劉 源，陳紹占，陳 鎮(zhèn)，姚曉慧，周天慧，劉麗萍*

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069；2.北京市疾病預(yù)防控制中心 食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100013；3.北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100013)

硒作為人和動(dòng)物必需的微量元素，在人類健康中起著非常重要的作用，硒攝入不足或過(guò)量均可導(dǎo)致疾病。世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)顯示，全球40多個(gè)國(guó)家存在低硒或缺硒的情況[1]。適量補(bǔ)充硒可對(duì)某些癌癥起到預(yù)防作用[2-5]。目前，膳食補(bǔ)硒是最為直接便捷的硒補(bǔ)充途徑[6]。硒化物存在不同形態(tài)，無(wú)機(jī)形態(tài)的硒化物中，單質(zhì)硒無(wú)毒，亞硒酸鈉的毒性大于硒酸鈉，H2Se的毒性比SeO2大5倍[7]；而硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)等有機(jī)硒富有營(yíng)養(yǎng)，便于動(dòng)物體吸收利用。因此，建立人尿中硒形態(tài)的測(cè)定方法，探究硒在人體中的代謝轉(zhuǎn)化規(guī)律，對(duì)于硒在生物體中的利用、代謝過(guò)程研究及其營(yíng)養(yǎng)作用評(píng)估具有重要意義。

硒形態(tài)的分離檢測(cè)技術(shù)主要有體積排阻色譜(SEC-HPLC)、反相離子對(duì)色譜(RP-IP-HPLC)、液相色譜-原子熒光光譜(LC-AFS)、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP/MS)等。其中，HPLC-ICP/MS憑借其靈敏度高、分離效果好、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品與生物樣本中硒形態(tài)的分析研究。曹玉嬪等[8]采用HPLC-ICP/MS測(cè)定牛蒡和三七中的硒形態(tài)，但只能分離4種硒形態(tài)。王丙濤等[9]利用HPLC-ICP/MS測(cè)定食品中SeCys2、亞硒酸鹽Se(Ⅳ)、SeMet、硒代乙硫氨酸(SeEt)、硒酸鹽Se(Ⅵ)5種硒形態(tài)，但分析時(shí)間長(zhǎng)達(dá)21 min。張碩等[10]使用RP-8反相色譜整體柱和自制的高靈敏度原子熒光光譜系統(tǒng)，分離了SeCys2、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ)4種硒形態(tài)。喻宏偉等[11]使用HPLC-ICP/MS在RP18反相色譜柱上分離了人尿中的5種硒形態(tài)，但部分質(zhì)子化組分在主峰后形成干擾峰，給定量分析帶來(lái)誤差。Chatterjee等[12]使用GS-220色譜柱分離了人尿中Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)和三甲基硒離子(TMSe+)3種硒形態(tài)，但其實(shí)用性受到限制。Moreno等[13]使用Phenomenex Luna C18色譜柱分析人尿中硒形態(tài)，但MeSeCys與Se(Ⅳ)未完全分離。目前，使用陰離子交換色譜進(jìn)行硒形態(tài)分離的文獻(xiàn)報(bào)道最多[14-15]。為更好地探究硒在人體中的吸收代謝情況，本文采用直接稀釋/HPLC-ICP/MS法對(duì)人尿中SeCys2、MeSeCys、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ)5種硒形態(tài)進(jìn)行分析，可為進(jìn)一步研究硒與人體健康的關(guān)系提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1260 型高效液相色譜儀及7700x型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)；Hamilton PRP-X100陰離子交換柱(250 mm×4 mm，10 μm)及其保護(hù)柱(美國(guó)哈密爾頓公司)；Milliplus 2150超純水處理系統(tǒng)(美國(guó)密理博公司)；數(shù)控超聲清洗器(可控溫20～80 ℃，昆山市超聲儀器有限公司)。超純水：電阻率18.2 MΩ·cm；磷酸氫二銨((NH4)2HPO4，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)為優(yōu)級(jí)純；甲醇(美國(guó)Sigma公司)、甲酸(ROE Scientific公司)為色譜純；蛋白酶XIV(美國(guó)Sigma公司)；SeCys2、MeSeCys、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

