李 瑋* 艾連峰 馬育松 陳瑞春 郭春海

(石家莊海關(guān)技術(shù)中心河北石家莊 050051)

禁用著色劑一般為工業(yè)染料，主要用于紡織品、皮革制品及木制品的染色，但由于其廉價、著色強及穩(wěn)定性強等特點，常被非法添加至食品中，長期食用含有這類物質(zhì)的食品會對人們身體產(chǎn)生巨大的傷害，如致癌、致畸等。因此，我國已禁止此類染料以任何目的或含量在食品中出現(xiàn)。我國衛(wèi)生部發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單》，明確禁止工業(yè)染料，如蘇丹紅、堿性橙Ⅱ、羅丹明B、堿性嫩黃、孔雀石綠等染料在食品中使用。面對如此多的非法濫用著色劑，由于沒有快速、高通量的多種禁用著色劑篩查方法，導(dǎo)致了我國食品存在安全隱患。關(guān)于辣椒中多種禁用著色劑分析檢測的主要方法有：高效液相色譜法[1-3]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4-8]和高分辨質(zhì)譜法[9-12]。

本實驗采用乙腈和正己烷提取辣椒中的23種禁用著色劑，以QuEChERS法凈化，利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF MS)進(jìn)行測定，以保留時間、一級離子質(zhì)量準(zhǔn)確度、一級離子同位素分布、二級碎片與庫匹配4種手段確保準(zhǔn)確定性分析，以TOF-MS提取離子的峰面積定量，可同時定性定量分析多種禁用著色劑，對于提高食品安全有著重要意義。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

TripleTOF?5600+高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀(美國，AB SCIEX)；VORTEX-2 GENE渦旋混合器(美國，Scientific)；Turbo Vap氮氣吹干儀(美國，Zymark)。

23種著色劑標(biāo)準(zhǔn)品(純度均≥95%，相關(guān)信息見表1)。單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：準(zhǔn)確稱取各著色劑標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇或乙酸乙酯稀釋成200 μg/mL的單標(biāo)儲備液，使用時根據(jù)需要用甲醇稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。乙腈、甲醇(色譜純，F(xiàn)luka)；甲酸、NH4Ac(色譜純，Dikma)。實驗用水均為Milli-Q(美國Millipore)高純水。

1.2 儀器條件

色譜條件:Agilent Broshell 120 EC-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，2.7 μm)；流動相A：5 mmol/L NH4Ac-0.1%甲酸溶液+甲醇(9+1,V/V)，流動相B：0.1%甲酸甲醇。梯度洗脫程序：0～1 min，B保持5%，1～5 min，B從5%升到30%；5～9 min，B從30%升到90%；9～25 min，B保持90%；25～25.1 min，B從90%降到5%；25.1～27 min，B保持5%。流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件:ESI和APCI復(fù)合離子源；電噴霧電離，正離子模式；電噴電壓：5 500 V；離子源(gas 1)：345 kPa；離子源(gas 2)：345 kPa；氣簾氣：207 kPa；離子源溫度：550 ℃。TOF-MS參數(shù)：去簇電壓(DP)：80 V；碰撞能量(CE)：10 eV；TOF質(zhì)量數(shù)掃描范圍：100～1 000 Da。TOF-MS/MS參數(shù)：去簇電壓(DP)：80 V；碰撞能量(CE)：35 eV；碰撞能量動態(tài)變量：15 eV；TOF質(zhì)量數(shù)掃描范圍：80～800 Da；高靈敏模式；信號閾值：100 cps；IDA實驗每循環(huán)采集6次數(shù)據(jù)，動態(tài)背景減法扣除。校正方式：APCI源連接ABsciex公司自動校正系統(tǒng)(CDS)，每10個樣品自動校正1次；APCI校正液流速：0.3 mL/min。

表1 23種禁用著色劑的分子母離子測定值、理論值和保留時間Table 1 Accurate mass measurements of molecular ions and retention times of 23prohibited dyes

1.3 提取與凈化

稱取粉碎均勻的樣品2.00 g，置于50 mL具塞聚四氟乙烯離心管中，加入2 mL水分散混勻，再準(zhǔn)確加入10 mL乙腈和1 g NaCl，渦旋混合1 min，振蕩5 min，超聲10 min，以10 000 r/min高速離心5 min后，分出上清液，重復(fù)提取一次，合并提取液，45 ℃水浴旋蒸至近干，用1.5 mL乙腈溶解，待定容。向殘渣中加入10 mL正己烷，渦旋混合1 min，振蕩5 min，超聲20 min，10 000 r/min高速離心5 min后，取出上清液，重復(fù)提取一次，合并提取液，45 ℃水浴旋蒸至近干，用1.5 mL乙腈溶解，待定容。將2份乙腈溶解液合并，用乙腈定容至4 mL，加入500 mg無水MgSO4和100 mg C18固相分散劑，渦旋振蕩2 min，高速離心5 min，取2 mL上清液于45 ℃水浴下氮吹至干，用1 mL甲醇-水(9+1)溶解殘渣，經(jīng)0.22 μm聚四氟乙烯過濾器過濾后，供HPLC-Q-TOF-MS測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取條件的選擇

