莊玉嬌 巫仙群 王宇蕊 文 勉 羅貴鈴 孫 偉 牛燕燕*

(海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院?？谑泄δ懿牧吓c光電化學(xué)重點實驗室海南海口 571158)

適配體(Aptamer)是經(jīng)過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化的體外篩選技術(shù)而獲得的，具有特異性結(jié)合能力的DNA或RNA片段，基于其單鏈核酸結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象多樣性，能夠與特定的靶分子通過假堿基對的氫鍵、堆積、靜電作用等結(jié)合形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，具有極強的識別能力和親和力[1-3]。光電化學(xué)生物分析技術(shù)是基于光照條件下，識別元件和目標(biāo)分子間的生物識別作用引起的光電活性物質(zhì)產(chǎn)生電信號變化的一種方法，可以實現(xiàn)待測物的定量檢測。該方法的激發(fā)信號和檢測信號的能量形式不同，傳感信號的背景值低于傳統(tǒng)電化學(xué)方法，因此具有較高的靈敏度和較低的檢測限[4-6]。

Hg2+是一種常見的重金屬污染物，多存在于土壤或者水體中且不能被降解，而且可以通過微生物的作用轉(zhuǎn)變?yōu)閯《镜募谆?，往往通過食物鏈富集并對人體健康產(chǎn)生極大危害，尤其對神經(jīng)、腎臟等損傷較嚴(yán)重，可造成認(rèn)知和行動障礙[7-10]。傳統(tǒng)的Hg2+檢測方法有原子吸收法、陽極溶出伏安法、等離子體質(zhì)譜法等。雖然這些方法靈敏度高、特異性強，但是樣品前處理復(fù)雜，儀器價格昂貴且運行成本高，難以滿足快速實時檢測的需求。一些快速在線的檢測方法，如酶分析法、免疫分析法等，則無法對待檢測物準(zhǔn)確定量，靈敏度和準(zhǔn)確性也比較低[11]。為實現(xiàn)簡便快速的檢測目的，越來越多的研究開始關(guān)注如何提高定量分析的靈敏度和準(zhǔn)確性。

本文以半導(dǎo)體納米TiO2為光電活性材料，以氧化銅錫(ITO)導(dǎo)電玻璃為基底電極，進一步修飾金納米星，通過Au-S鍵的共價結(jié)合，將巰基修飾的特異性適配體固定在其表面，以巰基乙酸做封閉劑，經(jīng)過實驗參數(shù)的優(yōu)化，構(gòu)建了一個光電化學(xué)分析的適配體傳感器，其光電化學(xué)反應(yīng)原理如圖1所示。該傳感器用于檢測Hg2+時，適配體中的T堿基與其形成穩(wěn)定的“T-Hg2+-T”結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致傳感界面發(fā)生變化[12，13]，使傳感器特異性識別Hg2+前后光電流響應(yīng)發(fā)生變化，從而實現(xiàn)Hg2+的快速定量分析。

圖1 適配體傳感器的制備及Hg2+檢測過程示意圖Fig.1 Illustration for aptamer sensor formation and Hg2+ detection process

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

PEAC 200A光電化學(xué)反應(yīng)儀(天津艾達恒晟科技發(fā)展有限公司)，激發(fā)光波長為365 nm(LED光源)，偏置電壓為0.2 V。光電化學(xué)測試在IGS1130電化學(xué)工作站(廣州盈思儀器有限公司)上進行，采用三電極工作系統(tǒng)，以氧化銦錫(ITO，天津艾達恒晟科技發(fā)展有限公司)導(dǎo)電玻璃為基底電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲為對電極。電解液為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=7.0)。JSM-7600F熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡、JSM-2010F透射電子顯微鏡(日本，JEOL公司)。

納米TiO2和Au納米星購自南京先豐納米材料科技有限公司。乙醇、丙酮、巰基乙酸(MPA)、磷酸鹽等均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。As3+、Mn2+、Al3+等金屬離子溶液均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心。適配體(上海生工生物工程技術(shù)與服務(wù)有限公司)序列如下：5′-SH-(CH2)6-T T T T T T T T T T T-3′。適配體溶液由pH=7.0的PBS(0.01 mol/L)配制并保存于超低溫冰箱中待用。實驗過程中的用水由Milli-Q IQ7000超純水儀(默克密理博)制備。