1.2 樣品前處理方法

直接稀釋法：取1 mL尿樣于15 mL離心管中，加入2 mL超純水稀釋，渦旋30 s，9 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm水系濾膜，同時(shí)做空白對(duì)照。

超聲酶解法：取1 mL尿樣于15 mL離心管中，加入2 mL超純水稀釋，渦旋30 s，分別加入10、20 mg的蛋白酶XIV并于37 ℃下加熱超聲1 h，9 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm水系濾膜，同時(shí)做空白對(duì)照。

1.3 測(cè)定方法

色譜條件：色譜柱：Hamilton PRP-X100陰離子交換柱(250 mm×4 mm，10 μm)；流動(dòng)相：40 mmol/L(NH4)2HPO4(含1%甲醇，pH 5)；流速：1.2 mL/min，數(shù)據(jù)采集時(shí)間：13 min；進(jìn)樣量：100 μL。

ICP/MS條件：RF入射功率：1 550 W，載氣：高純氬氣，載氣流速：0.70 L/min，輔助氣流速：0.45 L/min，射頻電壓：1.80 V，采樣深度：8.0 mm，泵速：0.3 r/s。

圖1 5種硒形態(tài)的色譜圖(25 μg/L)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

選擇40 mmol/L(NH4)2HPO4作為流動(dòng)相，考察了流動(dòng)相pH值對(duì)5種目標(biāo)硒形態(tài)分離度的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)pH<5時(shí)，MeSeCys與Se(Ⅳ)的分離度較差；當(dāng)pH=5時(shí)，5種硒形態(tài)的分離度最好；當(dāng)pH>5時(shí)，5種硒形態(tài)的分析時(shí)間明顯縮短，但分離度變差；當(dāng)pH>7時(shí)，部分硒形態(tài)不能出峰。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相中加入1%甲醇可以增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度，且不影響硒形態(tài)的分離度，因此最終選擇40 mmol/L(NH4)2HPO4(含1%甲醇，pH 5)作為流動(dòng)相。本方法為等度洗脫，為縮短分析時(shí)間，調(diào)節(jié)流動(dòng)相流速為1.2 mL/min，可在13 min內(nèi)完成樣品測(cè)定(見(jiàn)圖1)。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

分別采用直接稀釋法和超聲酶解法對(duì)新鮮尿樣進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，新鮮尿樣經(jīng)超聲酶解法預(yù)處理后，隨著加酶量的增加，測(cè)得SeCys2及Se(Ⅳ)的質(zhì)量濃度減少，SeMet及Se(Ⅵ)增加，而總硒形態(tài)減少。由此可見(jiàn)，超聲酶解法會(huì)改變尿中硒形態(tài)，不適用于尿中硒形態(tài)的預(yù)處理。因此，本實(shí)驗(yàn)采用直接稀釋法進(jìn)行前處理，可以滿足分析要求。

表1 兩種預(yù)處理方法對(duì)尿中硒形態(tài)分析結(jié)果的比較

Table 1 Comparison of analysis results for selenium speciations in urine by two pretreatment methodsρ/(μg·L-1)

Sample SeCys2MeSeCysSe(Ⅳ)SeMetSe(Ⅵ)Total selenium speciationSample 1 direct dilution(尿樣1直接稀釋)14.3-?3.73--18.1Sample 1+10 mg enzyme(尿樣1+10 mg酶)4.20-2.152.101.8410.3Sample 1+20 mg enzyme(尿樣1+20 mg酶)1.22-1.602.931.897.64Sample 2 direct dilution(尿樣2直接稀釋)7.06-2.17--9.24Sample 2+10 mg enzyme(尿樣2+10 mg酶)4.18-1.431.721.208.53Sample 2+20 mg enzyme(尿樣2+20 mg酶)2.24-1.082.191.827.34

*not detected

2.3 線性范圍與檢出限

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，分別配制0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0、300.0 μg/L的SeCys2、MeSeCys、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用本方法進(jìn)行測(cè)定，以各形態(tài)的色譜峰面積(y)與對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度(x，μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，5種硒形態(tài)在0～300.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性較好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999(見(jiàn)表2)。

