40 ℃水浴下氮氣吹干，加入1.0 mL相應質量濃度的混合標準工作溶液復溶，過微孔濾膜(有機相，13 mm × 0.22 μm)，配成0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL基質混合標準工作溶液，現用現配。

1.4 樣品前處理

制備：12個砂仁樣品經粉碎機粉碎，過50目篩，密封袋封裝，置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

提取：稱取5.00 g(精確至0.01 g)樣品置于50 mL具塞塑料離心管中(內有一個陶瓷均質子)，加入10.0 mL超純水，振蕩渦旋1.0 min后靜置20 min，讓樣品充分潤濕；再加入10.0 mL含1%(體積分數)乙酸乙腈溶液，以1 800 r/min振蕩渦旋勻質2 min；加入4.0 g NaCl渦旋1 min，然后以4 000 r/min離心5 min。

凈化：移取6.0 mL提取上層有機液于15 mL具塞塑料離心管中(內含900 mg MgSO4+150 mg PSA+100 mg C18+25 mg GCB)中，渦旋混勻1 min，以5 000 r/min離心5 min；準確吸取所得凈化上清液2.0 mL轉移至15 mL具塞塑料離心管中，于40 ℃水浴氮氣吹干后加入1.0 mL乙酸乙酯復溶，過有機相微孔濾膜(13 mm×0.22 μm)后上機檢測。

1.5 GC-MS/MS檢測條件

色譜條件：采用HP-5 MS型色譜(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent公司)；程序升溫：初始柱溫70 ℃，保持1 min，以25 ℃/min升至150 ℃，保持3 min；再以15 ℃/min升至200 ℃，保持3 min；最后以20 ℃/min升至270 ℃，保持3 min；總運行時間20 min。載氣為高純He(純度≥99.999%)，流速1.0 mL/min；猝滅氣為氦氣，流速為2.25 mL/min；進樣體積1.0 μL；進樣方式為不分流進樣。

質譜條件：電子轟擊(EI)離子源，電離能量70 eV；離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃；溶劑延遲3.6 min；掃描方式：多反應監(jiān)測模式(MRM)。28種有機磷農藥的保留時間、離子對、碰撞能量等相關參數見表1。

表1 28 種有機磷農藥的GC-MS/MS分析參數

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

以砂仁為基質，將1.0 μg/kg的28種有機磷農藥基質工作混合標準溶液在質荷比(m/z)40～500范圍內進行全掃描模式(Full scan)掃描。通過NIST譜庫檢索確定每種農藥的保留時間，再根據每種農藥化合物的一級譜圖選取相對強度高、特征性強的離子作為母離子；然后對母離子采用產物離子掃描模式(Product scan)獲得二次碎裂產生的子離子。通過優(yōu)化碰撞能量對母離子進行碰撞解離，選擇豐度值大、特征性強、靈敏度高的兩對離子對分別作為該化合物的定量離子對和定性離子對,在多反應監(jiān)測模式(MRM)下測定，圖1為砂仁空白基質中加標量為1.0 mg/kg的28種有機磷農藥殘留的總離子流(TIC)色譜圖。由圖可知，20 min 內即可完成對上述28種有機磷農藥待測物的分析。

圖1 28種有機磷農藥砂仁基質標準(1.0 mg/kg)的總離子流色譜圖

2.2 提取溶劑的選擇

本課題組前期研究比較了丙酮、乙腈和乙酸乙酯提取楊桃基質中氧樂果等37種農藥的回收率[10]。結果顯示，以丙酮為提取溶劑時，氧樂果等37種農藥的回收率較高，但提取出較多的色素等干擾成分，增加了基質效應和儀器維護成本；以乙酸乙酯為提取劑時，37種農藥的回收率為60%～120%；以乙腈為提取溶劑時，農藥的回收率為70%～120%且提取出的色素等干擾成分比丙酮少。此外，還發(fā)現在乙腈中加入1%(體積分數)乙酸，可提高對堿性敏感農藥(如乙酰甲胺磷)的回收率。故本研究也選用1%(體積分數)乙酸乙腈為提取溶劑，具體操作為：在樣品提取前加入10 mL超純水，待樣品成分潤濕，振蕩渦旋1.0 min后靜置20 min，以提高樣品的分散程度；再加入10.0 mL含1%乙酸的乙腈溶液，同時加入4.0 g氯化鈉進行鹽析，以提高萃取效率。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