1.2 Hg2+光電化學(xué)適配體傳感器的制備

ITO導(dǎo)電玻璃依次用丙酮、乙醇、水分別超聲清洗30 min，晾干后備用。在洗凈的ITO導(dǎo)電玻璃表面滴涂40 μL 2.0 mg/mL的納米TiO2分散液，置于70 ℃烘箱中烘30 min，將其標(biāo)記為TiO2/ITO。再滴涂20 μL Au納米星分散液，室溫避光自然晾干，標(biāo)記為Au/TiO2/ITO。進一步，滴涂20 μL 1.0 μmol/L的巰基修飾適配體溶液，常溫恒濕孵育2 h后，經(jīng)0.01 mol/L PBS淋洗，再滴涂20 μL 0.1 mmol/L MPA，常溫恒濕孵育1 h，封閉電極表面未被核酸適配體覆蓋的空余位點，防止傳感器表面非特異性吸附。最后用0.01 mol/L PBS淋洗，室溫晾干后待用，標(biāo)記為Aptamer/Au/TiO2/ITO。

圖2 (A)納米TiO2的掃描電鏡(SEM)圖；(B)金納米星的透射電鏡(TEM)圖Fig.2 (A) SEM image of TiO2 nanoparticles;(B) TEM image of Au nanostars

2 結(jié)果與討論

2.1 TiO2與Au納米星的表征

采用掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)對納米TiO2和Au納米星的形貌進行表征，結(jié)果如圖2所示。由圖可見，納米TiO2(圖2A)粒子呈分布均勻的短棒狀，平均粒徑約為250 nm。相同放大倍數(shù)的Au納米星(圖2B)呈尖角狀，平均粒徑約為20～50 nm。說明納米TiO2可以提供較大的比表面積并均勻負(fù)載Au納米星。

2.2 實驗條件的優(yōu)化

為提高靈敏度，首先優(yōu)化了實驗條件。考察了不同濃度TiO2分散液(0.2～5.0 mg/mL)對TiO2/ITO修飾電極光電流響應(yīng)的影響。如圖3A所示，當(dāng)分散液濃度小于2.0 mg/mL時，隨著濃度的減小，光電流響應(yīng)由于活性位點減少而減?。划?dāng)分散液濃度等于2.0 mg/mL時，光電流響應(yīng)達到最大；當(dāng)分散液濃度大于2.0 mg/mL時，由于涂覆的TiO2層厚度增大，其本身的半導(dǎo)體性質(zhì)反而阻礙了光生電子的傳遞，導(dǎo)致光電流響應(yīng)逐漸減小。因此TiO2分散液最佳濃度為2.0 mg/mL。進一步考察了Au納米星用量對Au/TiO2/ITO修飾電極光電流響應(yīng)的影響，如圖3B所示。當(dāng)涂覆體積小于20 μL時，界面的光電性能隨著Au納米星負(fù)載量的增加而增強；當(dāng)涂覆體積等于20 μL時，光電流達到最大；當(dāng)涂覆體積大于20 μL時，過量的Au負(fù)載會覆蓋光電活性位點，導(dǎo)致光電流逐漸下降，故Au納米星最適宜的涂覆體積為20 μL。最后，考察了適配體的孵育濃度對Aptamer/Au/TiO2/ITO修飾電極光電性能的影響。如圖3C所示，當(dāng)適配體濃度為1.0 μmol/L時，光電流響應(yīng)最大，隨著適配體濃度逐漸增大，由于適配體本身的負(fù)電性，過量的適配體阻礙了電子的傳遞，光電流響應(yīng)值逐漸減小。

圖3 不同濃度TiO2(a→g：0.2,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mg/mL)分散液(A)、不同體積Au納米星(a→g：5,10,15,20,25,30,35 μL)(B)和不同濃度適配體(a→f：0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 μmol/L)(C)對Aptamer/Au/TiO2/ITO光電流響應(yīng)的影響Fig.3 Effects of TiO2 concentration(a→g:0.2,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mg/mL)(A)，Au volume(a→g:5,10,15,20,25,30,35 μL)(B) and aptamer concentration (a→f:0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 μmol/L)(C) on photocurrent

2.3 不同修飾電極的阻抗測定及分析

實驗對不同修飾的電極在光輻照條件下的交流阻抗進行分析。如圖4所示，ITO基底電極(曲線a)阻抗最大，阻抗值為40.0 Ω；當(dāng)修飾TiO2納米材料(TiO2/ITO，曲線b)后阻抗顯著減小(24.9 Ω)。這是由于半導(dǎo)體材料在光輻照條件下產(chǎn)生光生電子，形成光電流，電阻減??；當(dāng)修飾Au納米星(Au/TiO2/ITO，曲線c)后，阻抗略有減小(22.7 Ω)，具有高導(dǎo)電性的納米Au可以促進電子傳遞；當(dāng)進一步孵育適配體(Aptamer/Au/TiO2/ITO，曲線d)后，阻抗增大(27.1 Ω)，修飾在電極表面帶負(fù)電的適配體阻礙了電子的轉(zhuǎn)移和傳遞。這與I-t曲線的表征結(jié)果是一致的，同時也說明每一步電極修飾的過程都是成功的。