23種禁用著色劑的化學(xué)性質(zhì)差異較大，因此前處理方法的關(guān)鍵是選擇提取效率好的提取溶劑，減少目標(biāo)化合物在樣品前處理過程中的損失，同時便于后續(xù)凈化。實驗考察了水、無水乙醇、甲醇、乙腈、正己烷等不同提取溶劑對目標(biāo)物回收率的影響。結(jié)果表明，乙腈對于極性較強的目標(biāo)化合物具有很好的提取效率，正己烷則對弱極性的蘇丹紅類化合物具有更好的提取效率。因此，實驗采用兩種不同極性溶劑共同提取的方法，即樣品先經(jīng)乙腈提取，再由正己烷進(jìn)行二次提取。

由于目標(biāo)物大多為工業(yè)染料，很容易吸附到樣品上，很難被提取出來。因此，分別對提取次數(shù)、超聲時間進(jìn)行了比較。對加標(biāo)樣品分別提取1次、提取2次、提取3次和提取4次的結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)提取2次時的回收率較高，提取3～4次時回收率并沒有明顯提高。分別對10 min、20 min、30 min、40 min的超聲進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)超聲20 min時目標(biāo)物的回收率較高。

2.2 凈化方式的選擇

根據(jù)目標(biāo)物的性質(zhì)不同，文獻(xiàn)中使用較多的凈化手段為凝膠滲透色譜、中性氧化鋁和WAX柱、C18柱、HLB柱等固相萃取柱。本實驗考察了PSA、C18、石墨化炭黑(GCB)、Alumina-N的單種使用對目標(biāo)物回收率的影響。結(jié)果表明4種吸附劑對于目標(biāo)物的回收率有明顯區(qū)別。當(dāng)加入GCB，凈化液顏色變淺，但目標(biāo)物的回收率有所下降，平均回收率在10%，可能是GCB去除色素的效果明顯，在去除天然色素的同時也吸附了部分目標(biāo)物；Alumina-N對目標(biāo)物吸附較強，只有丙酮能洗脫部分目標(biāo)物，而且羅丹明B、堿性嫩黃、分散橙等回收率小于30%；PSA則對酸性染料有不同程度的吸附。然后對C18吸附劑的使用量進(jìn)行考察，分別測定添加50 mg、100 mg、200 mg、500 mg、800 mg時的凈化效果，隨著C18使用量的增加，部分目標(biāo)物的回收率有所下降，可能是較多的C18對目標(biāo)物有一定的吸附。結(jié)果表明100 mg的使用量可以部分降低雜質(zhì)干擾又不會影響各目標(biāo)物的回收率。本實驗選擇C18吸附劑，其用量為100 mg。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)主要是由于基質(zhì)中的共提取成分在質(zhì)譜離子源中與目標(biāo)化合物相互作用，從而使化合物在儀器上的響應(yīng)發(fā)生增強或抑制，影響化合物的定量分析。本實驗選取蘇丹紅Ⅰ、孔雀石綠、堿性嫩黃O、蘇丹紅B、酸性橙Ⅱ，通過配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和基質(zhì)匹配校正曲線，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖，以基質(zhì)匹配校正曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值來考察化合物的基質(zhì)效應(yīng)。一般認(rèn)為，基質(zhì)匹配校正曲線斜率與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值在85%～115%之間不存在基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，對于所選辣椒樣品，基質(zhì)匹配校正曲線斜率為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的56%～81%，存在明顯的基質(zhì)抑制作用。因此，為了能較好地減小基質(zhì)效應(yīng)的影響，本實驗采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正。

2.4 液相色譜條件的優(yōu)化

圖1 23種禁用著色劑提取離子流(EIC)色譜圖Fig.1 Extracted ion current chromatogram of 23 kinds target compounds