砂仁是姜科植物果實，除富含乙酰龍腦酯、樟腦等揮發(fā)性成分外，也含有色素、脂肪酸、多糖、鞣質等成分，這些成分易在進樣口、襯管等進樣系統(tǒng)的前端部位富集，不僅會降低檢測靈敏度，還會導致基質效應；既增加了儀器維護的頻率和成本，又影響目標農藥檢測準確度，因此砂仁提取液在上樣檢測前需凈化處理。

農藥殘留檢測中常用的凈化劑有PSA、C18、GCB，其中PSA通過極性作用吸附樣品中有機酸、脂肪酸和糖等干擾物；在硅膠上鍵合了十八烷基官能團的C18，通過非極性相互作用，對極性較弱的脂肪酸、揮發(fā)油、色素等大分子基質干擾物具有較好的吸附效果；GCB具有片層結構，除對色素、甾醇、芳香烴的吸附能力較好[11]外，還對平面結構及對稱性結構的農藥化合物也具有較強的吸附作用，但過量的GCB會導致部分農藥的回收率偏低[12-13]。本實驗選擇無水硫酸鎂用作除水劑，PSA吸附砂仁中的有機酸、鞣質等極性成分，C18去除砂仁中脂肪酸、色素以及一些非極性成分，GCB去除砂仁中的色素和極性干擾成分，在前期研究[14]基礎上，確定MgSO4、PSA和C18的用量分別為900、150、100 mg，再通過調整GCB用量(0、25、50、100 mg)來考察凈化效果。結果顯示，大部分有機磷農藥的回收率為80.0～110%，但隨著凈化體系中GCB用量由25 mg增至100 mg，三唑磷、喹硫磷、亞胺硫磷、伏殺硫磷和蠅毒磷的回收率均呈遞減趨勢，其中三唑磷、喹硫膦的回收率分別由94.6%和95.9%降至84.5%和81.5%，亞胺硫磷由87.4%降至69.6%；而對于具有平面結構的伏殺硫磷和蠅毒膦，兩者的回收率降低更為明顯，分別由89.3%和90.9%降至54.2%和33.1%；由此可知，GCB對三唑磷、喹硫磷有弱吸附作用，對亞胺硫磷有較強吸附作用，對伏殺硫磷和蠅毒磷具有強吸附作用。雖然GCB對部分有機磷農藥有吸附作用，但不加GCB時，凈化液中砂仁香味稍濃，表明芳香物含量更高，綜合考慮回收率及GCB對芳香物的吸附作用，最終確定凈化方案為MgSO4900 mg+PSA 150 mg+C18100 mg+GCB 25 mg。

2.4 基質效應

基質效應(Matrix effect，ME,%)是指樣品分析液中除目標分析物以外的其他組分，在實際檢測時影響分析液的響應值，從而影響目標檢測物定量分析的準確度和重現性[15]的現象?；|效應可通過ME(%)=100% ×(B-A)/A來考察，其中A為純溶劑中待測物標準品的平均響應值，B為空白基質中相同濃度的待測物標準品溶液的平均響應值。ME>0為基質增強效應；ME<0為基質抑制效應。當|ME|≤20%，認為基質效應弱，可以忽略；若其值在20%～50%之間，則表明有中等基質效應；若|ME|>50%，則表明基質效應很強[16-17]?；|效應是殘留檢測中普遍存在的現象，GC-MS/MS檢測方法，更多體現為基質增強效應[18]，這可能是由于在GC-MS/MS系統(tǒng)中，基質的存在減少了色譜系統(tǒng)活性位點與待測目標化合物作用的機會，讓更多的待測物進入色譜柱，使其檢測信號增強[19]所致。本研究比較了同為0.5 μg/mL的溶劑標準溶液與砂仁基質標準溶液的響應值(表2)。結果表明：28種有機磷農藥砂仁基質標準溶液的響應值明顯高于純溶劑標準溶液，均顯示為基質增強效應，其中治螟磷等18種有機磷農藥在砂仁基質中表現為中等基質增強效應，而甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧樂果、久效磷、樂果、甲基對硫磷、殺螟硫磷、硫環(huán)磷、亞胺硫磷、蠅毒磷10種有機磷農藥在砂仁基質中表現為強基質增強效應，尤其是乙酰甲胺磷和氧樂果的ME值分別高達284%和116%。為提高分析準確度，實驗采用基質匹配標準溶液來消除和減弱基質效應的影響。