2.4 Hg2+的檢測

當(dāng)傳感界面(Aptamer/Au/TiO2/ITO)未結(jié)合Hg2+時，半導(dǎo)體納米TiO2吸收輻射光能，電子從價帶躍遷至導(dǎo)帶并流向外電路，而價帶的空穴接受界面電子供體的電子，形成光電流。當(dāng)Hg2+與傳感界面的適配體特異性結(jié)合(Hg2+/Aptamer/Au/TiO2/ITO)時，界面結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，導(dǎo)致光生電子傳遞路徑發(fā)生變化，光電流響應(yīng)信號也隨之改變，這種變化趨勢與Hg2+濃度呈一定的函數(shù)關(guān)系。如圖5所示，隨著Hg2+濃度的增大，光電流響應(yīng)信號逐漸減弱[14，15]，適配體富堿基T序列與Hg2+結(jié)合形成折疊的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，光生電子受Hg2+吸電子作用而流向汞，因此Hg2+在一定濃度范圍內(nèi)，光電流響應(yīng)隨著Hg2+濃度的增大而減小。實驗結(jié)果表明，當(dāng)Hg2+濃度在1.0×10-9～5.0×10-7mol/L范圍時，光電流響應(yīng)信號與Hg2+濃度呈較好的線性關(guān)系，線性方程為:I=-0.317logcHg2+-1.276，相關(guān)系數(shù)R2=99.7，檢測限(信噪比S/N=3)為3.1×10-10mol/L。

圖4 不同修飾電極的阻抗圖Fig.4 Electrochemical impedance spectroscopy of different modified electrodesa:ITO,b:TiO2/ITO,c:Au/TiO2/ITO,d:Aptamer/Au/TiO2/ITO) in the presence of 10.0 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4- and 0.1 mol/L KCl with the frequencies swept from 104 to 0.1 Hz.

圖5 不同Hg2+濃度(a→f：5.0×10-7,1.0×10-7,5.0×10-8,1.0×10-8,5.0×10-9,1.0×10-9 mol/L)下光電流響應(yīng)信號(內(nèi)嵌圖為I-logcHg2+的校正曲線)Fig.5 I-t curves of different concentration of Hg2+(a→f：5.0×10-7,1.0×10-7,5.0×10-8,1.0×10-8,5.0×10-9,1.0×10-9 mol/L)(Insert:calibration curve of I-logcHg2+)

2.5 特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性實驗

圖6A為該適配體傳感器的特異性測試結(jié)果。以金屬離子Mn2+、Ni2+、Al3+、Ag+、As3+、Cu2+、Pb2+和Cd2+(濃度均為1.0×10-7mol/L)為干擾離子，考察不同金屬離子與該傳感界面適配體作用后的光電流響應(yīng)。在相同實驗條件下，所選擇的離子對傳感器檢測幾乎沒有影響，而Hg2+則產(chǎn)生顯著的光電流變化，說明該傳感器對Hg2+檢測具有良好的選擇性。圖6B為同一支適配體傳感器連續(xù)檢測10次的穩(wěn)定性測試結(jié)果，其光電流響應(yīng)未發(fā)生明顯的變化，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.01%。圖6C為相同實驗條件制備的7支適配體傳感器重復(fù)性測試，RSD為3.25%，說明其重復(fù)性好。

圖6 不同干擾離子的光電響應(yīng)(A)、穩(wěn)定性能測試(B)和重復(fù)性能測試(C)Fig.6 Photocurrent change of the biosensor with different metal ions(A),stability test (B) and repeatability test(C)

2.6 實際樣品的檢測

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，進一步考察所制備的傳感器在實際環(huán)境樣品檢測中的應(yīng)用。取實驗室自來水水樣，經(jīng)微孔濾膜過濾后按本法測試，結(jié)果如表1所示，回收率范圍為95.0%～108.4%，說明該傳感器的檢測結(jié)果令人滿意。

表1 標(biāo)準(zhǔn)加入法測定水樣品中的Hg2+濃度Table 1 Recovery measurements of Hg2+ in water sample

3 結(jié)論

本文報道了一種基于納米TiO2和Au納米星的光電化學(xué)適配體傳感器特異性檢測Hg2+的方法。該方法以ITO導(dǎo)電玻璃為基底電極，以納米TiO2為光電活性物質(zhì)，以Au納米星作為巰基修飾適配體共價結(jié)合的活性位點，通過Au-S共價鍵有效固定適配體，通過Hg2+與適配體的特異性結(jié)合來實現(xiàn)Hg2+定量檢測的目的，方法的檢測限為3.1×10-10mol/L。該傳感器制備方法簡單，且具有較強的特異性、良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，為Hg2+檢測提供了一種經(jīng)濟省時的方法，并為環(huán)境安全和食品安全的目標(biāo)物檢測應(yīng)用提供了有力的實驗基礎(chǔ)。