實驗比較了乙腈、甲醇兩種有機溶劑的分離效果，發(fā)現(xiàn)甲醇的分離效果較乙腈好，故選擇甲醇作為有機相。實驗分別在流動相中添加不同濃度的NH4Ac，觀察其濃度對目標(biāo)物的質(zhì)譜信號影響。實驗發(fā)現(xiàn)，NH4Ac濃度越高，大部分待測物的質(zhì)譜響應(yīng)信號越低。綜合考慮，實驗采用5 mmol/L NH4Ac溶液作為流動相。同時，在甲醇中加入0.1%甲酸，有利于目標(biāo)化合物的離子化。固定流動相A為5 mmol/L NH4Ac，比較了流動相B為甲醇時添加不同濃度的甲酸(0%、0.1%、0.2%)對色譜峰的影響。結(jié)果顯示，在其它已優(yōu)化色譜條件下，選擇含0.1%甲酸甲醇較為合適。優(yōu)化條件下23種禁用著色劑標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。

2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

禁用著色劑中很多物質(zhì)是鈉鹽或氯鹽，對于含有Na+、Cl-的物質(zhì)，由于它們在含水的流動相中容易電離，因此本研究利用儀器特有的信息相關(guān)采集(IDA)工作模式，建立TOF-MS-IDA-MS/MS工作流程，進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)采集，同時獲得高分辨一級質(zhì)譜圖和高分辨二級質(zhì)譜圖。

2.6 高分辨二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的建立

數(shù)據(jù)庫收錄了本實驗涉及的23種化合物的分子式、相對分子質(zhì)量、CAS編號、化學(xué)名及結(jié)構(gòu)圖等信息。對化合物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，每一種化合物在四個不同碰撞能量條件下得到4張二級質(zhì)譜圖。把著色劑的名稱、分子式、精確質(zhì)量數(shù)和4張不同碰撞能量的二級質(zhì)譜圖結(jié)合起來得到該化合物的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。

2.7 方法學(xué)驗證

2.7.1 線性范圍和定量限在空白樣品提取液中分別添加一定量的待測物，使用上述儀器條件測定后，以質(zhì)量濃度對峰面積作圖，得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于每個化合物的檢測靈敏度存在差異，因此對線性濃度點的選擇不同，23種禁用著色劑在10～500 ng/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.9411～0.9989，其定量限在10～100 μg/kg之間。

2.7.2 回收率與精密度實驗選取空白辣椒樣品，進(jìn)行3個添加水平的加標(biāo)回收實驗，每個添加水平平行實驗8次，回收率范圍為61.82%～103.25%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.08%～10.56%，結(jié)果見表2。

表2 辣椒中禁用著色劑線性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率和精密度(n=8)Table 2 Linear equations，correlation coefficients(r)，recoveries and precisions(RSD) of prohibited dyes in chilli(n=8)

(續(xù)表2)

CompoundLinearequationsrAdded(μg/kg)Average(μg/kg)Recovery(%)RSD(%)Dispersered1Y=17088.6+18290.1X0.969720.0016.6383.137.1350.0044.1388.266.34200.00172.5186.254.52Disperseorange3Y=26526.9+5299.67X0.988420.0016.3781.866.5950.0044.5789.133.87200.00174.8987.443.92SudanorangeGY=27.8325+5.7172X0.972410.009.1091.035.7850.0043.2586.502.90100.0088.4188.415.78DimethylyellowY=37.2800+9.4268X0.958410.008.4984.866.2350.0047.2194.439.03100.0086.5386.537.10PararedY=11.1017+330.6706X0.978720.0019.0195.073.3050.0046.2792.553.93200.00191.7995.905.60Citrusred2Y=2486.556+1332.3416X0.968510.008.9589.542.7550.0048.8797.748.24100.0086.9086.905.70SudanredGY=1179.3877+540.1667X0.941110.009.8498.392.4250.0050.20100.405.46100.0095.4795.472.41SudanⅠY=2925.87+1968.21X0.999410.0010.00100.043.5350.0049.1698.329.65100.0096.4296.422.08SudanⅡY=6751.66+7151.217X0.998110.009.7697.605.6250.0049.2898.556.26100.0092.1292.127.44SudanⅢY=354.493+575.536X0.988510.009.8098.033.0150.0048.0096.006.83100.0099.1499.143.77SudanⅣY=108.216+571.656X0.947620.0017.7188.563.3250.0043.1186.225.11200.00179.4889.742.31SudanredBY=256.156+592.162X0.993620.0018.4292.083.6350.0051.63103.255.26200.00194.9997.504.31Sudanred7BY=737.828+432.984X0.947510.008.8188.133.4250.0045.1490.284.42100.0090.6590.652.38

3 結(jié)論

本方法采用改進(jìn)的前處理方法提取辣椒中的23種禁用著色劑，利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜進(jìn)行測定，獲得了滿意的回收率，良好的線性關(guān)系和精密度。該方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確和高通量等優(yōu)點，可用于實際工作中日常檢測。