檢出限采用逐級(jí)稀釋法測(cè)定，以3倍基線噪聲(S/N=3)時(shí)硒形態(tài)的質(zhì)量濃度為檢出限，SeCys2、MeSeCys、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ)的檢出限分別為0.2、0.2、0.2、0.5、0.3 μg/L(見(jiàn)表2)。

表2 方法的線性關(guān)系及檢出限

2.4 方法準(zhǔn)確性

采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)考察方法準(zhǔn)確性。選取1個(gè)尿樣，分別添加10.0、30.0、70.0 μg/L 3個(gè)濃度水平的5種硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行制備6個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，SeCys2的加標(biāo)回收率為37.7%～70.4%，其余4種硒形態(tài)的回收率為80.0%～123%。

針對(duì)SeCys2加標(biāo)回收率較低的情況，選擇上述同一尿樣進(jìn)行了SeCys2單標(biāo)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)濃度為20 μg/L,SeCys2的回收率僅為37.0%和35.2%。綜合加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)尿液基質(zhì)對(duì)SeCys2測(cè)定有影響，具體影響機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

表3 5種硒形態(tài)的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

*not detected

2.5 方法精密度

2.5.1 實(shí)際樣品的精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示精密度。選取1個(gè)尿樣，制備6個(gè)平行樣品，采用本方法測(cè)定其硒形態(tài)的含量，分別計(jì)算RSD。結(jié)果表明，5種硒形態(tài)的RSD均不大于7.8%。

2.5.2 模擬樣品的精密度向?qū)嶋H尿樣中加入3個(gè)濃度水平的5種硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備成模擬樣品，采用本方法測(cè)定硒形態(tài)的含量，分別計(jì)算RSD。由表3可知，5種硒形態(tài)的RSD均不大于4.7%。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)6名志愿者的隨機(jī)尿樣與40份送檢隨機(jī)尿樣進(jìn)行硒形態(tài)測(cè)定。結(jié)果顯示，6名志愿者的尿樣中主要硒形態(tài)為SeCys2，質(zhì)量濃度為1.88～11.4 μg/L，占測(cè)得總硒形態(tài)的57.2%～82.6%，另有少量的MeSeCys、Se(Ⅳ)、SeMet和Se(Ⅵ)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)1份志愿者尿樣在Se(Ⅵ)峰后出現(xiàn)未知形態(tài)1(U1)，見(jiàn)圖2A；1份志愿者尿樣在SeCys2峰前出現(xiàn)未知形態(tài)2(U2)，見(jiàn)圖2B。40份送檢尿樣中主要硒形態(tài)為SeCys2，質(zhì)量濃度為0.77～3.16 μg/L，占測(cè)得總硒形態(tài)的41.9%～88.0%，另有少量的MeSeCys、Se(Ⅳ)、SeMet和Se(Ⅵ)，在部分送檢尿樣中發(fā)現(xiàn)SeCys2峰前出現(xiàn)未知形態(tài)3(U3)，見(jiàn)圖2C，其保留時(shí)間與U2相近。對(duì)于未知形態(tài)的具體成分有待進(jìn)一步分析。

圖2 尿樣1(A)、尿樣2(B)與尿樣3(C)的硒形態(tài)色譜圖

3 結(jié) 論

本研究建立了尿液中5種硒形態(tài)的高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜分析方法，比較了超聲酶解法與直接稀釋法的提取效果，并優(yōu)化了測(cè)定條件，可在13 min內(nèi)完成5種硒形態(tài)分析。采用該方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)人體尿液中硒形態(tài)主要以SeCys2為主，同時(shí)含有少量MeSeCys、SeMet、無(wú)機(jī)硒及未知含硒化合物。該方法具有樣品前處理簡(jiǎn)便、靈敏度高、精密度好、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，除了SeCys2的加標(biāo)回收率較低外，其余4種硒形態(tài)的回收率可以滿足分析要求。研究結(jié)果可為探究硒在人體中的吸收代謝情況和進(jìn)一步研究硒與健康的關(guān)系提供技術(shù)支持。