2.5 方法學考察

2.5.1 標準曲線及檢出限配制質量濃度為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/L的系列基質混合標準工作溶液，在優(yōu)化條件下上機檢測，以待測化合物定量離子對的峰面積(y)為縱坐標，對應質量濃度(x,mg/L)為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明，28種有機磷農藥在0.05～1.00 mg/L質量濃度范圍內具有良好的線性關系(r2≥0.99)。分別以3倍信噪比(S/N≥3)和10倍信噪比(S/N≥10)計算方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，結果見表2。由表2可知，28種農藥的LOD為0.005～0.010 mg/kg,LOQ為0.017～0.033 mg/kg。

2.5.2 精密度與回收率取5.00 g空白砂仁樣品，分別加入一定量混合標準溶液，進行0.2、0.40、1.0 mg/kg 3個水平的加標回收實驗，每個加標水平平行測定6次，計算28種有機磷農藥的回收率和相對標準偏差(RSD)。結果如表2所示，28種農藥的平均回收率為82.1%～104%，相對標準偏差(RSD)均不大于15%。

表2 28 種有機磷農藥在砂仁中的基質效應、平均回收率、相對標準偏差(RSDs)、回歸方程、相關系數(r2)、檢出限和定量下限

(續(xù)表2)

PesticideMatrixeffects/%Spikes level(mg/kg)Average recovery/%RSD/%Regression equationr2LOD(mg/kg)LOQ(mg/kg)Parathion37.80.2,0.4,1.0102,100,98.44.6,7.7,11y=8.43×104x-3.46×1030.996 30.0100.033Isocarbophos49.00.2,0.4,1.0101,97.5,92.76.2,5.6,9.6y=2.26×104x-6.99×1020.997 50.0070.024Isofenphos methyl27.60.2,0.4,1.0103,97.1,99.25.7,6.4,13y=7.06×104x-1.80×1030.997 80.0100.033Terbufos sulfone29.10.2,0.4,1.0104,99.1,99.96.4,3.9,8.0y=1.66×105x-3.88×1020.998 20.0060.020Phosfolan56.70.2,0.4,1.0102,98.3,90.85.0,5.3,8.8y=4.93×104x-1.46×1030.997 90.0060.020Quinalphos27.60.2,0.4,1.0103,98.6,99.55.5,4.9,12y=1.63×105x-3.63×1030.998 10.0060.020Phenthoate29.20.2,0.4,1.0103,97.1,98.36.3,6.6,13y=9.32×104x-2.80×1030.997 10.0060.020Methidathion45.00.2,0.4,1.0104,98.1,96.66.3,3.6,11y=2.54×105x-6.21×1030.998 30.0080.027Profenophos39.40.2,0.4,1.0103,98.1,95.28.2,7.4,13y=1.92×104x-4.41×1020.998 50.0080.027Triazophos40.20.2,0.4,1.0103,99.4,93.27.1,4.7,13y=6.25×104x-1.42×1030.998 50.0060.020Phosmet59.10.2,0.4,1.0102,99.9,91.86.7,5.7,15y=2.93×105x-7.22×1030.999 00.0100.033Phosalone38.60.2,0.4,1.0104,99.6,97.17.5,5.6,14y=1.48×105x-3.38×1030.998 80.0070.024Coumaphos56.80.2,0.4,1.0104,101,93.25.7,4.8,14y=3.07×104x-5.94×1020.999 50.0050.017

2.6 實際樣品檢測

應用本方法對海南、廣東、云南、廣西采集的12批次樣品進行檢測，均未檢出28種有機磷農藥，其原因可能為收集的樣品多來源于當地藥材種植基地，散戶藥材較少，而中藥材種植基地在栽培技術及農藥噴施管理方面也更加規(guī)范。

3 結 論

本文通過優(yōu)化QuEChERS前處理方法，建立了氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜法測定砂仁中28種有機磷農藥殘留的分析方法，涵蓋了《中國藥典》2015年版“0212藥材和飲片檢定通則”規(guī)定的19種有機磷農藥中的16種，方法可在20 min內完成檢測，具有操作簡單、快捷、靈敏度高、重現性好等優(yōu)點，適用于砂仁中28種有機磷農藥殘留的檢測。該方法的建立，不僅對砂仁中農藥殘留具有一定應用價值，還可為姜科同屬或其他中藥材中的農藥殘留檢測提供技術參考，為保障我國中藥材的質量安全提供技術支持。